用于组织工程的基质和植入物的制作方法
【专利说明】用于组织工程的基质和植入物
[0001] 本发明涉及如权利要求1所述的用于组织工程的基质、如权利要求9所述的该 基质的制备方法以及如权利要求14所述的包含所述基质和至少一种胰岛（Isletsof Langerhans)细胞的植入物。
[0002] 组织工程是将工程和材料科学与医学结合的交叉学科领域，其提供了治疗功能障 碍或丧失的器官的替代性方法。在这种方法中，临时支架（也称基质）充当植入细胞的附 着基底和引导新器官形成的物理支持体。因此，这种基质用来通过将细胞递送至体内所需 位点、限定工程化组织的潜在空间和促进细胞生长来引导组织发育过程。为了使这些过程 能够进行，组织工程用基质应该满足以下标准：
[0003] 表面应允许细胞粘附、促进细胞生长并允许保留分化的细胞功能。此外，基质应具 有生物相容性和生物降解性，从而使该基质能最终在体内被清除而不会导致炎症或毒性降 解副产物。就其结构而言，基质的孔隙度应该足够高以便提供足够的细胞粘附用的空间、胞 外基质再生和培养期间最小的扩散限制。其孔结构应允许在整个基质中产生均匀的空间细 胞分布以有助于均一的组织形成，且所述材料应该能被可再现地加工为三维结构并且具有 机械强度。
[0004] 已经开发出许多由各种生物降解性材料制造的三维多孔基质。例如， EP-A-2256155公开了基于生物相容性聚合物或聚合物混合物的多孔基质。根据该文献，多 孔基质通过所谓的浸出过程来制备，在该浸出过程中，将由具有限定粒径的聚合物颗粒和 盐颗粒组成的混合物紧密化并随后使所述盐颗粒浸出。
[0005] 现今通常使用合成的生物降解性聚合物，因其易于成形为所需形状并且比天然来 源的聚合物具有更好的机械强度。合成的生物降解性聚合物具有额外优点：其降解周期还 能通过控制结晶度、分子量和共聚比来操控。
[0006] 虽然有这些优点，源自合成聚合物的基质也受到一些限制，例如，缺乏细胞识别信 号、生物接受性和功能容量有限。另外的限制在于，如与水的较高接触角所示，合成聚合物 通常是疏水性的，据发现这在基质上的细胞附着和细胞接种活性方面具有极负面的影响。
[0007] 因此，本发明的目的在于提供一种生物相容性和生物降解性聚合物基质，其允许 高效的细胞保留和增殖，同时维持已知基质、特别是合成基质的理想机械性质。根据更具体 的方面，本发明旨在提供允许在植入物、特别是肝植入物的制备中使用的聚合物基质。
[0008] 该目的通过如权利要求1所述的多孔基质、如权利要求9所述的制备基质的方法 和如权利要求13所述的植入物来实现。进一步优选的实施方式是从属权利要求的主题。本 发明的用于组织工程的多孔基质包含形成具有一级孔（primarypore)的三维一级结构的 第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的第二生物 降解性和生物相容性聚合物组分，所述第二生物降解性和生物相容性聚合物组分选自由胶 原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组。
[0009] 本申请通篇所用术语"基质"是指三维支持体，即支架或海绵样结构，其适于被细 胞拓殖。就此意义而言，基质充当能被细胞或组织拓殖的三维模板。这种拓殖可以在体外 或体内发生。此外，在移植方面，基质起到使移植物定位的作用并且充当在体内逐渐形成的 组织的占位物。
[0010] 术语"生物相容性聚合物"是指在生物学上耐受且在被引入活的生物体时不会导 致排斥的聚合物。对于本发明，生物相容性聚合物还涵盖：被宿主识别为外来物的聚合物， 但可通过适当的免疫抑制来抑制对该聚合物的排斥。
[0011] "生物降解性"的表述是指在活的生物体内（或源自活生物体的体液或细胞培养 物）能被转化为可代谢产物的材料。生物学降解性聚合物包括例如具有生物吸收性和/或 生物侵蚀性的聚合物。"生物侵蚀性"是指在生物液体中可溶或可悬浮的能力。生物吸收性 是指能够被活的生物体的细胞、组织或流体所摄取的能力。
[0012] 因此，第一聚合物组分原则上可以是能够用在医学领域、特别是移植医学领域的 任何生物降解性和生物相容性聚合物。如下文将更详细描述的，第一聚合物化合物通常是 合成的聚合物化合物。与天然聚合物相比，合成聚合物通常提供更高的机械强度，并因此使 得可以制备适于充当细胞附着和拓殖的物理支持体的基质。
[0013] 现已出人意料地发现，如果存在形成具有二级孔的三维二级结构的第二聚合物组 分，其中所述二级结构包含在一级结构的至少部分一级孔的内部空间内，则基质的亲水性 得到显著增强，同时能够保持有益性质，即第一生物降解性和生物相容性聚合物组分的机 械强度。由于亲水性的增强，基质上的细胞附着和细胞拓殖得到极大地促进。这进而增加 了植入程序的成功机会，即植入的基质被接受者所接受而不发生排斥。
[0014] 因此，本发明提供了允许将合成聚合物和天然聚合物两者的有益性质结合起来的 方案。
[0015] 具体而言，本发明允许使用合成聚合物作为为基质提供必要的机械强度的第一生 物降解性和生物相容性聚合物组分，而第二生物降解性和生物相容性聚合物组分是选自胶 原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白的组的天然聚合物，其为基质提供极为有益的亲水性。用在 组织工程中的聚合物基质的亲水性被认为对于在三维空间中均匀且充分的细胞接种而言 极为重要。
[0016] 此外，如下文将更详细说明的，就本发明基质的孔结构而言，第二聚合物组分的存 在极大地增加了可能的设计选择方案的数目。根据第二聚合物组分在一级聚合物组分的孔 内的特定排布，一级孔的尺寸和形式能够自由地相适应。这使得能够例如通过同时提供容 纳细胞尺寸较大的细胞的较大孔和保留细胞尺寸较小的细胞的较小孔而在基质的孔内包 埋和接种多于一种细胞类型。
[0017] 词语"孔"用于指代存在于本发明的基质中的空腔或空隙区域。其可以在二维截面 上具有圆形和/或有角形状、特别是八角形，和/或在以三维观察时具有倾斜形状。此外， 所述形状优选地具有延伸部分特征，从而使空腔的形状能与神经细胞的形状相类比。由此， 术语"孔"也指由包围空隙区域的纤丝形成的空腔。这些孔或空腔可以相互连通，意味着两 个相邻孔之间的孔壁可以包含洞，从而在所述相邻孔之间形成连接。虽然"一级孔"和"二 级孔"均被称作"孔"，但其在结构上可能彼此明显不同，例如在其形状、尺寸和/或互通性 方面。
[0018] 孔的尺寸可以借助其平均孔径来指定，即在二维截面所能分辨的孔的最长和最短 尺寸的平均值。孔径和孔分布可以借助扫描电子显微镜（SEM)来确定，例如以本领域技术 人员公知的方式确定。
[0019] 本发明的基质具有另外的优点：其不仅允许适配其中的孔的尺寸，而且还可以通 过适配具有给定尺寸和/或形状的孔的密度梯度来制备具有各种渗透性和/或孔隙度的基 质。
[0020] 例如，孔可以高度互通或高度不相交。高度互通的孔通常产生具有提高的渗透性 (例如，水渗透性或对于给定类型的材料的渗透性）的组合物，而高度不相交的孔通常产生 具有对于相同的孔隙度而言降低的渗透性的组合物，所述孔隙度通过将基质的代表性样品 的空隙体积除以其总体积来计算。
[0021] 因此，如果基质应当发挥具有提高的渗透性的渗透性或半渗透性基质的功能，则 将该基质设计为具有更高的互通孔数目。另一方面，具有更高的不相交孔数目的结构对于 需要具有特别尚的机械稳定性的基质而目有利。
[0022] 根据本发明，基质的一级结构允许液体和（大）分子扩散进入基质，或甚至穿过基 质。对于在组织工程中的应用，这种遵守Fick方程的渗透性是本发明基质的一大优点，因 为对于允许和促进这类基质中或其附近的细胞增殖而言，气体（例如氧气）、液体和化合物 (例如，细胞养料和废物）的交换至关重要。
[0023] 另外，据发现，基质的一级结构的表面能够通过在植入位点处与接受者的组织相 互作用而活化例如血管生长因子（VGF)等生长因子。活化的生长因子对于刺激和吸引导致 进入基质的小血管（毛细血管）形成和向内生长的细胞而言很重要。活化的生长因子可能 已存在于植入位点处的周围组织中，或者也可与基质一同提供至植入位点，例如，作为一级 和/或二级聚合物材料中的组分、处在一级和/或二级结构的孔内或者通过包覆有包含所 述生长因子的材料的基质来提供。
[0024] 因此，本发明的基质能被完美地调节至即将被基质修复或代替的器官的特定功 能。另外，由于其亲水性增强，本发明的基质满足了高度改善的接受者的接受度，且因而非 常适用于组织工程。
[0025] 就基质的材料而言，进一步优选的是第一聚合物组分选自由聚（乙醇酸）（PGA)、 聚（乳酸）（PLA)、聚（乙醇酸-乳酸）（PGLA)及其混合物组成的组。对于制造生物降解性 基质而言，乳酸（PLA)聚合物组分（例如聚-L-乳酸（PLLA)、聚-D，L-乳酸（L-丙交酯和 D-丙交酯的外消旋混合物；PDLLA)、聚（乙醇酸）（PGA)或其混合物（PLGA;现也称作聚（丙 交酯-co-乙交酯）或PLG))由于其柔性和明确定义的物理性质和相对的生物相容性而是 具吸引力的候选物。另外，其降解产物是进入一般代谢途径的低分子量化合物（例如乳酸 和乙醇酸）。此外，通过简单地改变乳酸与乙醇酸的共聚比，聚（乳酸-co-乙醇酸）提供了 从数日至数年的广谱降解速率的优点。
[0026] 在特别优选的实施方式中，第一聚合物是PGA和PLA的共聚物。通过在基本的PLA/ PGA主题下改变聚合物组成，可以对这些聚合物的性质进行谐调。
[0027] 更具体地，第一聚合物组分优选为乳酸含量为约85mol%且乙醇酸含量为约 15mol%的聚（乙醇酸-乳酸）。聚乳酸（PLLA)和聚（丙交酯-co-乙交酯）（85/15) (PLGA85/15)的这种混合物可以购自例如EvonikIndustriesAG(Essen，德国）。进 一步优选的PGA/PLA混合物是：聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）50:50，例如RES0ΜERκ 1? 502;聚（0，1^-丙交酯-(3〇-乙交酯）65:35，例如1^:801^[-:^1? 653;聚（0，1^-丙交 酯-co-乙交酯）75:25,例如RES0ME:R?RG752 ;聚（D，L-丙交酯-co-乙交酯）85:15,例 如llBSOMEg?RG858。
[0028] 如上所述，第二聚合物组分选自由作为胞外基质蛋白的胶原蛋白、层粘连蛋白、纤 连蛋白及其混合物组成的组，它们可以以本身已知的方式以纯化形式制备或者商购获得。
[0029] 在这些胞外基质蛋白中，最优选的是胶原蛋白。由于其纳米纤维构造，胶原蛋白在 促进组织培养物中的细胞附着、生长和分化功能方面特别有效。然而，还发现如果第二聚合 物组分