转谷氨酰胺酶在加强角膜力学性质中的应用及生物制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及转谷氨酰胺酶在加强角膜力学性质中的应用及其制备的生物制剂，属 于生物制剂/角膜病领域。
【背景技术】
[0002] 圆锥角膜(Keratoconus)是一种不伴有炎症、以角膜基质变薄、角膜进行性前突、 角膜不规则散光、矫正视力下降为特征的眼病。也是角膜扩张类疾病的典型代表。
[0003] 圆锥角膜多发生于年轻人，发病率约为1/2000,约21%的圆锥角膜患者最终需采 用角膜移植手术治疗，约占所有角膜移植患者16%。传统的圆锥角膜的主要治疗有屈光矫 正和角膜移植两大类，前者包括配戴框架眼镜和角膜接触镜、角膜内环植入术、准分子激光 角膜表面切削术(PRK)等，这些方法对部分圆锥角膜患者可达到屈光矫正的目的，但不能阻 止病情的进展。后者则受到器官来源的限制，患者需要使用抗排异药物，应用受到制约。
[0004] 圆锥角膜的病因至今仍不十分清楚，但角膜的机械强度降低被认为是其重要病因 之一。组织学上发现圆锥处纤维板层减少，胶原纤维直径并未改变。故认为可能是纤维板层 间粘合不够，板层相互滑脱，导致角膜变薄。继而，由于角膜中央区或旁中央区进行性的变 薄，导致角膜不规则散光度增加，近视度数也不断加深，视力进行性下降。从这个角度出发， 增加角膜的力学强度成为治疗该疾病的新的治疗手段和思路。
[0005] 胶原交联治疗(cross-1 inking treatment)是通过生物化学的方法使胶原纤维的 相互连接加强，增加组织强度的治疗技术，按照交联方法的不同可以分为物理交联(光化学 交联）、化学交联、生化交联(酶交联)三种。在目前国内外的研究中，物理交联(光化学交联） 治疗对圆锥角膜的治疗研究已经显示了很好的疗效。其中紫外光-核黄素角膜交联法已经 被美国FDA批准，在临床上应用。
[0006] 该方法是采用核黄素作为光敏剂，以对眼球内部结构无害的紫外线A(UVA)照射， 利用光线的照射使光敏剂将氧分子激发到三线态，其在回到单线态时产生有很强的氧化活 性的氧自由基(R〇S，reactive oxygen species)(图6)，使得胶原纤维的终端发生缩合反 应，增加了胶原纤维之间的侧向连接，从而使角膜的机械强度得到了增强，圆锥角膜得以停 止进展甚至有部分患者近视度数得到了减轻。化学交联对角膜的作用目前停留在实验室阶 段，有学者使用短链无环β硝基乙醇(BNA)、京尼平用于猪角膜的交联，发现离体动物角膜的 弹性模量一定程度的增加。
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[0009]上述两种交联方法均存在一定的局限性。
[0010]虽然紫外光-核黄素交联法技术应用于临床已近十年，并被誉为"圆锥角膜患者的 治愈希望"。但是尚存在诸多不足：1)由于角膜的核黄素吸收效应，该方法只能使角膜前250 ~300um的基质胶原得到交联，因此，其临床有效性受限，多项研究均显示紫外光核黄素交 联后角膜最陡屈光度下降仅2D左右。2)该方法治疗时需去除角膜上皮，可增加患者术后疼 痛、视物模糊、角膜云雾状混浊及感染的发生。3)该方法也存在安全性问题，近期临床研究 报道对角膜厚度低于400um的圆锥角膜患者行紫外线核黄素交联后角膜内皮细胞密度明显 下降。4)对基质细胞的损伤:基础研究及角膜共聚焦显微镜临床观察均表明在深达300um 的角膜基质中有大量角膜细胞凋亡，需要长达半年时间恢复。5)紫外光核黄素胶原交联对 于光过敏体质的病人不适用。6)设备价格昂贵。7)对于术前最陡角膜屈光度超过58D、年龄 超过35岁、视力大于0.8的圆锥角膜患者，紫外光核黄素交联手术后发生各种并发症的风险 明显增加。上述问题限制了此项技术的推广和应用。化学交联法简单易行，交联剂来源广， 但是其化学交联剂治疗的副作用难以回避、其对眼部其他组织的生物毒性需要阐明。相比 之下，生化交联(酶交联)成为一个比较理想的选择。
[0011] 生化交联是利用有活性的酶，催化特定的氨基酸底物，使得肽链的氨基酸之间产 生共价键，达到交联的目的。转谷氨酰胺酶(TGase)就是一种优秀的交联酶。
[0012] 目前发现的TGase共包括8个亚型，其中多数类型在人体中广泛存在，并参与重要 的生理功能。TGase的生物学功能是催化蛋白质谷氨酸的酸残基和赖氨酸的铵残基之间发 生转谷氨酰胺反应，生成异肽键：ε-(γ_谷氨酰)_赖氨酸键（图2)。该异肽键形成后异常稳 定，可有效地增加组织对物理、化学的抵抗力，从而增加组织的力学强度。
[0013]该反应具有专一性、高效性的特点;酶催化反应作为一种常见的生理现象，在局部 组织使用产生的组织损伤较小;使用酶催化反应，其所需的设备简单，操作简单，具有推广 价值。
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[0016] 角膜基质的主要组成部分，占角膜全厚的90%以上，是角膜力学结构稳定的主要 因素。其包括200-250层平行排列的纤维小板，主要成分为I型胶原纤维。I型胶原纤维是包 括两条a I (I)肽链和一条a2 (I)肽链的螺旋结构的大分子蛋白，其中a I (I)肽链的1464个氨 基酸中，包括赖氨酸57个(5.24% )，谷氨酸75个(6.94% )，α2(Ι)肽链的1366个氨基酸中，包 括赖氨酸50个(4.95% )，谷氨酸66个(6.58% )。故总体上看，角膜基质具有5 %以上的赖氨 酸和谷氨酸，可以成为TGase催化反应的底物。
【发明内容】
[0017] 本发明的目的是针对上述现有治疗圆锥角膜技术的不足，提供一种可以明显加强 角膜力学性质的生物制剂，尤其是一种含有转谷氨酰胺酶的生物制剂在加强角膜力学性质 方面的应用，转谷氨酰胺酶可以催化角膜基质中的赖氨酸和谷氨酸的交联反应，使角膜可 以达到有效交联，力学性质得到明显加强。
[0018] 本发明一方面提供一种用于加强角膜力学性质的生物制剂，