一种脱细胞角膜基质及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种脱细胞角膜基质及其制备方法，所述脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤：A、将摘取的动物角膜放入水中，振荡处理，以使上皮层脱落；B、将水更换为脱细胞试剂，振荡处理，期间，所述脱细胞试剂和水交替使用，以使基质细胞和内皮细胞脱落；C、加入脱水剂，静置或振荡处理，得到脱细胞角膜；D、将所述脱细胞角膜进行削切，得到脱细胞角膜基质，所述脱细胞角膜基质只含有前弹力层和基质层；其中，所述脱细胞试剂含有NaCl和EDTA，所述脱水剂含有甘油。本发明提供的脱细胞角膜基质的制备方法，能有效的去除容易引起免疫反应的角膜细胞成分和可溶性蛋白，得到完好的只含有前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质。
【专利说明】一种脱细胞角膜基质及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种脱细胞角膜基质及其制备方法。
【背景技术】
[0002]角膜病是全球范围内第二致盲眼病，并且以每年150~200万病例的速度递增。角膜移植是目前治疗角膜盲唯一有效的方法，但供体角膜来源的极端匮乏制约着角膜移植的开展。角膜基质如动物等动物的角膜基质具有与人角膜基质类似的组织结构、生物物理特性和光学特性，但异种移植后强烈的排斥反应阻碍了异种角膜在临床上的应用。近年来的研究发现，角膜基质内的基质细胞是引起基质型排斥反应的主要抗原，而作为角膜基质架构的胶原纤维在种系间高度保守，抗原性很低，无细胞的异种角膜移植后不产生排斥反应。因此，将动物的基质细胞完全脱去，使之成为无细胞的角膜基质可能是人角膜基质的理想替代物。
[0003]但现有技术生产的无细胞角膜基质在脱细胞过程中，采用的是胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)等溶液以及Triton-XlOO (聚乙二醇辛基苯基醚)、脱氧胆酸钠、SDS (十二烷基磺酸钠)等表面活性剂，此类方法虽然能去除细胞成分，但反应剧烈，对角膜基质破坏严重，不能达到良好的生物相容性。此外，现有技术生产的脱细胞角膜基质为全层角膜，临床使用前需根据创面大小以及深度进行处理后才能使用，在操作过程中材料被污染的几率增大，基质层容易被破坏，且处理后的角膜基质层表面不平整，不利于创面愈合。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于提供一种脱细胞角膜基质的制备方法，旨在快速而温和地去除角膜中免疫原细胞成分和可溶性蛋白，从而得到只含有前弹力层和基质层的脱细胞角月吴基质。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供一种脱细胞角膜基质的制备方法，包括以下步骤:
[0006]A、将摘取的动物角膜放入水中，振荡处理，以使上皮层脱落；
[0007]B、将水更换为脱细胞试剂，振荡处理，期间，所述脱细胞试剂和水交替使用，以使基质细胞和内皮细胞脱落；
[0008]C、加入脱水剂，静置或振荡处理，得到脱细胞角膜；
[0009]D、将所述脱细胞角膜进行削切，得到脱细胞角膜基质，所述脱细胞角膜基质只含有iu弹力层和基质层；
[0010]其中，所述脱细胞试剂含有NaCl和EDTA，所述脱水剂含有甘油。
[0011]优选地，所述脱细胞试剂为:浓度为2~5mol/L的NaCl溶液与浓度为0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
[0012] 优选地，所述脱细胞试剂的pH值为7.0~7.4 ;所述脱细胞试剂和/或水的温度均为2~37°C。[0013]优选地，所述A步骤的振荡时间为5~10h，期间，每隔I~a更换一次水；所述8步骤的振荡时间为40~70h，期间，每隔I~2h交替更换一次脱细胞试剂或水。
[0014]优选地，所述脱水剂中甘油的体积比为50~90%。
[0015]优选地，在所述C步骤之后、D步骤之前还包括以下步骤:
[0016]X、使用浓度为2~5g/L碳酸氢钠溶液清洗所述动物角膜2~lOmin。
[0017]优选地，在所述A步骤之后、B步骤之前还包括以下步骤:
[0018]Y、将水更换成浓度为0.02~2%。的次氯酸钠溶液，静置10~60min。
[0019]优选地，在所述D步骤之后，还包括以下步骤:
[0020]Z、将所述脱细胞角膜基质用钴-60辐照。
[0021]此外，为实现上述目的，本发明还提供一种脱细胞角膜基质，由前述制备方法制备得到。
[0022]优选地，所述脱细胞角膜基质的厚度为150~550 μ m,直径为0.5~L 2mm。
[0023]本发明通过脱细胞试剂和水的交替使用，反复改变组织渗透压的方法，能逐步去除角膜基质中免疫原细 胞成分和可溶性蛋白，从而得到完好的脱细胞角膜基质。此外，通过削切处理，可制备出只含有前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质，临床使用前只需医生根据患者创面大小和深度选择对应的规格型号，环钻取得合适的直径大小的脱细胞角膜基质即可使用。这样，不仅操作简单，又能避免污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明的脱细胞角膜基质一实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片对比图，其中，IA为脱细胞处理前的苏木精-伊红(HE)染色照片图，IB为脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片图；
[0025]图2为本发明的脱细胞角膜基质一实施例的脱细胞处理前和脱细胞处理后的透射电镜照片对比图，其中，2A为脱细胞处理前的透射电镜照片图，2B为脱细胞处理后的透射电镜照片图。
[0026]本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。【具体实施方式】
[0027]应当理解，此处所描述的【具体实施方式】为实现本发明目的的最佳实施方式，其仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]本发明提供了一种脱细胞角膜基质的制备方法，在第一实施例中，所述脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤:
[0029]A、将摘取的动物角膜，放入装有水的试剂瓶中，然后在恒温振荡器中以200rpm(转/每分钟)的转速振荡处理5h(小时)，期间，每隔Ih换一次水，以使上皮层脱落。所述动物包括猪、牛、羊等动物，所用的水包括注射水、纯水、生理盐水等。在振荡处理过程中，角膜基质的胶原蛋白吸水蓬松，角膜逐渐吸水变厚，所述角膜基质细胞和内皮细胞逐渐破裂，角膜上皮层逐渐脱落。在振荡处理结束时，所述角膜呈飞碟状，所述角膜上皮层全部脱落。
[0030]将水更换成浓度为0.02%。的次氯酸钠溶液进行灭病毒处理，静置60min后倒去次氯酸钠溶液，再用水洗去残留的次氯酸钠。
[0031]B、在装有所述动物角膜的试剂瓶内加入含有浓度为5mol/L的NaCl和5g/L的EDTA的脱细胞试剂，然后在恒温振荡器中以200rpm的转速振荡处理Ih后，将所述脱细胞试剂替换为所述水在恒温振荡器中以200rpm的转速振荡处理lh，如此这两种溶液交替使用，共振荡处理40h。
[0032]C、加入甘油所占体积比为90%的脱水剂，在25°C温度下振荡处理30min (分钟)，得到脱细胞角膜。脱细胞处理后的角膜由于吸水，厚度变厚，故使用含有甘油的脱水剂脱去角膜中的水分，能使角膜厚度达到原始厚度。
[0033]使用浓度为2g/L碳酸氢钠溶液清洗得到的脱细胞角膜lOmin。这样，既可以降低角膜中甘油含量至合理范围，又可以使角膜中含有一定水分。
[0034]D、将所述脱细胞角膜进行削切，得到脱细胞角膜基质，所述脱细胞角膜基质只含有iu弹力层和基质层。
[0035]将得到的所述脱细胞角膜基质用用剂量为5KGy的钴-60辐照灭菌。
[0036]通过脱细胞试剂和水的交替使用，反复改变组织渗透压的方法，能逐步去除角膜基质中免疫原细胞成分和可溶性蛋白，从而得到完好的脱细胞角膜基质。此外，通过削切处理，可制备出只含有前弹力层和基质层的脱细胞角膜基质，使得临床使用前只需医生根据患者创面大小和深度选择对应的规格型号，环钻取得合适的直径大小的脱细胞角膜基质即可使用。这样，不仅操作简单，又能避免污染。
[0037]第二实施例中，所述脱细胞角膜基质的制备方法包括以下步骤:
[0038]A、将摘取的动物角膜，放入装有水的试剂瓶中，然后在恒温振荡器中以150rpm(转/每分钟)的转速振荡处理IOh (小时)，期间，每隔2h换一次水，以使上皮层脱落。所述动物包括猪、牛、羊等动物，所用的水包括注射水、纯水、生理盐水等。
[0039]将水更换成浓度为2%。的次氯酸钠溶液进行灭病毒处理，静置IOmin后倒去次氯酸钠溶液，再用水洗去残留的次氯酸钠。
[0040]B、在装有所述动物角膜的试剂瓶内加入含有浓度为2mol/L的NaCl和0.5g/L的EDTA的脱细胞试剂，然后在恒温振荡器中以IOOrpm的转速振荡处理2h后，将所述脱细胞试剂替换为所述水在恒温振荡器中以IOOrpm的转速振荡处理2h，如此这两种溶液交替使用，共振荡处理70h。
[0041]C、加入甘油所占体积比为50%的脱水剂，在2°C温度下静置处理60min (分钟)，得到脱细胞角膜。
[0042]使用浓度为5g/L碳酸氢钠溶液清洗得到的脱细胞角膜2min。
[0043]D、将所述脱细胞角膜进行削切，得到脱细胞角膜基质，所述脱细胞角膜基质只含有iu弹力层和基质层。
[0044]将得到的所述脱细胞角膜基质用用剂量为25KGy的钴-60辐照灭菌。
[0045]第三实施例中，在第二实施例的基础上，采用以下参数进行实施:
[0046]所述脱细胞试剂的pH值为7.0 ;所述脱细胞试剂和/或水的温度为37°C。
[0047]第四实施例中，与第三实施例相比，所述脱细胞试剂的pH值为7.4 ;所述脱细胞试剂和/或水的温度为2°C。
[0048] 本发明还提供一种脱细胞角膜基质，在第一实施例中，由前述制备方法制备得到的脱细胞角膜基质厚度为150 μ m，直径为0.5mm。通过削切处理，可制备出只含有角膜前弹力层与基质层的角膜。临床使用前，无需医生对材料进行厚度的处理，医生只需根据患者创面大小和深度选择对应的规格型号，环钻取得合适的直径大小的脱细胞角膜基质即可使用。这样，不仅操作简单，又能避免污染。此外，由于该方法制备的所述脱细胞角膜基质表面平整,创面能够快速愈合。
[0049]在第二实施例中，由前述制备方法制备得到的脱细胞角膜基质厚度为550 μ m，直径为1.2mm。
[0050]图1至图2，以猪角膜为实验对象，采用本发明提供的脱细胞角膜基质的制备方法，得到以下实验结果:
[0051]取依据上述制备方法所制得的猪脱细胞角膜基质进行形态学HE染色观察、超微结构透射电镜观察。
[0052]结果显示:
[0053]图1中，IA为脱细胞处理前的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中正常角膜具有完整的全层角膜上皮细胞和单层角膜内皮细胞，角膜基质内存在大量基质细胞为脱细胞处理后的苏木精-伊红(HE)染色照片图，其中脱细胞处理后，角膜中未观察到任何完整的细胞，如上皮细胞和内皮层。
[0054]图2中，2A为脱细胞处理前天然猪角膜的透射电镜照片图，2B为脱细胞处理后的透射电镜照片图，2B显示脱细胞角膜中胶原纤维排列整齐，与图2A对比观察，脱细胞处理后的角膜基质胶原结构与天然角膜胶原结构一致，说明脱细胞过程未对角膜胶原结构造成破坏。[0055]本发明并不局限于以上实施方式，在上述实施方式公开的技术内容下，还可以进行各种变化。凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的【技术领域】，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【权利要求】
1.一种脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: A、将摘取的动物角膜放入水中，振荡处理，以使上皮层脱落； B、将水更换为脱细胞试剂，振荡处理，期间，所述脱细胞试剂和水交替使用，以使基质细胞和内皮细胞脱落； C、加入脱水剂，静置或振荡处理，得到脱细胞角膜； D、将所述脱细胞角膜进行削切，得到脱细胞角膜基质，所述脱细胞角膜基质只含有前弹力层和基质层； 其中，所述脱细胞试剂含有NaCl和EDTA，所述脱水剂含有甘油。
2.如权利要求1所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞试剂为:浓度为2~5mol/L的NaCl溶液与浓度为0.5~5g/L的EDTA溶液的混合液。
3.如权利要求2所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞试剂的PH值为7.0~7.4 ;所述脱细胞试剂和/或水的温度为2~37°C。
4.如权利要求1所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，所述A步骤的振荡时间为5~10h，期间，每隔I~2h更换一次水；所述B步骤的振荡时间为40~70h，期间，每隔I~2h交替更换一次脱细胞试剂或水。
5.如权利要求1所述的 脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，所述脱水剂中甘油的体积比为50~90%。
6.如权利要求1所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，在所述C步骤之后、D步骤之前还包括以下步骤: X、使用浓度为2~5g/L碳酸氢钠溶液清洗所述动物角膜2~lOmin。
7.如权利要求1所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，在所述A步骤之后、B步骤之前还包括以下步骤: Y、将水更换成浓度为0.02~2%。的次氯酸钠溶液，静置10~60min。
8.如权利要求1所述的脱细胞角膜基质的制备方法，其特征在于，在所述D步骤之后，还包括以下步骤: Z、将所述脱细胞角膜基质用钴-60辐照。
9.一种脱细胞角膜基质，其特征在于，由权利要求1至8中任一项所述的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的脱细胞角膜基质，其特征在于，所述脱细胞角膜基质的厚度为.150 ~550 μ m，直径为 0.5 ~1.2mm。
【文档编号】A61L27/36GK104001215SQ201410264542
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】王维博, 张斌 申请人:深圳艾尼尔角膜工程有限公司