利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法及应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羊角膜基质的制备方法，尤其是一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法及应用方法。
【背景技术】
[0002]角膜疾病是全球第四大致盲病患，据世界卫生组织数据，全球范围内，角膜疾病是仅次于白内障、青光眼、老年性黄斑部病变的第四大致盲病患，约占5.1%。2006年《第二次全国残疾人抽样调查统计结果》表明，因角膜病致盲患者约400万人，且每年新增10多万患者，其中约200万可以通过角膜移植手术复明，但每年施行的角膜移植手术例数为4000?5000例，大量患者因没有供体来源而失明，约300万患者在“等米下锅”，而不准用死刑犯人遗体的规定让角膜的供给大幅下降，每年排队等待角膜供体的患者数量还会大幅增加。由此可见，构建人工角膜是中国目前的当务之急。近年来，组织工程角膜技术的发展为角膜移植带来了希望，但理想的羊角膜基质支架仍然是角膜体外重建的研究热点和技术难点。
[0003]在角膜载体支架方面，虽然国内外学者对羊膜、异种脱细胞羊角膜基质等天然生物材料和复合材料进行了大量的试验研究，但真正能满足临床要求的载体支架还是空白，已报道的异种(如猪羊角膜基质)经脱细胞处理后所形成的支架也存在着结构破坏严重、透明度低、弹力差等致命缺陷。而且制备脱细胞羊角膜基质过程中使用胰酶、乙二胺四乙酸溶液及聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠等去垢剂，对基质中胶素蛋白等天然生物大分子制成的膜片有很大的破坏作用，而临床报道中移植后的角膜呈明显的不透明状也印证了这种材料的缺陷，并不能临床应用。
[0004]由此可见，制备出一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的基质材料是角膜临床应用的关键难题。
【发明内容】
[0005]针对上述问题中存在的不足之处，本发明提供一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法及应用方法。
[0006]为实现上述目的，本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤:
[0007]从新鲜羊眼球上切取角膜片后，并角膜片浸泡在低渗溶液中；
[0008]由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎；
[0009]依次采用缓冲液对羊角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；
[0010]将羊角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对羊角膜基质进行冲洗；
[0011]将羊角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对羊角膜基质进行辐照后，将所制备的羊角膜基质放干燥保存。
[0012]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，上述方法的具体步骤如下:
[0013]S1、取12小时内的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取200?500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡15?60分钟；
[0014]S2、用手术刀刮掉角膜片上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将其反复冻融使细胞破碎；
[0015]S3、依次采用缓冲液对羊角膜基质漂洗2?3次、以将其放入脱细胞试剂浸泡30?90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2?3次；
[0016]S4、将羊角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡1?5小时后，再采用超纯水对其进行冲洗2次；
[0017]S5、将羊角膜基质放入脱水剂中进行浸泡1?5小时后，采用剂量为5?15KGy的钴-60对羊角膜基质辐照1?12小时后，将所制备的羊角膜基质放置于无水氯化钙中干燥保存。
[0018]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S1中，低渗溶液为浓度为0.6%?1.8%的NaCl溶液。
[0019]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S2中，将羊角膜基质冷冻1?3小时，并解冻30?60分钟，以使羊角膜基质的细胞破碎。
[0020]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S3中，采用lOOmmTris-HCl缓冲液对羊角膜基质漂洗2?3次，每次漂洗15?20分钟；
[0021]脱细胞试剂为碳酸氢钠溶液，将漂洗后羊角膜基质放在浓度为4_6g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡30?90分钟。
[0022]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S4中，另一种脱细胞试剂为次氯酸钠溶液，将羊角膜基质放入浓度为0.6%。?1.8%。的次氯酸钠溶液中浸泡时间1?5小时。
[0023]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S5中，将羊角膜基质放入体积比为60% -80%的甘油浸泡1?5小时。
[0024]上述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其中，在步骤S5中，将羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。
[0025]本发明还提供一种利用新鲜羊角膜以制备的羊角膜基质的应用方法，在对其应用前采用PBS浸泡30分钟复水后，即可在手术中使用。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0027]本发明通过反复冻融与两种脱细胞试剂交替使用的方法，逐步去除羊角膜基质中免疫原细胞成分和可溶性蛋白，从而得到无排异的脱细胞羊角膜基质，干燥后储存，使用前用PBS浸泡30分钟复水后即可手术。本发明采用物理方法与低毒性试剂，且时间极短，所得到的羊角膜基质保存完整，安全性高、无抗原性，接近于人体角膜的自然特性。本发明具体成本低、工艺简单、操作时间短、便于保存等特点，有利于工业化生产和临床应用。
【附图说明】
[0028]图1与图2为本发明的脱细胞羊角膜基质一实施例的脱细胞处理前后的HE染色对比照片，其中，图1为脱细胞前，图2为脱细胞后；
[0029]图3与图4为本发明的脱细胞羊角膜基质动物实验手术移植后的照片，其中，图3为手术移植一周后，图4为手术移植一个月后；
[0030]图5与图6为本发明的脱细胞羊角膜基质临床试验手术移植前后的对比照片，图5为手术移植一周后，图6为手术移植一个月后。
【具体实施方式】
[0031]实施例1
[0032]本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤:
[0033]S1、取不超过12小时内采取的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取200微米的角膜片，放入浓度为0.6%的NaCl低渗溶液中30分钟。
[0034]S20、用手术刀刮掉角膜上皮层，保留前弹力层，操作时手法轻柔，刮到前弹力膜层为止。在手术剪刀帮助下，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将羊角膜基质片放置在装有PBS的50ml冻存管中，在_80°C冰箱中冻3小时后，于37°C融化30分钟，反复冻融三次进行细胞破壁，以使羊角膜基质片的细胞破碎。
[0035]S3、采用100mmTris-HCl缓冲液(pH7.5)漂洗3次，且每次漂洗15分钟；
[0036]将羊角膜基质放在4g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡60分钟，然后用超纯水冲洗3次。
[0037]S4、将羊角膜基质放在0.6%。次氯酸钠溶液中浸泡1小时，然后用超纯水冲洗2次。
[0038]S5、将所得到的羊角膜基质放在60%的甘油脱水剂中浸泡1小时；
[0039]将羊角膜基质用剂量为5KGy的钴-60辐照1小时；
[0040]将所制备的羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。
[0041]实施例2
[0042]本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤:
[0043]S1、取不超过12小时内采取的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取300微米的角膜片，放入浓度为0.7%的NaCl低渗溶液中45分钟。
[0044]S20、用手术刀刮掉角膜上皮层，保留前弹力层，操作时手法轻柔，刮到前弹力膜层为止。在手术剪刀帮助下，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将羊角膜基质片放置