是一级孔）的尺寸优选使得基质不仅能装载单个细胞，而且能够装载多细胞细胞簇（也称 球状体）。
[0095] 在涉及到肝细胞时，基质装载多细胞细胞簇的可行性是特别的优点，因为已发现 如果将肝细胞以预组装状态加载至基底上，会使其死亡率显著降低。
[0096] 因此，考虑到肝细胞的平均细胞尺寸（10ym至15μπι)并鉴于基质在制备肝植入 物中的应用，一级孔优选具有150μm至300μm、优选200μm至300μm的平均孔径。
[0097] 几年前，开发出了一种新型培养技术，其允许提供处于可转移且可保存状态的这 种预组装细胞簇。该培养技术已知名为"悬滴（hangingdrop)技术"，其涉及在悬挂在表 面上的培养基液滴中进行细胞培养。这些培养基液滴接种有活细胞，并且在重力牵引下， 培养基小液滴中的细胞下降以组装为微型组织，这产生了在形态和功能上与天然组织非常 相似的多细胞微组织球状体。这些预先准备的微组织可以以即用形式购买，或可以例如根 据瑞士联邦理工学院（ΕΤΗ)(苏黎世）和瑞士苏黎世大学的分拆公司InSphero所开发的 GravityPLUS?技术来制备。此处参考关于InSphero的悬滴技术的欧洲专利EP-B1-2342317 的公开内容。
[0098] 特别考虑到使用上述多细胞微组织球状体，本发明的基质极为适合，因为该基质 (优选具有平均孔径为150μm至300μm的一级孔）的孔提供了充分的空间，使得预组装的 细胞簇易于适配至一级孔内。
[0099] 虽然通常优选植入已预先加载（体外接种）有活细胞的植入物，但另一种可能是 以诱导能够进行组织再生的前体细胞迀移进入损伤组织并在此使已损失的组织再生为目 的来植入基质（没有任何在先的细胞附着）。为此，必须将基质配置成使得所需细胞能迀移 至基质内，而不希望的细胞则不能。这种应用通常被描述为引导型组织再生（GTR)。
[0100] 因此，本发明的基质或本发明的植入物能用来治疗人或动物体。为此，通过手术或 介入程序将一种以上的基质或一种以上的植入物引入待治疗的体内。如果植入物含有具备 器官功能的细胞，或者如果具有器官功能的细胞将迀移至基质内，例如肝细胞或胰岛细胞 的情形，则可以将基质或植入物例如植入待治疗个体的肠系膜、皮下组织、腹膜后腔、腹膜 前空间或肌内空间。
[0101] 原则上，需要适当的组织替换的任何个体均可用本发明的基质或植入物来治疗。 这些个体通常是罹患其病程涉及到功能性组织丧失的特定障碍症或疾病。这可能潜在地影 响整个器官，例如肝脏或胰腺。
[0102] 因此，本发明的另一个目的在于提供用于组织工程的包含基质和包埋在其中的细 胞的植入物。
[0103] 该目的通过权利要求13所述的主题来实现，其属于包含至少一种本发明的基质 和至少一种胰岛细胞的组织工程用植入物。
[0104] 胰岛细胞是来自胰腺的细胞，其在胰腺中形成细胞集合--所谓的朗格罕氏细胞 的"岛"。在健康成年人的整个胰腺中分布着约100万个岛，每一个经测量直径为小于40μm 至400μπι，并且含有从仅几个细胞/岛到约5000个细胞/岛的多个细胞（Bonner-Weir 1994)。人胰岛中的细胞的65%至80%是胰岛素生成β细胞，其遍布在所述岛上。
[0105] 所述基质的结构使其成为优异的细胞用基底，并且可以在该基质上培养单一细胞 类型或几种不同细胞类型。就此而言，除了胰岛细胞外，植入物可以包含其它细胞，具体而 言，肝细胞、胰腺细胞、脂肪细胞、肠细胞、皮肤细胞、血管细胞、神经细胞、肌肉细胞、平滑肌 细胞、甲状腺细胞、泌尿道上皮细胞、来自输卵管的细胞、泌尿生殖组织、成纤维细胞或纤维 细胞以及牙根细胞的细胞。
[0106] 基质中存在的孔为细胞内向生长和胞外基质的沉积提供了空间。由于基质提供了 必要的机械稳定性和弹性，在经过初始的静止期之后，细胞培养可以动态地完成。这意味着 细胞在例如细胞培养瓶等静态环境中培养。随后，在支架上生长的细胞被转移至模拟动态 环境的灌流室中。这一过程影响进一步的细胞生长。例如，胞外基质的组成取决于细胞所 暴露至的机械应力。
[0107] 特别优选的是，植入物除胰岛细胞外还包含肝细胞。因此，在该实施方式中，植入 物包含至少两种细胞类型，其优选为自体同源细胞（来自接受稍后的植入物的个体的细 胞），但作为另一选择也可以是异源细胞。
[0108] 已出人意料地发现，包含肝细胞和胰岛细胞的本发明植入物提供了肝组织的优异 生物替代品，其允许在慢性或急性肝病的情况下恢复、维持并改善肝脏的器官功能。特别 是，已发现肝细胞与胰岛细胞的特定比例对于允许植入物实现其特定功能而言特别有利。
[0109] 在特别优选的实施方式中，植入物已加载有包含预组装的肝细胞细胞簇和至少一 种（优选多种）胰岛细胞的多细胞微组织球状体。优选根据例如ΕΡ-Β1-2342317中所公 开的悬滴技术来制备此种预组装的细胞簇，更具体为多细胞微组织球状体形式的预组装细 胞簇。作为另一选择，含有预组装细胞簇的制备好的悬滴可以作为保存在冷冻状态（优选 在_78°C)的预制球状体而购得。
[0110] 预组装细胞簇或微组织球状体在宽度和高度上的尺寸优选为100μπι至300μπι。 因此，当用所述细胞加载基质时，预组装细胞簇易于适配至一级孔内。
[0111] 因此，本发明最优选地还涉及在植入后执行肝脏的代谢功能的植入物。出于该目 的，肝细胞与胰岛细胞之比优选为约1X1〇6个肝细胞比20000~500000个胰岛细胞，更优 选为约1X1〇6个肝细胞比20000~100000个胰岛细胞。最优选地，植入物包含约1X10 6 个肝细胞与20000~70000个胰岛细胞。
[0112] 在这方面应该注意的是，上述数字明确地涉及细胞的数目，而不是预组装细胞簇 的数目。
[0113] 另外，本发明优选涉及在植入后表现出等同的胰腺器官的内分泌性质的植入物。 为了执行胰腺的功能，植入物优选包含比肝细胞更多的胰岛细胞。就此而言，肝细胞与胰 岛细胞的优选比例为1:1至1:200。出于该目的，最优选的是肝细胞与胰岛细胞之比为约 1:100〇
[0114] 用于在本发明的基质中拓殖的细胞或细胞混合物可以以目前已知的方式获得。为 了制备自体同源植入物，所述细胞优选源自将要插入所述植入物的个体。因此，通常从该个 体取出合适的组织，例如一部分肝脏或胰腺，并以合适的方式制备以用于在体外接种和培 养所述基质。就此而言，重要的是所述细胞展现出尽可能高的活力率。
[0115] 如果从肝组织获得肝细胞，则必须要考虑到如下事实：肝细胞被厚厚的结缔组织 层所包围，特别是在肝硬化的情形中。根据本发明，使用具有限定组成的溶液以便能将包含 尽可能高的活细胞比例的肝细胞分离。
[0116] 优选地，用含有NaCl、KCl、Na3P04 · 12H20、葡萄糖和乙二醇四乙酸（EGTA)且pH约 为7. 4的水性组合物A来对一部分肝脏或胰腺进行输注。特别地，1000ml的这种溶液含有 约 8gNaCl、0. 2gKC1、0. 27gNa3P04 ·12Η20、1· 8g葡萄糖和 1. 9gEGTA。输注优选在约 37°C 的温度和约15ml/分钟的流速下进行。数分钟、特别是约3分钟~5分钟（例如约4分钟） 足够以上述流速对所述组织部分进行输注。
[0117] 作为另一选择，也可以使用含有EGTA的水性组合物A'对一部分肝脏或胰腺进行 输注。
[0118] 为了对一部分肝脏或胰腺进行输注，优选利用pH为约7. 3至7. 4、优选为约7. 35 的水性组合物B。组合物B优选是含有HEPES、CaCljP50U/mlIV型胶原蛋白酶的低葡萄 糖DMEM(Dulbecco氏改良伊戈尔培养基）
[0119] 在此情形中，同样地，在约37°C和约10ml/分钟的流速下进行输注经证实是有利 的。数分钟、特别是约5分钟~10分钟（例如约6分钟~7分钟）足够对所述组织部分进 行适当输注。
[0120] 作为另一选择，也可以使用含有胶原蛋白酶和透明质酸酶的水性组合物B'来对 一部分肝脏或胰腺进行输注。l〇〇〇ml的该溶液优选含有50U透明质酸酶/ml。
[0121] 如果先用组合物A处理组织部分然后用组合物B处理，则对于所要分离的细胞的 活力而言是有利的。作为另一选择，可以先使用组合物A'然后使用组合物B'。
[0122] 在输注后，可以将组织部分切碎并小心地悬浮于合适的培养基（例如Williams培 养基E)中。如果所得细胞悬浮液仍含有相对粗的细胞碎片，则可以以目前已知的方式将后 者除去，例如将细胞悬浮液过滤通过尼龙网（100μπι)。然后可以小心地将滤液的细胞沉淀， 与此结合的是，在60g~130g和4°C~22°C下进行3分钟离心，这经证明是有利的。
[0123] 以目前已知的方式将已分离的细胞加载至基质上。通常，细胞作为含细胞的溶液 被加载至基质上，然后使细胞和基质接种（通常在细胞培养条件下）直到细胞附着于基质。 如果胰岛细胞与至少一种其他细胞类型（例如肝细胞）一同提供于基质上，则原则上可以 将所述不同细胞类型共同加载或者依次加载至基质上。
[0124] 因此，本发明还提供了制备植入物的方法，其包括以下步骤：
[0125] a.提供本发明的多孔基质，和
[0126] b.将肝细胞和至少一种胰岛细胞加载于所述基质的至少一侧上。
[0127] 更具体地，优选先加载胰岛细胞，然后是肝细胞，每种情况中的温育在加载之后进 行，直至至少一部分细胞附着于基质。
[0128] 最优选地，胰岛细胞和肝细胞以预组装细胞簇共同加载至基质上。这种预组装细 胞簇可以购得，或例如通过使用上文所述的悬滴技术来培养。
[0129] 在特别优选的实施方式中，所提供的预组装细胞簇或微组织在宽度和高度上的尺 寸为100μm至300μm，从而当用细胞加载基质时其易于适配至一级孔内。
[0130] 然而，本发明的基质不仅促进其上的细胞沉积，而且还提供了如下的结构环境，该 结构环境不仅允许细胞存活，而且使其在基质内增殖和迀移。更具体地，本发明的基质允许 液体和（大）分子运送至基质内，甚至穿过该基质。开始时，养料（例如，氧气）和废物的 交换借助于扩散来进行。然而，扩散作为存活过程的被动运送方式仅在短距离内有效。特 别是，已发现扩散使得氧气和养料被供给至基质内的细胞，但最大供给距离仅为从表面至 基质内部约400μm。这意味着，由于缺乏必需的养料特别是氧气，已沉积在基质上的细胞通 常不能迀移至基质内的比该扩散距离更深的地方。考虑到该有限的扩散范围，基质的厚度 优选为〇· 1謹至1.Ctam，更优选0· 5謹至1. (torn。
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