包含马来酰亚胺基核心的超分子聚集体的制作方法
【专利说明】包含马来酿亚胺基核心的超分子聚集体 发明领域
[0001] 本发明涉及通式（VI)的超分子聚集体及其用于靶向和任选地递送活性物质的应 用。特别地，本发明涉及与活性物质形成超分子聚集体的新的马来酰亚胺基官能化的核心。
[0002] 技术状态
[0003] 用于设计多聚体大分子的化学策略已经在近期的文献中描述（B.D.Mather等人 Prog.Polym.Sci. 31 (2006)487-531 ;K.Sadler等人ReviewsinMolecularBiotechnology90,（2002) 195-229)。这类具有肽性质的分子的第一个实例由Tam和同事提出（K.J.Chang 等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,（1988)4929-4933)作为在保持原始氨基酸序列的同时 增加肽大小的解决方案。由Tam设计的分子被应用为用于产生抗体的"章鱼免疫原"并且 此类免疫策略已被命名为多抗原肽（MAP)策略。MAP对蛋白水解的抗性的观察开启了肽作 为药物的用途的前景。在这方面，MAP策略被应用于合成作为眼镜蛇毒素解毒剂、作为抗微 生物剂、作为用于肿瘤革E向的载体等的分支肽（A.Pini等人CurrentProteinandPeptide Science9,（2008)468-477))。另外，一小组神经肽，包括脑啡肽类、神经降压素和痛敏肽/ 孤啡肽FQ(N/0FQ)，被以单体和四分支形式合成并与人血浆和血清孵育。所有四分支神经 肽保留完整的生物活性，并通常显示出对血液和脑蛋白酶活性的较高稳定性（L.Bracci等 人J.Biol.Chem. 278,（2003) 56590-56595)。综合来说，这些数据支持开发分支肽分子作为 创新的疗法。此外，作为超分子聚集体的多聚体大分子越大，它们的合成、纯化和分析表征 就越复杂。事实上，在通过标准固相合成技术的MAP装配期间产生的杂质在纯化步骤期间 特别是当需要长臂时不能够被除去。文章（A.Pini等人CurrentProteinandPeptide Science9,（2008)468-477)的图4幅C中报道的HPLC谱显示了研究的四分支MAP的低纯 度级别。通过标准固相肽合成技术获得的MAP分子的低纯度级别提出了为了开发作为药物 的分支分子即超分子聚集体所需要解决的重要问题。
[0004] 在ZhangXiaofen等人"macrocyclicchelatorassembledRGDmu1timer forturnertargenting'，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters, 21 卷 11 号，2011 年6月中，描述了用于靶向肿瘤中的肽装配的大环螯合剂，1，4, 7, 10-四氮杂环十二 烷-1，4, 7, 10-四乙酸（D0TA)。由于D0TA的结构，D0TA-被更多地官能化，最终多聚体官 能化的产物的产量就降低，使得具有四肽的D0TA的产量非常低。
[0005] 因此，制备能够保证不仅当制备甚至完全官能化时高产量而且以高纯度保持与待 被靶向至最终位点的分子连接的新的超分子聚集体是非常困难的。另一方面，超分子聚集 体还应保证以可再生的方式与最终靶标连接。
[0006] 因此，本发明的目的是不使用长的和困难的纯化步骤以高产量地提供超分子聚集 体。
[0007] 此外，存在提供能够以稳定和可再生的方式连接和靶向活性物质的新的超分子聚 集体的需求。
[0008] 发明概述
[0009] 因此通过式（VI)的超分子聚集体已经实现了前述目的
[0010]
[0011] 其中
[0012] f、q彼此独立地是从1到8的整数，
[0013] r和s彼此独立地是从1到4的整数，
[0014] Y是从1到4的整数，并且
[0015] XpX2、X3和X4彼此独立地是式⑴的部分并且
[0016]
[0017] ΧρX2、父3和X4中的至少一个是存在的，并且
[0018] 其中
[0019] A-S-是用巯基衍生的活性物质或具有游离的巯基的活性物质
[0020] 并且I是从1到10的整数。
[0021] 在本发明中，当使用用于A-S-的定义"活性物质"时，它意指待被靶向并递送到靶 位点的活性物质，诸如药物、疫苗、诊断物质。
[0022] 式（VI)的聚集体包括式（IV)的核心
[0023]
[0024] 以及XjP/或X2、X3和X4。
[0025] 在另一方面，本发明涉及式PWT2的马来酰亚胺基官能化的核心
[0026]
[0027] 因此本发明通过提供作为包含马来酰亚胺基部分的超分子聚集体的新的分支支 架解决了以上提到的问题（即分支分子的低纯度）。连接至分支核心的此类马来酰亚胺基 部分允许高产量的巯基-迈克尔加成反应，并因此可用于包含巯基的分子的化学选择性连 接（welding)。由于应用的反应的高产量和化学选择性，所得的超分子聚集体可被容易地纯 化。另外，包含核心的马来酰亚胺基和巯基衍生的活性物质之间的连接反应需要的温和条 件和该连接反应的快速性有利地将此类方法延伸至具有低化学稳定性的活性物质。
[0028] 因此，在另一方面，本发明涉及用于制备本发明的超分子聚集体的方法，所述方法 包括将η个（A-SH)与式（VII)的化合物巯基-迈克尔加成反应的步骤
[0029]
[0030] 其中
[0031 ] f、q彼此独立地是从1到8的整数，
[0032] r和s彼此独立地是从1到4的整数，
[0033] Y是1到4的整数，并且
[0034] ZpZ2、ZjPZ4彼此独立地是式（II)的部分
[0035]
[0036] 并且ΖρZ2、&和Z4中的至少一个是存在的，
[0037] 并且I是从1到10的整数。
[0038] 因此，在本发明中，式（VII)的化合物优选为PWT2。
[0039] 新的式（IV)的马来酰亚胺基官能化的核心，即式（VII)的化合物，更特别为PWT2， 致使结构上能够不仅提供在巯基上与特定的活性物质的精确连接，而且能够将这样的活性 物质以可再生的方式靶向至被靶向的位点。
[0040] 不束缚于任何理论，本发明人认为活性物质的精确、可再生和与其稳定的连接，以 及有效的靶向至靶位点的惊人特性是由于（IV)的马来酰亚胺基官能化的核心更优选为 PWT2的特定结构。
[0041] 在另一方面，本发明涉及用于将活性物质A靶向和任选地递送至靶位点的超分子 聚集体。
[0042] 所得的超分子聚集体可用于例如药物、疫苗领域中、作为GPCR的配体（激动剂以 及拮抗剂）、作为抗生素、作为诊断物质（即作为放射性配体的PWT2衍生物）以及将单个生 物活性药理单元连接到多官能支架可以是有价值的所有领域中。
【附图说明】
[0043] 在下文中参考附图详细描述本发明，其中：
[0044] 图1示出了PWT2的合成方案
[0045] 图2示出了PWT2的质谱（计算的M.W. 861. 37775)(计算的PWT2+Na M.ff. 883. 35969)
[0046] 图3示出了PWT2-N/0FQ的化学式和HPLC谱
[0047] 图 4 示出了PWT2-N/0FQ的质谱（计算的M.W. 8505. 69)
[0048] 图5.对CH0N0P+Gaqi5细胞进行的钙动员测定。N/0FQ、PWT2_N/0FQ的浓度响应曲 线（左图）。针对抗N/0FQ和PWT2衍生物的刺激效应的SB-612111的抑制响应曲线（右 图）。数据为以一式两份做出的至少4组实验的平均值土sem。
[0049] 图6.在电刺激的小鼠输精管中N/0FQ和PWT2-N/0FQ的浓度响应曲线。值为3组 独立实验的平均值土sem。
[0050] 图7.N/0FQ(顶图）和PWT2-N/0FQ(底图）的浓度响应曲线的典型追踪。记录 PWT2-N/0FQ作用和洗涤后缺乏逆转的缓慢动力学。
[0051] 图8.在SB-612111 (ΙΟΟηΜ)的不存在（对照）和存在下在电刺激的小鼠输精管中 获得的N/0FQ(顶图）、PWT2-N/0FQ(底图）的浓度响应曲线。值为至少3组独立实验的平 均值土sem。
[0052]图9.在取自NOP(+/+)和NOP(-/-)小鼠的输精管组织中获得的N/0FQ(顶图）、 PWT2-N/0FQ(底图）的浓度响应曲线。值为3组独立实验的平均值土sem。
[0053] 图 10.小鼠运动活性。等效i.c.V.剂量的N/OFQ(lOnmol)、PWT2-N/0FQ(0· 25nmol) 对动物运动距离（顶图）、不动时间（中图）、和竖起（底图）的效应。结果表示为从下午 4时至上午9时的时间过程（左图）和累积效应（右图）。数据为每组10-12只小鼠的平 均值土sem。根据AN0VA随后是用于多重比较的Bonferroni's检验相比于盐水*p〈0. 05。
[0054] 发明详述
[0055] 因此本发明涉及式（VI)的超分子聚集体
[0056]
[0057] 其中
[0058] f、q彼此独立地是从1到8的整数，
[0059] r和s彼此独立地是从1到4的整数，
[0060] Y是从1到4的整数，并且
[0061] XpX2、X3和X4彼此独立地是式⑴的部分并且
[0062]
[0063]X。X2、&和X4中的至少一个是存在的，并且 [0064] 其中
[0065]A-S-是用巯基衍生的活性物质或具有游离的巯基的活性物质
[0066] 并且I是从1到10的整数。
[0067] 在本发明中，当使用用于A-S-的定义"活性物质"时，它意指待被靶向并递送到靶 位点的活性物质，诸如药物、疫苗、诊断物质。
[0068] 式（VI)的聚集体包括式（IV)的核心
[0069]
[0070] 和XJP/或X2、X3和X4中的至少一部分。
[0071] 在式（VI)的聚集体中和在式（IV)的核心中，f、q彼此独立地是从1到8的整数， 优选地f是3且q是2,r和s彼此独立地是从1到4的整数，优选地它们等于1，并且Y是 从1到4的整数，更优选地是1。在本发明的超分子聚集体的式（I)的部分中，I是3。
[0072] 根据本发明，在超分子聚集体（VI)中X2、XjPX4彼此独立地是连接的马来酰 亚胺基片段，所述马来酰亚胺基片段转而通过巯基连接至用巯基衍生的或具有巯基基团的 活性物质A。
[0073] 因此本发明涉及式（IV)的马来酰亚胺基官能化的核心。
[0074] 在另一方面，本发明涉及式PWT2的马来酰亚胺基官能化的核心
[0075]
[0076] 马来酰亚胺基官能化的核心连接至巯基活性物质A。
[0077] 因