人角膜上皮片的制造法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种移植用人角膜上皮片，详细地，涉及一种人角膜上皮片的制造法， 其使用了将人角膜上皮细胞培养而得到的来自人角膜上皮的细胞。
【背景技术】
[0002] 角膜是透明组织，其从外侧向内侧由角膜上皮、前弹力层、角膜基质层、后弹力层、 角膜内皮5层细胞层构成，其没有血管但有神经分布。角膜上皮是厚度约50μm的非角化 复层扁平上皮，其构成眼表面的一部分，并且限制物质的透过，而且作为防止细菌、真菌等 向角膜内部侵入的屏障起作用。对于角膜上皮的屏障功能的维持，在最表层的细胞间存在 的紧密连接起着重要的作用。
[0003]角膜上皮有再生能力，即使上皮受伤，也能从角膜上皮干细胞供给用于修复损伤 的角膜上皮细胞，进一步细胞间的紧密连接也再生，从而恢复并维持屏障功能。
[0004] 对于角膜上皮的屏障功能受到不可逆地损害的角膜疾病，角膜移植作为有效的治 方疗法正在普及。角膜移植主要分为移植角膜全层的全层角膜移植和移植角膜组织的一部 分的角膜移植。由于全层角膜移植存在因角膜全层切开而引起的眼球的脆弱性等问题，因 此近年来，正在普及移植角膜组织的一部分的方法。作为这种移植角膜组织的一部分的方 法，有同时移植角膜基质的一部分和角膜上皮的表层角膜移植、及仅移植及角膜上皮的角 膜上皮移植，这些方法以复发性角膜营养不良患者等为对象，已在临床情况中确立。
[0005] 在角膜缘组织的基底部存在具有分化为角膜上皮细胞的能力的角膜上皮干细胞。 因此，若角膜缘组织受到损害，则不能供给用于修复角膜上皮细胞的角膜上皮干细胞。此 外，在角膜上皮大范围地受到损害的情况下，直到从角膜上皮干细胞供给用于修复损伤的 必要量的角膜上皮细胞为止，需要花费时间。另外在作为角膜上皮细胞的细胞外基质的前 弹力膜受到损害的情况下，角膜上皮细胞发生粘着不良，从而不能够给角膜上皮供给足够 的细胞。这样，角膜上皮在数周以上的期间内未修复，若其屏障功能受损的状态继续，则眼 表面容易被细菌感染。一旦在眼表面发生感染，则结膜上皮随着血管新生会覆盖眼表面，此 外，由于免疫细胞的游走，会产生炎症。另外，还有细菌分泌的酶导致角膜组织破坏，从而达 到失明的情况。这样，因角膜上皮干细胞的供给的不能或降低而产生的疾病称为角膜上皮 干细胞缺陷症。对于因角膜上皮干细胞缺陷症而产生炎症的角膜，角膜上皮移植因排斥反 应而成活率低。
[0006] 此外，角膜上皮移植还存在无法获得满足需要的移植用角膜上皮的捐赠者不足的 问题。对于该捐赠者不足，考虑在体外培养角膜上皮细胞，制作细胞片，然后将该片移植到 角膜上皮的损伤部位的方法。在这种将人角膜上皮片移植到损伤部位的情况下，移植部位 的炎症也成为问题。因此，作为抑制炎症并移植人角膜上皮片的方法，正在尝试使人角膜上 皮片在羊膜上形成，从而制作具有羊膜层的人角膜上皮片，然后将其移植的方法。
[0007] 作为使细胞片在羊膜上形成的方法，报告了在人基质羊膜（剥离除去了羊膜上皮 细胞的羊膜）上接种健康正常的白色家兔的角膜上皮缘片，与支持细胞（NIH-3T3细胞）一 起培养的方法（非专利文献1)。确认这里所得的人角膜上皮片在形态学上也具有与生物角 膜上皮类似的层结构。显示进行用健康正常的人角膜上皮缘片通过同样的方法制作人角膜 上皮片，然后将其移植给难治性眼表面疾病患者的临床试验，通过该方法得到的人角膜上 皮片的移植作为眼功能恢复手段是有效的（非专利文献2、非专利文献3)。
[0008] 此外，作为使细胞片在羊膜上形成的方法，报告了将健康正常的白色家兔或人的 角膜上皮缘片进行酶处理并使角膜上皮细胞悬浊，将其接种到人基质羊膜（剥离除去了羊 膜上皮细胞的羊膜）上，与支持细胞（NIH-3T3细胞）一起培养的方法（专利文献1，非专 利文献4)。确认这里所得的人角膜上皮片在形态学上也具有与生物角膜上皮类似的层结 构。此外，确认在人角膜上皮片的培养过程中，通过将培养细胞的表面暴露于气相并进行培 养（air-lifting)，诱导紧密连接关联蛋白质的表达。
[0009] 现有技术文献：
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献1 :W02004/078225
[0012] 非专利文献
[0013] 非专利文献1 :KoizumiN.et al.，Cornea，19,65-71 (2000)
[0014] 非专利文献2 :KoizumiN.et al.，Archives of Ophthalmology，119， 298-300(2001)
[0015] 非专利文献 3:KoizumiN.et al·，The American Academy of Ophthalmology， 108,1569-74(2001)
[0016] 非专利文献4 :KoizumiN.et al·，Invest Ophthalmol Vis Sci，43， 2114-21(2002)
【发明内容】
[0017] 发明要解决的课题
[0018] 在上述背景下，本发明的目的在于，提供一种高效地制造品质稳定的人角膜上皮 片的方法。
[0019] 解决课题的方法
[0020] 在针对上述目的的研究中，本发明者发现，可用人间充质干细胞作为支持细胞，在 将ROCK抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、MAP激酶抑制剂及TGF- β受体抑制剂进行各种组合而 添加的培养基中培养来自人角膜上皮细胞的细胞，进一步地，通过将在该培养中所得的人 角膜上皮细胞在人羊膜上培养，能够高效地制造人角膜上皮细胞片，从而完成本发明。即， 本发明提供以下方案。
[0021] (1) -种制造方法，其是来自人角膜上皮细胞的细胞的制造方法，
[0022] 其包括：在由具有细胞不能通过的微细孔的膜隔成第1室和第2室的培养容器的 该第1室中加入支持细胞，在该第2室中加入人角膜上皮细胞，用含有ROCK抑制剂及磷酸 二酯酶抑制剂的第1培养基培养该人角膜上皮细胞，接着，用含有磷酸二酯酶抑制剂、MAP 激酶抑制剂及TGF-β受体抑制剂的第2培养基培养该人角膜上皮细胞。
[0023] (2)上述（1)记载的制造方法，其中，该培养容器由具有该微细孔的膜隔成上下2 室，即上侧室和下侧室。
[0024] (3)上述（2)记载的制造方法，其中，该下侧室为该第1室，该上侧室为该第2室， 并且在具有该微细孔的膜上培养该人角膜上皮细胞。
[0025] (4)上述（3)记载的制造方法，其中，使人角膜上皮细胞在具有该细胞不能通过的 微细孔并且在该培养容器内被支持的膜上，不与该支持细胞直接接触而进行培养。
[0026] (5)上述（1)-⑷中任一项记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该 ROCK抑制剂为Y27632,在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异 丁基-1 -甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为选自SB203580、或者 SB239063、或其组合的物质，在该第2培养基中含有的TGF-β受体抑制剂为选自SB431542、 LY364947、或者A83-01、或其组合的物质。
[0027] (6)上述（1)-⑷中任一项记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的该 ROCK抑制剂为Y27632,在该第1及该第2培养基中含有的该磷酸二酯酶抑制剂为3-异丁 基-1-甲基黄嘌呤，在该第2培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580,在该第2培养基 中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
[0028] (7)上述（6)记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Y27632的浓度为 1-20μM，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为50-150μM， 在该第2培养基中含有的SB203580的浓度为0. 2-2μΜ，SB431542的浓度为0. 2-2μΜ。
[0029] (8)上述（6)记载的制造方法，其中，在该第1培养基中含有的Υ27632的浓度为约 10μΜ，在该第1及该第2培养基中含有的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的浓度为约100μΜ，在 该第2培养基中含有的SB203580的浓度为约1μΜ，SB431542的浓度为约1μΜ。
[0030] (9)上述（1)-⑶中任一项记载的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干细 胞。
[0031] (10) -种制造方法，其包括使通过上述（1)-(9)中任一项记载的制造方法得到的 细胞悬浊于细胞冷冻液中并冷冻，成为冷冻细胞的步骤。
[0032] (11) -种细胞，其来自通过上述（1)-(10)中任一项记载的制造方法得到的人角 膜上皮细胞。
[0033] (12) -种细胞，其来自通过上述（10)记载的制造方法得到的冷冻后的人角膜上 皮细胞。
[0034] (13) -种制造方法，其是人角膜上皮片的制造方法，
[0035] 其包括：对于上述（11)记载的来自人角膜上皮细胞的细胞，在其解冻后，将上述 (11)或（12)记载的来自人角膜上皮细胞的细胞，在含有支持细胞的培养容器中，在置于具 有该支持细胞不能通过的微细孔并且在该培养容器内被支持的膜上的基质羊膜上，使用含 有ROCK抑制剂的第3培养基进行培养，接着，使用含有MAP激酶抑制剂及TGF-β受体抑制 剂的第4培养基进行培养，在该基质羊膜上形成由来自该人角膜上皮细胞的细胞构成的细 胞层的步骤；以及接着，在该细胞层的表面的全部或一部分没有被培养基覆盖的状态下，使 用该第4培养基进行培养的步骤。
[0036] (14)上述（13)记载的制造方法，其中，该基质羊膜以剥离了羊膜上皮的一侧朝上 的方式放置在该培养容器中。
[0037] (15)上述（13)或（14)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的该ROCK 抑制剂为Y27632,在该第4培养基中含有的MAP激酶抑制剂为SB203580,在该第4培养基 中含有的TGF-β受体抑制剂为SB431542。
[0038] (16)上述（15)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Y27632的浓度 为1-20μM，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为0. 2-2μM，在该第4培养基中含 有的SB431542的浓度为0. 2-2μΜ。
[0039] (17)上述（15)记载的制造方法，其中，在该第3培养基中含有的Υ27632的浓度 为约ΙΟμΜ，在该第4培养基中含有的SB203580的浓度为约ΙμΜ，SB431542的浓度为约 1μΜ，。
[0040] (18)上述（13)-(17)中任一项记载的制造方法，其中，该支持细胞为人间充质干 细胞。
[0041] (19) 一种人角膜上皮片，其通过上述（13)-(18)中任一项记载的制造方法得到， 并包括该基质羊膜和该来自人角膜上皮细胞的细胞。
[0042] (20)上述（19)记载的人角膜上皮片，其中，剥离了该基质羊膜的羊膜上皮的一侧 的面积的95%以上由通过该来自人角膜上皮细胞的细胞形成的细胞层覆盖。
[0043] (21)上述（20)记载的人角膜上皮片，其中，该细胞层的90%以上具有由二层以上 细胞层构成的复层结构。
[0044] (22)上述（19)-(21)记载的任意一种人角膜上皮片，其中，该来自人角膜上皮细 胞的细胞的98%以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，并且80%以上为细胞角蛋白12阳性。
[0045] (23)上述（19)-(21)记载的任意一种人角膜上皮片，其中，该来自人角膜上皮细 胞的细胞的99%以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，85%以上为细胞角蛋白12阳性。
[0046] (24)上述（19)-(23)记载的人角膜上皮片，其用于角膜疾病的治疗。
[0047] (25)上述（24)记载的人角膜上皮片，其中，该角膜疾病为角膜上皮的屏障功能受 到不可逆地损害的疾病。
[0048] (26)上述（24)记载的人角膜上皮片，其中，该角膜疾病选自角膜营养不良、 Stevens-Johnson综合征、化学外伤及角膜上皮干细胞缺陷症。
[0049] (27) -种人角膜上皮片，其中，基质羊膜表面的99. 5%以上由通过来自膜上皮 细胞的细胞形成的细胞层覆盖，该细胞的98%以上为细胞角蛋白AE1/AE3阳性，该细胞的 80%以上为细胞角蛋白12阳性，该细胞层的95%以上具有由四层以上的细胞层构成的复 层结构，该细胞层表面的90%以上由扁平的细胞覆盖，该细胞层内的纤维母细胞的比率不 足 0. 1 %。
[0050] 发明的效果
[0051] 根据本发明，因为能够稳定地供给可给复发性角膜营养不良等角膜疾病的患者移 植的、品质稳定的人角膜上皮片，所以可以解决角膜上皮移植的捐赠者不足。
【附图说明】
[0052] 图1是示出HE染色后的人角膜上皮片的表面的放大图（观察倍率100倍）。
[0053] 图2是示出HE染色后的人角膜上皮片的截面的放大图（观察倍率200倍）。A 表示表层的扁平的细胞，B表示