在装有PBS的50ml冻存管中，在_80°C冰箱中冻2小时后，于37°C融化45分钟，反复冻融4次进行细胞破壁，以使羊角膜基质片的细胞破碎。
[0045]S3、采用100mmTris-HCl缓冲液(pH7.5)漂洗3次，且每次漂洗20分钟；
[0046]将羊角膜基质放在5g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡50分钟，然后用超纯水冲洗3次。
[0047]S4、将羊角膜基质放在0.7%。次氯酸钠溶液中浸泡4小时，然后用超纯水冲洗2次。
[0048]S5、将所得到的羊角膜基质放在70%的甘油脱水剂中浸泡2小时；
[0049]将羊角膜基质用剂量为lOKGy的钴-60辐照5小时；
[0050]将所制备的羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。
[0051]实施例3
[0052]本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤:
[0053]S1、取不超过12小时内采取的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取400微米的角膜片，放入浓度为0.8%的NaCl低渗溶液中60分钟。
[0054]S20、用手术刀刮掉角膜上皮层，保留前弹力层，操作时手法轻柔，刮到前弹力膜层为止。在手术剪刀帮助下，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将羊角膜基质片放置在装有PBS的50ml冻存管中，在_80°C冰箱中冻3小时后，于37°C融化60分钟，反复冻融3次进行细胞破壁，以使羊角膜基质片的细胞破碎。
[0055]S3、采用100mmTris-HCl缓冲液(pH7.5)漂洗3次，且每次漂洗15分钟；
[0056]将羊角膜基质放在6g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡90分钟，然后用超纯水冲洗2次。
[0057]S4、将羊角膜基质放在0.8%。次氯酸钠溶液中浸泡3小时，然后用超纯水冲洗2次。
[0058]S5、将所得到的羊角膜基质放在80%的甘油脱水剂中浸泡3小时；
[0059]将羊角膜基质用剂量为15KGy的钴-60辐照10小时；
[0060]将所制备的羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。
[0061]实施例4
[0062]本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤:
[0063]S1、取不超过12小时内采取的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取500微米的角膜片，放入浓度为0.7%的NaCl低渗溶液中60分钟。
[0064]S20、用手术刀刮掉角膜上皮层，保留前弹力层，操作时手法轻柔，刮到前弹力膜层为止。在手术剪刀帮助下，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将羊角膜基质片放置在装有PBS的50ml冻存管中，在_80°C冰箱中冻3小时后，于37°C融化30分钟，反复冻融3次进行细胞破壁，以使羊角膜基质片的细胞破碎。
[0065]S3、采用100mmTris-HCl缓冲液(pH7.5)漂洗2次，且每次漂洗15分钟；
[0066]将羊角膜基质放在6g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡30分钟，然后用超纯水冲洗2次。
[0067]S4、将羊角膜基质放在1.8%。次氯酸钠溶液中浸泡2小时，然后用超纯水冲洗2次。
[0068]S5、将所得到的羊角膜基质放在80%的甘油脱水剂中浸泡5小时；
[0069]将羊角膜基质用剂量为12KGy的钴-60辐照12小时；
[0070]将所制备的羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。
[0071]本发明还提供一种利用新鲜羊角膜以制备的羊角膜基质的应用方法，该羊角膜基质采用实施例1至实施例4中记载的制备方法制备而成，在对其应用前采用PBS浸泡30分钟复水后，即可在手术中使用。
[0072]以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括以下步骤: 从新鲜羊眼球上切取角膜片后，并角膜片浸泡在低渗溶液中； 由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎； 依次采用缓冲液对羊角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗； 将羊角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对羊角膜基质进行冲洗； 将羊角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对羊角膜基质进行辐照后，将所制备的羊角膜基质放干燥保存。2.根据权利要求1所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，上述方法的具体步骤如下: 51、取12小时内的新鲜羊眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取200?500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡15?60分钟； 52、用手术刀刮掉角膜片上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将其反复冻融使细胞破碎； 53、依次采用缓冲液对羊角膜基质漂洗2?3次、以将其放入脱细胞试剂浸泡30?90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2?3次； 54、将羊角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡1?5小时后，再采用超纯水对其进行冲洗2次； 55、将羊角膜基质放入脱水剂中进行浸泡1?5小时后，采用剂量为5?15KGy的钴-60对羊角膜基质辐照1?12小时后，将所制备的羊角膜基质放置于无水氯化钙中干燥保存。3.根据权利要求2所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S1中，低渗溶液为浓度为0.6%?1.8%的NaCl溶液。4.根据权利要求2所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S2中，将羊角膜基质冷冻1?3小时，并解冻30?60分钟，以使羊角膜基质的细胞破碎。5.根据权利要求2所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S3中，采用100mm Tris-HCl缓冲液对羊角膜基质漂洗2?3次，每次漂洗15?20分钟； 脱细胞试剂为碳酸氢钠溶液，将漂洗后羊角膜基质放在浓度为4-6g/L的碳酸氢钠溶液中浸泡30?90分钟。6.根据权利要求2所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S4中，另一种脱细胞试剂为次氯酸钠溶液，将羊角膜基质放入浓度为0.6%。?1.8%。的次氯酸钠溶液中浸泡时间1?5小时。7.根据权利要求2所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S5中，将羊角膜基质放入体积比为60% -80%的甘油浸泡1?5小时。8.根据权利要求2或7所述的利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，其特征在于，在步骤S5中，将羊角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。9.一种利用新鲜羊角膜以制备的羊角膜基质的应用方法，其特征在于，该羊角膜基质采用权利要求1或2所述的制备方法制备而成，在对其应用前采用PBS浸泡30分钟复水后，即可在手术中使用。
【专利摘要】本发明提供一种利用新鲜羊角膜以制备羊角膜基质的方法，包括：从新鲜羊眼球上切取角膜片后，并角膜片浸泡在低渗溶液中；由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的羊角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎；依次采用缓冲液对羊角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；将羊角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对羊角膜基质进行冲洗；将羊角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对羊角膜基质进行辐照后，将所制备的羊角膜基质放干燥保存。本发明采用物理方法与低毒性试剂，且时间极短，所得到的羊角膜基质保存完整，具有透明性好、结构致密的特点，接近于人体角膜的自然特性。
【IPC分类】A61L27/36
【公开号】CN105288735
【申请号】CN201510702772
【发明人】韩斌, 张 诚
【申请人】北京赛尔泰和生物医药科技有限公司
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年10月27日