[0184] -FCS:胎牛血清（SigmaFM42)
[0185] -HEPES:4-(2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（Sigma)
[0186] -Williams培养基E:包含WilliamE培养基（SigmaW4128)和 10 体积％供体
[0187] 血清或10体积％FCS的用于培养肝细胞的标准培养基
[0188] 以目前已知方式从待移植个体取出一部分肝。首先将已取出的肝部分用溶液 (8gNaCl;0· 2gKC1 ;0· 266gNa3P04 · 12H20;L8g葡萄糖和 0· 19gEGTA;用去离子水制成 1000ml;pH7.4)以30ml/分钟的流速在37°C灌注7分钟。然后将所述肝部分用胶原蛋白酶 / 透明质酸酶溶液（8gNaCl;0· 2gKC1 ;0· 266gNa3P04 · 12H20;L8g葡萄糖；0· 735gCaCl2 和5ml~10mlHEPES;10U/ml胶原蛋白酶；用去离子水制成1000ml;pH7. 2)以30ml/分钟 的流速在37°C下再灌注10分钟。在灌注结束后，将肝部分切碎并小心地悬浮在Williams 培养基E中。将细胞悬浮液过滤（尼龙网；100μπι)，然后用Williams培养基E洗涤。其 后，将细胞在室温下以l〇〇g离心5分钟~10分钟。利用台盼蓝（0. 2% )测定的细胞活力 为 70%〇
[0189] 细胞悬浮液的活力利用台盼蓝染料排除测试并使用下式进行确定：
[0190] 以％计的活力=(计数的活细胞X100)/总细胞数
[0191] 以相同方式从一部分胰腺中分离出胰岛细胞。
[0192] 细胞拓殖
[0193] 在第一步中，将基质与如上文"细胞分离"中所述分离出的肝细胞以及胰岛细胞一 同温育。
[0194] 为此，通过将肝细胞和胰岛细胞分别悬浮在温热的补充有血清的WilliamsE培 养基中来制备肝细胞溶液和胰岛细胞溶液，且各溶液的细胞浓度被调节至约1X1〇6细胞/ ml~3X106细胞/ml。细胞数通过在反转的Olympus显微镜下在0. 25mm计数管中进行计 数来测定。
[0195] 将18ml肝细胞溶液和2ml胰腺胰岛细胞溶液合并，并小心地再悬浮以获得20ml 自体同源移植用细胞溶液。因此，混合细胞溶液中的肝细胞与胰岛细胞之比为9:1。
[0196] 在多孔板中制备20个基质，然后用移液枪将1ml的上文制备的混合细胞溶液（包 含共1X106细胞~3X106细胞）施加至每个基质。然后将经如此方式处理的基质安置在 细胞培养温育器中1小时以使细胞粘附。然后，小心地在多孔板的各孔中以移液枪加入额 外lml温热WilliamsE培养基（补充有人血清）作为对细胞的额外补给。将基质在37°C 以5% 0)2和95%相对湿度温育24小时~36小时。
[0197] 在温育后测定每个基质的细胞数，以确定基质上的植入的细胞的粘附率。粘附率 为 30%至 66%。
[0198] 在植入前，可以将基质在冰上保持约1. 5小时。如果计划在稍晚的时间进行植入， 则可将基质在生物流反应器中于标准条件下保存最多5天。
[0199] 肝细胞的分泌活性和增殖速率
[0200] 以原位或异位植入程序，将根据实施例3制备的被细胞拓殖的基质移植至Lewis 大鼠。在不同的时间将移植物从动物中再次取出并进行形态测定检查。移植后1个月、6个 月和12个月时，显示出直径15mm且厚2mm的圆盘形的植入物中的细胞数分别为94X103、 140X103和 146X10 3。
[0201 ] 组织化学分析证实了来自植入物上的细胞的白蛋白分泌。据发现，分泌在2周后 开始。移植一个月后取出的移植物中的肝细胞展示出正常的白蛋白表达。在所有制备物中 均发现了增殖中的肝细胞，而增殖速率方面没有任何病理性增加。根据本发明移植的肝细 胞展示出BrdU的引入与标准肝制备物相比增加到了 3倍。植入后，对肝脏的代谢活性进行 了研究。
[0202] 血管化
[0203] 对根据实施例3制备的基质的进一步研究显示，这些基质在植入后仅一个月就得 到极为良好的血管化。血管肉眼可见地延伸至基质，并且移植的肝细胞和胰岛细胞由于适 当的毛细血管化而获得了与移植物接受体的心血管系统的接触。
[0204] 此外，可以观察到，共同移植的胰岛细胞没有在接受体内造成任何低血糖症。这些 细胞以及接受体自身的胰岛细胞的内分泌性能据推测受到反馈机制的调节。
[0205] 肝功能的接纳
[0206] Gunn大鼠被视为人Crigler-Najar综合征的动物模型，原因在于，因特定的先天 性代谢酶缺陷，其肝脏无法适当地结合（conjugate)胆红素。因此，未经结合的胆红素的毒 性血浆水平由于显著的结果性损害而导致死亡。
[0207] 用根据实施例3制备的被细胞拓殖的基质来对3只Gunn大鼠进行移植。所述基 质的外部面积合计l〇cm2。
[0208] 移植后仅4周，实验动物中的胆红素水平就下降了。自此，胆红素得到结合。在所 有三个情形中，可以使用胆管探针在仍存在的肝的胆管中检测结合的胆红素。因此，结合在 基质中的胆红素以生血方式到达肝脏并且能借助胆管系统从肝脏被清除。
【主权项】
1. 一种用于组织工程的多孔基质，其包含形成具有一级孔的三维一级结构的第一生物 降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的第二生物降解性和 生物相容性聚合物组分，所述第二生物降解性和生物相容性聚合物组分选自由胶原蛋白、 层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组，其中，第二聚合物组分形成具有二级孔的三维 二级结构，所述二级结构包含在至少一部分所述一级孔的内部空间内。2. 如权利要求1所述的基质，其中，所述第一聚合物组分选自由聚乙醇酸、聚乳酸、聚 (乙醇酸-乳酸）及其混合物组成的组。3. 如权利要求1或2所述的基质，其中，所述第二聚合物组分是胶原蛋白，优选为明胶。4. 如权利要求1至3中任一项所述的基质，其中，所述一级孔的平均孔径为150μm至 300μm，优选 200μm至 300μm。5. 如权利要求4所述的基质，其中，所述二级孔的平均孔径小于所述一级孔的平均孔 径，并且是50μm至290μm、优选50μm至150μm、更优选50μm至100μm。6. 如权利要求1至5中任一项所述的基质，其包含多孔基层和多孔细胞包埋层，所述基 层中的孔的平均孔径小于所述细胞包埋层中的孔的平均孔径。7. 如权利要求1至6中任一项所述的基质，其中，所述基层中的孔的平均孔径为10μm 至 50μm〇8. 如权利要求1至7中任一项所述的基质，其中，所述基质的孔隙度为至少80%，优选 至少90 %，最优选为95 %至99. 5 %。9. 一种制备权利要求1至8所述的基质的方法，其包括以下步骤： a) 提供混合物（M)，所述混合物（M)包含：溶解于聚合物溶剂（S-Ι)中的第一聚合物组 分的聚合物颗粒的聚合物溶液（PS-Ι)和 成孔性可浸出材料的颗粒，所述成孔性可浸出材料的颗粒不溶于所述聚合物溶剂 (S-Ι)且粒径为约100μm至400μm; b) 通过除去所述聚合物溶剂（S-Ι)使所述混合物紧密化； c) 除去所述成孔性可浸出材料，由此生成具有一级孔的三维一级结构； d) 将所述一级结构浸入包含溶解在溶剂（S-II)中的第二聚合物组分的溶液（PS-II) 中；和 e) 除去所述溶剂（S-II)。10. 如权利要求9所述的方法，其中，在步骤a)中，所述混合物（M)还包含所述第一聚 合物组分的固体聚合物颗粒，且所述混合物（M)通过将所述聚合物溶液（PS-Ι)添加至颗粒 混合物（MP)来制备，所述颗粒混合物（MP)含有所述第一聚合物组分的所述固体聚合物颗粒 和所述成孔性可浸出材料的颗粒。11. 如权利要求9或10所述的方法，其中，所述第一聚合物组分的所述聚合物颗粒的粒 径为约100μm至300μm。12. 如权利要求9或11中任一项所述的方法，其中，步骤d)中用于溶解所述第二聚合 物组分的所述溶剂（S-II)是水性溶剂，且步骤e)中除去所述溶剂（S-II)涉及以下步骤： el)离心，和 e2)冷冻-干燥和/或真空下冻干。13. 权利要求1至8中任一项所述的基质在制备用于组织工程、特别是用于肝植入物的 植入物中的应用。14. 一种用于组织工程的植入物，其包含权利要求1至8中任一项所述的基质和至少一 种胰岛细胞。15. 如权利要求14所述的植入物，其还包含肝细胞。16. 如权利要求15所述的植入物，其中，肝细胞与胰岛细胞之比为约1X10 6个肝细胞 比20000~500000个胰岛细胞，优选为约1X106个肝细胞比20000~100000个胰岛细胞， 最优选为约1X1〇6个肝细胞比20000~70000个胰岛细胞。17. 用于治疗慢性肝病或胰腺疾病和/或慢性肝衰竭和胰腺衰竭的权利要求14至16 中任一项所述的植入物。18. -种制备权利要求14至17中任一项所述的植入物的方法，其包括如下步骤： a. 提供权利要求1至8中任一项所述的多孔基质，和 b. 将肝细胞和至少一种胰岛细胞加载于所述基质的至少一侧上。19. 如权利要求18所述的方法，其中，所述基质基本为约0. 1mm至1. 0mm厚的片形，且 所述方法包括如下的另一步： c. 将其上具有细胞的所述基质折叠以获得双层结构或多层结构。20. 如权利要求18或19所述的方法，其中，步骤b)涉及将细胞加载于所述基质的两侧 上。21. 包含至少一种权利要求1至8中任一项所述的基质和多细胞微组织球状体的试剂 盒，所述多细胞微组织球状体包含处于培养基中的预组装的细胞簇。22. 如权利要求21所述的试剂盒，其中，所述预组装的细胞簇包含至少一种胰岛细胞 和肝细胞。
【专利摘要】本发明涉及用于组织工程的多孔基质，其包含形成具有一级孔的三维一级结构的第一生物降解性和生物相容性聚合物组分，并且还包含不同于第一聚合物组分的选自由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白及其混合物组成的组的第二生物降解性和生物相容性聚合物组分，其中所述第二聚合物组分形成具有二级孔的三维二级结构，所述二级结构包含在一级孔的至少一部分的内部空间内。
【IPC分类】A61L27/26, A61L27/38, A61L27/58, A61L27/56
【公开号】CN105324136
【申请号】CN201480034482
【发明人】H·U·贝尔
【申请人】H·U·贝尔
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年6月16日
【公告号】EP2815773A1, EP3010556A1, US20160130558, WO2014202199A1