一种脱细胞角膜缘保护液及脱细胞角膜缘的制备方法与流程

本发明涉及生物工程医疗材料领域，尤其涉及一种脱细胞角膜缘基质。

背景技术：

角膜缘是角膜和巩膜的移行区，是角膜缘干细胞(1imbal stem cells，LSCs)的所在之处，对角膜透明性的维持和正常生理功能的发挥具有重要的作用。严重的眼表疾病可损伤角膜缘区，导致LSCc的缺失及屏障结构的破坏，从而引起一系列的眼表反应，甚至导致失明。例如当眼部遭受严重化学伤、热烧伤等损伤后，角膜缘被广泛破坏，部分或全部角膜缘干细胞缺乏，导致角膜上皮修复困难，结膜上皮向角膜生长，新生血管长入、角膜结膜化和基质瘢痕化，最终导致失明。

目前，同体和同种异体LSCs移植受限于匮乏的供体来源无法满足临床治疗的需要，所以胚胎干细胞联合组织工程负载材料制备植片进行移植是目前治疗角膜缘干细胞缺乏的重要方法。角膜缘区独特的三维组织结构及基底膜成分是LSCs赖以生存及干细胞特性维持的重要基础之一。人类角膜缘基质是构建组织工程LSCs植片的最佳支架材料，但同样受到供体来源匮乏的限制。目前，猪的多种脱细胞组织材料已成功应用于组织工程器官再造领域的研究。随着生物组织工程学的广泛和深入研究，脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但鲜有脱细胞角膜缘基质的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脱细胞角膜缘保护液，能够避免物理、化学和生物学等处理对角膜缘三维组织结构及基底膜的破坏。

本发明的另外一个目的是提供一种脱细胞角膜缘的制备方法，该方法能保持角膜缘纤维层结构的完整，使脱细胞后的角膜缘保持其特有的纤维结构排列和生物特性，能够作为一种应用前景很好的生物工程材料。

具体的技术方案如下：

一种脱细胞角膜缘保护液，其成分为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的成分为含有7～10g/L透明质酸、10～15g/L硫酸软骨素、5～8g/L低分子右旋糖酐和3～4mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的pH值为7.2～7.4。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的渗透压为300～400mOsm。

本发明还包括采用上述脱细胞角膜缘保护液制备脱细胞角膜缘的方法，包括以下步骤：

(1)将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质密封于所述脱细胞角膜缘保护液中，采用高静压处理破碎细胞；

(2)将细胞破碎后的角膜缘置于添加了去垢剂和核酸酶的所述脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理；

(3)将所述脱细胞后的角膜缘置于所述脱细胞角膜缘保护液中漂洗。

其中，所述高静压处理破碎细胞的条件为：压力为100～600MPa，高静压频率为2～5次，每次为1～2分钟，总时间不超过10分钟。

在上述制备方法中，所述去垢剂包括Triton、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或多种。优选所述去垢剂在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为0.2～0.5％。

在本发明中，所述核酸酶包括DNA酶和/或RNA酶。所述核酸酶在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度优选为100～2000U/ml。

本发明中，脱细胞处理的条件为：摇床转速100～150转/分钟，温度20～30℃，时间2～4小时。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、本发明在脱细胞角膜缘基质制备过程中，全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，避免了物理、化学和生物学等处理对角膜缘三维组织结构及基底膜的破坏，使脱细胞后的角膜缘仍然能够保持其结构和力学特性。

2、本发明方法所用的角膜缘材料来源于猪眼球，来源广泛，成本低；制作流程简单、时间短易于实施。采用本发明的方法所获取的脱细胞角膜缘，脱细胞彻底，最小的减少了对角膜缘结构的破坏，生物相容性好，有利于自体细胞增殖爬行。

3、本发明提供的脱细胞角膜缘的制备方法，同时也有利于优化动物眼球其他结构的脱细胞条件，如角膜、结膜等。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明。

图1：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质未脱细胞的冰冻切片DAPI染色图；

图2：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质脱细胞后的冰冻切片DAPI染色图；

图3：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质未脱细胞的冰冻切片苏木素染色图；

图4：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质脱细胞后的冰冻切片苏木素染色图；

图5：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质未脱细胞的石蜡切片HE染色图；

图6：含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质脱细胞后的石蜡切片HE染色图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明脱细胞角膜缘的制备方法，为将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质全程在脱细胞角膜缘保护液中进行。本发明的脱细胞角膜缘保护液成分为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液，优选为含有7～10g/L透明质酸、10～15g/L硫酸软骨素、5～8g/L低分子右旋糖酐和3～4mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。

首先将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质密封于所述脱细胞角膜缘保护液中，采用高静压处理破碎细胞。高静压处理破碎细胞的条件为100～600MPa，优选为200～500MPa，进一步优选为200～400MPa；高静压频率为2～5次，优选为2～4次，每次为1～2分钟，总时间不超过10分钟。

将细胞破碎后的角膜缘取出，置于添加了去垢剂和核酸酶的所述脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理。

其中去垢剂可以采用本领域的常规去垢剂。优选包括Triton、十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠中的一种或多种。去垢剂在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为0.2～0.5％，优选为0.3～0.4％。核酸酶包括DNA酶、RNA酶及其他核酸酶及组合。在本发明实施例中优选为DNase I。核酸酶在所述脱细胞角膜缘保护液中的浓度为100～2000U/ml，优选为500～1500U/ml。

脱细胞处理优选在摇床中进行。震荡脱细胞处理的条件为：摇床转速100～150转/分钟，优选为120～140转/分钟；温度为20～30℃，优选为24～27℃；震荡时间为2～4小时，进一步为3h。

将脱细胞后的角膜缘置于脱细胞角膜缘保护液中漂洗，去除脱细胞用试剂和细胞碎片，完成制备。漂洗时间至少为2h，优选为3h以上，进一步为5h以上。

实施例1：

切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质(含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm)。

全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加8g/L透明质酸，8g/L硫酸软骨素，5g/L低分子右旋糖苷，2.5mg/L妥布霉素，调整pH值为7.3，渗透压为320mOsm；

将切取的含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，密封在盛有保护液的塑料袋中；于200Mpa高静压条件下，处理2次，每次时间为2分钟；将角膜缘取出后，置于含0.3％十二烷基硫酸钠+200U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为100转/分钟，温度为20℃，消化4小时去除角膜中的DNA成分；将角膜缘取出后，置于保护液中漂洗3小时。

实施例2：

切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质(含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm)。

全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加5g/L透明质酸、17g/L硫酸软骨素、10g/L低分子右旋糖苷，3mg/L妥布霉素，调整pH值为7.4，渗透压为380mOsm；

将切取的含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，密封在盛有保护液的塑料袋中；于400Mpa高静压条件下，处理5次，每次时间为1分钟；将角膜缘取出后，置于含0.5％十二烷基硫酸钠+2000U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为120转/分钟，温度为30℃，消化2小时去除角膜中的DNA成分；将角膜缘取出后，置于保护液中漂洗5小时。

实施例3：

切取含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质(含lmm巩膜，2mm外周角膜，厚约0.2mm)。

全程使用保护液对角膜缘组织进行保护，保护液成分为：PBS缓冲液中添加12g/L透明质酸，15g/L硫酸软骨素，6g/L低分子右旋糖苷，4mg/L妥布霉素，调整pH值为7.2，渗透压为350mOsm；

将切取的含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质，密封在盛有保护液的塑料袋中；于600Mpa高静压条件下，处理3次，每次时间为1分钟；将角膜缘取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，设定摇床速度为150转/分钟，温度为25℃，消化3小时去除角膜中的DNA成分；将角膜缘取出后，置于保护液中漂洗4小时。

图1～6为含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质未脱细胞的染色图，与按照本发明方法制作出的含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质脱细胞的染色图。从附图中可以看出，未脱细胞组均可见有大量细胞核着色，脱细胞组未见细胞核残存，且角膜缘纤维结构无明显破坏。说明采用本发明的方法所获取的脱细胞角膜缘，脱细胞彻底，能够最小的减少对角膜缘结构的破坏，生物相容性好。

上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。