用作抗增殖剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶抑制剂的化合物的制作方法

专利名称：用作抗增殖剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶抑制剂的化合物的制作方法
背景技术：
本发明涉及下面定义的式I化合物，它能抑制甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(GARFT)。本发明还涉及含有式I化合物的药物组合物，以及将它们用于抑制GARFT和用于抑制高级生物体或微生物如细菌，酵母菌和真菌的生长和增殖。本发明还涉及这些化合物的制备以及用于制备它们的中间体。
GARFT是在从头生物合成嘌呤途径中的叶酸酯依赖酶。该途径对细胞分裂和增殖是决定性的。已知，封闭这条途径对抗增殖，特别是对抗肿瘤是有效的。因此，人们合成了大量叶酸酯类似物并研究它们对GARFT的抑制能力。已有报道，一种GARFT特定原型紧密结合抑制剂5，10-二脱氮四氢叶酸(dideazatetrahydrofolic acid)(DDATHF)表现了抗肿瘤活性。参见F.M.Muggia的“抑制从头合成嘌呤的叶酸酯抗代谢抑制剂”[刊登在New Drugs，Concepts and results in Cancer Chemo therapy，由Kluwer academic Publisher出版，Boston(1992)，65-87]这些大量的抗增殖剂包括抗代谢化合物。已知作为抗叶酸酯或抗叶酸的抗代谢化合物的一个具体小类是维他命叶酸的拮抗剂。典型地，抗叶酸酯与叶酸的结构非常相似，而且包括叶酸的特征性谷氨酸对苯甲酸酯部分。叶酸的谷氨酸酯部分在生理pH处有一个双负电荷，而且，这个化合物及其类似物具有一种驱使传输系统通过细胞膜并发挥代谢能力的活动能量。对大量被调查者的研究表明，叶酸有其还原和氧化两种形式，而且，其类似物被至少两种不同的传输机理能动地传入细胞。这些传输蛋白质称作还原叶酸酯传输蛋白，它们偏爱还原叶酸酯，但会传输大量叶酸衍生物。氨甲蝶呤(MTX)就是通过还原叶酸酯传输系统传输的。其它的叶酸酯传输蛋白被称作膜叶酸酯结合蛋白或mFBP，它偏爱叶酸。参见A.C.Antony的“叶酸酯受体的生物化学研究”[刊登在Blood，The Journal of theAmerican Society of Hematology，Vol.79(1992)，2807-2820]今天，含抗癌谷氨酸的抗叶酸酯已被用于临床，其中包括MTX，除了一个明显例外之外，MTX通过还原叶酸酯传输系统进入细胞。5，10-二脱氮四氢叶酸(DDATHF)是目前正在进行临床研究的抗肿瘤GARFT抑制剂。已经表明，DDATHF经还原叶酸酯传输系统和mFBP送入细胞。参见G.Pizzorno等人的“5，10-Dideazatetrahydrofolic Acid(DDATHF)Transport in CCRF-CEM and MA104 Cell Lines”[刊登在The Journal ofBiological Chemistry，Vol，268(1993)，1017-1023]。
人们认为，不必要的毒性，特别是对缺叶酸酯的哺乳动物，与DDATHF(现有技术中的GARFT抑制剂)对mFBP具有强亲和力有关，DDATHF在叶酸酯匮乏期间是未调整的。人们还认为，叶酸和其它阻断mFBP传输其它GARFT抑制剂的分子能够减少这些抑制剂的毒性。参见，例如，T.Alati等人的“Evaluation of the Mechanism(s)of Inhibition of the toxicity，But not the Antitumor Activity of Lometrexol(DDATHF)by Folic Acid”[刊登在proceedings of the American Association for Cancer Research，Vol.33(1992)，Abstract 2432，407]；L.L.Habeck等人的“A Novel class ofMonoglutamated Antifolates Exhibits Tight-Binding Inhibition of HumanGlycinamide Ribonucleotide Formyltransferase and Potent Activityagainst solid tumors”[刊登在Cancer Research，Vol.54(1994)，1021-1026]；以及Grindey等人的美国专利5,217,974号。
发明概述本发明的一个目的是制备具有低毒性的高效GARFT抑制剂的化合物。该目的已经通过式I抗增殖剂实现，它是高效GARFT抑制剂，但并不与mFBP紧密结合。这些化合物优选具有对mFBP的结合常数至少比对DDATHF小1000倍，而且还能保持所需要的GARFT抑制性和与抗肿瘤活性有关的还原叶酸酯的传输。
如上所述，本发明化合物具有抗增殖活性，该性质可以抗肿瘤活性的形式表示。本发明化合物可以本身是活性的，或作为前体在体内可转化成活性化合物。本发明优选化合物是在抑制GARFT酶方面具有特别活性。特别优选的化合物是具有抑制L1210细胞线(一种可以在组织培养中生长的鼠白血病细胞)生长的活性。本发明化合物还具有抑制细菌如可在培养基中生长的大肠埃希氏革兰氏阴性菌生长的活性。
本发明化合物及其药物上可接受的盐可以被制成方便的剂型，如囊剂，片剂和可注射用制剂。其中可以使用药物上可接受的固体或液体载体，稀释剂或赋形剂。
固体载体包括淀粉，乳糖，硫酸钙二水合物，石膏粉，蔗糖，滑石，明胶，琼脂，果胶，金合欢，硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油盐水溶液和水。
载体或稀释剂可包括任何缓释材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，单独使用或与蜡一起使用。当使用液体载体时，制剂可以是糖浆，酏剂，溶剂，软明胶胶囊，消毒注射液(比如溶液)或非水或水悬浮液。
本发明药物制剂是依照药物化学中常规技术制备的，包括混合，制粒或压片(如果是制成片剂的话)，或混合，填充及将各种成份溶解成适当形式，以制成所需的口服，肠外，局部，阴道内，鼻内，支气管内，眼内，耳内或直肠内给药的制剂形式。
本发明组合物还可以进一步包含一或多种其它药物活性化合物。例如，下列抗肿瘤药之一可以包含在本发明组合物中丝分裂抑制剂(如长春碱)；烷基化剂；二氢叶酸酯还原酶抑制剂或TS抑制剂；抗代谢药(如5-氟尿嘧啶，阿糖胞苷)；插入抗菌素(如阿霉素，争光霉素)；酶(如天冬酰胺酶)；局部异构酶抑制剂(如鬼白乙叉甙)；及生物反应修饰因子(如干扰素)。本发明化合物还可以与一或多种抗增殖剂或GARFT抑制剂结合使用，如在普通转让的国际公开WO 94/13295(公布于1994年6月23日)或国际公开WO 92/05153(公布于1992年4月2日)中所述的化合物，这些公开物在这里被引作参考。本发明组合物还可以含有一或多种抗菌药，杀真菌药，抗寄生虫药，抗病毒药，治牛皮癣药或杀球虫药(anticoccidial)。抗菌药的实例包括磺胺类药，如磺胺甲基异口恶唑(新诺明)，磺胺嘧啶，磺胺对甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶；二氢叶酸酯还原酶抑制剂如甲氧苄氨嘧啶，bromodiaprim和曲麦克特(trimetrexate)；青霉素；先锋霉素；及喹啉酮羧酸和它们稠合的异噻唑类似物。
本发明另一方面涉及抑制高级生物体或微生物体细胞增殖或生长的治疗方法，包括给宿主服用有效量或一定量的本发明化合物。本发明化合物特别适用于治疗哺乳动物宿主如人类宿主，和治疗鸟类宿主。特别优选的治疗方法是给宿主服用有效抑制GARFT量的本发明化合物。
这里所述多种抗增殖化合物及其药物上可接受的盐可以用于本发明的治疗方法。这些化合物可以含有上述稀释剂或载体的药物上可接受的组合物形式给药。
组合物的剂量应至少含有有效量的活性化合物，并且优选制成一或多个药物剂量单位。“有效量”指足以抑制叶酸酯的代谢途径的量，并且，例如，经过一个或多个药剂单位便可得到有利效果。
对脊椎动物宿主日服剂量的实例为每公斤宿主体重最多1克活性化合物，优选每公斤宿主体重1/2克，更优选100毫克，最优选约50毫克或更少。所选剂量可以给暖血动物或哺乳动物，如需要进行抑制叶酸酯代谢途径的病人，通过适当的给药方法给药，包括局部给药，例如用油膏或乳膏；口服给药；直肠给药，例如用栓剂；通过注射进行肠外给药；或通过阴道内，鼻内，支气管内，耳内或眼内输液给药。
本发明化合物具有任何一种或多种如下所述的作用，如抗增殖作用，抗菌作用，抗寄生物作用，抗病毒作用，抗牛皮癣作用，抗原生动物作用，抗球虫作用，消炎作用，自身免疫抑制作用和杀真菌作用。本发明化合物尤其适用于在患有肿瘤的脊椎动物宿主身上产生抗肿瘤作用。
本发明详述和优选实例特别地，本发明涉及式I化合物， 其中A是硫，CH2或硒；Z是取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3链烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基，取代的或未取代的氨基，硫或氧；X是取代的或未取代的C1-C6烷基；取代的或未取代的C2-C6链烯基；取代的或未取代的C2-C6炔基；-C(O)E，其中E是氢，取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3链烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基，取代的或未取代的OC1-C3烷氧基，或NR10R11，其中R10和R11分别为氢，取代的或未取代的C1-C3烷基，取代的或未取代的C2-C3链烯基，取代的或未取代的C2-C3炔基；NR10R11，其中R10和R11分别定义如上；羟基；硝基；SR12，其中R12是氢，取代的或未取代的C1-C6烷基，取代的或未取代的C2-C6链烯基，或取代的或未取代的C2-C6炔基；氰基；或取代的或未取代的O(C1-C3)基；及R1和R2分别为氢，或者是与相连的CO2形成易水解酯基的部分。
本发明还涉及式I化合物的药物上可接受的盐。
虽然式I化合物被表示为4-氧形式，而且在整个说明书中都如此表示，该氧基以与相应的4-羟基互变异构平衡的形式存在。因此，式I化合物被认为包括结构式所示4-氧及其互变异构4-羟基形式。因此，本发明还涉及式I所示化合物的4-羟基互变异构体的药物上可接受的盐。
式I化合物是非对映的混合物形式。应该理解，除非另有说明，有手性中心的化合物为非对映体混合物形式。
优选A是硫或CH2。
如果Z是被取代的，取代基优选C1-C6烷氧基，C1-C6烷基和C2-C6链烯基如乙链烯基，C2-C6炔基，酰基如甲酰基和乙酰基，卤素，氨基，羟基，硝基，巯基，单环碳环，单环杂环，非稠合多环碳环，非稠合多环杂环，羟基C1-C6烷基如羟甲基，及C1-C6烷氧基C1-C6烷基。优选地，Z是CH2，CH2CH2，NH，氧，硫，CH(CH2OH)或NCH3。更优选地，Z是CH2。
如果X是被取代的，取代基优选OH，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。优选地，X是取代的或未取代的C1-C6烷基。还有，X优选未取代的。X更优选是甲基或乙基。
优选地，R1和R2分别是氢，C1-C6烷基，羟基烷基，烷基芳基或芳烷基。更优选地，R1和R2分别是氢或C1-C2烷基。
在特别优选的实例中，A是硫或CH2，Z是CH2，X是甲基。
式I化合物的优选实例包括N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]-嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸；N-(5-[2-(2-氨基-4-氧-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]-噻嗪-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸二乙酯；及N-(5-[2-(2-氨基-4-氧-4，6，7，8-四氢-3H-嘧啶并[5，4-6][1，4]-噻嗪-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-L-谷氨酸。
式I化合物被用作GARFT抑制剂。其中R1和R2分别是氢的式I化合物尤其被用作活性抗肿瘤或抗增殖剂。其中R1和R2分别与相连的羧基，优选乙基，形成易水解酯基部分的式I化合物被用作形成游离谷氨酸形式的化合物的中间体，并且可以在体内水解，因此被用作药物前体。
本发明药物上可接受的盐包括，例如，本发明谷氨酸化合物的碱金属盐，碱土金属盐，其它无毒金属盐，铵盐和取代的铵盐。所说盐的实例包括游离酸化合物的钠，钾，锂，钙，镁，吡啶金翁和取代的吡啶金翁盐。
本发明式I化合物可如下制备。
为了制备其中Z是CH2的式I化合物，用式II化合物作起始原料， 其中R是卤素，优选溴；X如上定义；B是OH或氨基酸，优选谷氨酸二乙酯，通过与氨基部分连接形成酰胺，或通过与C1-C6醇，优选甲醇和乙醇等醇部分连接形成酯。
式II化合物与式III化合物反应， 其中Y是CH2OH或被保护的式IV吡啶并嘧啶， 然后，根据Y是被保护的吡啶并嘧啶还是CH2OH，选择两种方法之一进行合成。
当式IV中的Y是被保护的吡啶并嘧啶或CH2OH时，式II和III化合物的偶合反应优选在过渡金属催化剂，优选钯或镍，和碱，优选非亲核辅助碱存在下，在溶剂中进行，在该溶剂中至少有一种反应物至少部分可溶。式II和III化合物的偶合反应中的优选溶剂是二乙胺，乙腈，二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺和三乙胺。偶合反应中的碱性介质优选由非亲核辅助碱提供，它们能够中和由偶合反应产生的氢卤酸。该碱优选二-或三-烷基胺，如二乙胺，三乙胺或二异丙基乙胺。如果需要，碱性溶剂可用来代替单独溶剂和碱。
如果Y是吡啶并嘧啶，式II和III化合物的偶合反应生成式V化合物， 其中X，R1和R2定义如上。
式V化合物与氢气反应，优选在45-1000psi压力下，在适当过渡金属催化剂，优选在炭或其它适当载体上的铂，钯或铑金属存在下，在适当溶剂，优选乙酸或三氟乙酸中进行，得到式VI化合物， 其中X，R1和R2定义如上。
最后，式VI化合物被水解形成一个游离谷氨酸(R1和R2分别为氢)的式I化合物。
如果Y是CH2OH，式II和III化合物反应生成式VII化合物， 其中X和B定义如上。
式VII化合物与氢气在适当金属催化剂，优选钯或铂，存在下反应，得到式VIII化合物， 其中X和B定义如上。
式VIII化合物与一种氧化剂，优选四丙基高钌酸铵反应，得到式IX化合物， 其中X和B定义如上。
式IX化合物与亚甲基转移试剂，优选亚甲基三苯基正膦，在适当溶剂，优选四氢呋喃中反应，得到式X化合物， 其中X和B定义如上。
式X化合物与二羟基化试剂，优选四氧化饿，在适当氧化剂，优选N甲基吗啉-N-氧化物存在下反应，得到式XI化合物， 其中X和B定义如上。
用下述四种方法中的任何一种将式XI化合物转变成式I化合物。
在第一种转变方法中，式XI化合物与磺酰化试剂，优选对甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氨，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺存在下反应，得到中间体单磺酰化合物。然后，该中间体与强碱，优选氢化钠反应，得到式XII化合物， 其中X和B定义如上。
式XII环氧化物与含氮亲核物，优选叠氮化钠，在中等强度路易斯酸催化剂，优选高氯酸锂或高氯酸镁存在下反应，得到中间体醇叠氮化物(alcohol azide)。醇叠氮化物的还原反应优选与氢气，在金属催化剂存在下反应，接着与适当氮保护基，优选叔丁氧羰基，苄氧羰基或苄基进行保护反应，生成式XIII化合物， 其中X和B定义如上，R4和R5分别为氢或适当氮保护基。优选的保护基是叔丁氧羰基，苄氧羰基或苄基。
式XIII化合物与酰化剂或磺酰化试剂，优选甲磺酰氯或对甲苯磺酰氯，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺存在下，在适当的至少能使一种反应物至少部分溶解的溶剂中反应，得到活化羟基。该活化羟基被适当亲核物，优选硫代酸盐，更优选被硫代乙酸钾替代，得到式XIV化合物， 其中A，X，B，R4和R5定义如上，Ac是酰基，优选乙酰基。
或者，可以用三苯膦，叠氮二羧酸二乙酯或二甲酯，和酸性亲核物，优选硫代乙酸，在适当溶剂中进行化学反应，将式XIII化合物转化成式XIV化合物。
将式XIV化合物在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中，在烷基化剂，优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯存在下，用亲核碱，优选碳酸钾，碳酸钠，氢氧化钠或氢氧化钾处理，得到式XV化合物， 其中A，X，B，R4和R5定义如上，每个R6分别是氢或与相连的CO2形成易水解酯基的部分。优选地，R6是C1-C6烷基，羟基烷基，烷基芳基或芳烷基。更优选地，R6是C1-C2烷基。
将式XV化合物在适当条件下处理，除去R4或R5或将这两个保护基都除去，得到式XVI化合物， 其中A，X，B和R6定义如上。如果用叔丁氧羰基作保护基，适当的条件是指用三氟乙酸处理，接着进行中和反应。
式XVI化合物与烷基化剂，优选三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁，在适当溶剂，优选二氯甲烷中反应，形成中间体内酰亚胺醚。中间体内酰亚胺醚在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中与胍反应，形成式XVII化合物， 其中A，X和B定义如上。
或者，通过式XVI化合物与硫化试剂，优选P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二正膦-2，4-二硫化物反应，将式XVI化合物转化成式XVII化合物，形成硫代内酰胺中间体。然后，该中间体用烷基化剂，优选碘甲烷或三甲基或三乙基四氟硼酸氧鎓进行烷基化，然后在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中，与胍反应，得到式XVII化合物。
如果B是醇功能团，即如果与B相连形成酯基，则式XVII化合物在碱性条件下被水解，形成式XVIII化合物， 其中A和X定义如上。
用本领域普通技术人员熟知的方法将式XVIII化合物与谷氨酸二酯盐酸盐进行肽偶合，生成式XIX的二酯化合物， 其中，除了R1和R2不能是氢以外，A，X，R1和R2定义如上。
最后，如果需要谷氨酸形式，则将式XIX化合物水解成式I化合物形式。
在第二个转化方法中，式XIV化合物如上所述制备。该化合物用酸处理，优选三氟乙酸，盐酸或对甲苯磺酸，除去所有保护基(R4，R5和Ac)， 其中，A，X和B定义如上。
式XX化合物在弱碱性缓冲剂条件下，优选用pH7磷酸盐缓冲剂，在适当溶剂，优选乙醇或甲醇中，与式XXI化合物反应， 得到式XVII化合物。第二方法的其余部分是用类似于上面所述的方法，从式XVII化合物得到式I化合物。
在第三个转化方法中，式XI化合物与适当的羟基保护基，优选三烷基甲硅烷基，更优选叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物，在中等非亲核碱，优选三乙胺的存在下反应得到式XXII化合物， 其中X和B如上定义，R7为适当的羟基保护基，优选三烷基甲硅烷基。
然后将式XXII化合物与酰化试剂或磺酰化试剂，优选甲烷磺酰氯或对甲苯磺酰氯，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺的存在下，在适当的溶剂(至少一种反应物之一部分溶解在该溶剂中)中反应得到活化的羟基。用适当的亲核试剂，优选硫代酸盐，更优选硫代乙酸钾置换活化羟基得到式XXIII化合物， 其中A，X，B，R7和Ac如上定义。
或者，将式XXII化合物在一种化学操作中用三苯膦或叠氮二羧酸二乙酯或二甲酯和适当酸性亲核试剂，优选硫代乙酸，在适当的溶剂中转化为式XXIII化合物。
式XXIII化合物与亲核碱或中等酸反应选择性除去在A部分上的酰基。将得到的中间体与式XXIV， 在非亲核碱，优选三乙胺，二异丙基乙胺或碳酸钾存在下反应得到式XXV化合物， 其中A，X，B和R7如上定义。
用适当的试剂处理除去式XXV化合物上的保护基R7得到式XXVI化合物， 其中A，X和B如上定义。当R7为三烷基甲硅烷基时，上述试剂优选为氟盐，更优选氟化钾，四丁基氟化铵或氟化铯。
通过用活化试剂活化羟基，优选与甲磺酰氯反应，随后用碱处理，将式XXVI环合得到式XVII化合物。或者，将嘧啶酮的氮用适当保护基，优选叔丁氧羰基保护，然后环合并在酸性条件下除去保护基。本方法的其余部分是用类似于上面所述从式XVII化合物得到式I化合物的方法进行。
在第四个优选的转化方法中，式XXVI的醇化合物的制备如上所述。该醇与适当的氧化剂反应产生醛功能基，该醛功能基可以环合为式XXVII化合物， 其中A，X和B如上定义。
式XXVII化合物与还原剂，优选氰基硼氢化钠，在路易斯酸，优选三氟化硼醚合物存在下反应，得到上面定义的式XVII化合物。本方法的其余部分是用类似于上面所述方法从式XVII化合物得到式I化合物。
其中Z不是CH2的式I化合物可以用类似于其中Z是CH2的制备方法制备。特别是，其中Z不是CH2的式I化合物可以用式XXXIV链烯制备， 其中X和R6定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
如果Z是硫，氧或取代的或未取代氨基，式XXXV化合物被烷基化， 其中X和R6定义如上，Z是硫，氧或取代的或未取代氨基。烷基化反应可以用烯丙基卤化物，优选烯丙基溴化物，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺存在下完成，得到式XXXIV化合物。
如果Z是取代的或未取代C1-C2烷基而不是CH2，取代的或未取代C2-C3链烯基，或取代的或未取代C2-C3炔基，式XXXIV化合物可通过将式XXXVI醛链烯化来制备， 其中X和R6定义如上，Z是取代的或未取代C1-C2烷基而不是CH2，取代的或未取代C2-C3链烯基，或取代的或未取代C2-C3炔基。式XXXVI醛可用类似下列文献所述方法制备Chuan Shih et al.，Journal ofMedicinal Chemistry，vol.35(1992)，1109-1116。醛的链烯化反应可用亚甲基转移剂，优选亚甲基三苯膦完成。
式XXXIV化合物与二羟基化剂，优选四氧化锇，在适当氧化剂，优选N-甲基吗啉-N-氧化物存在下反应，得到式XXXVII化合物， 其中X和R6定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
式XXXVII化合物与磺酰化试剂，优选对甲苯磺酰氯或甲烷磺酰氯，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺的存在下，产生中间产物单磺酰化化合物。该中间产物与强碱，优选氢化钠反应，生成式XXXVIII化合物， 其中X、R6如上定义，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
式XXXVIII环氧化物与含氮亲核物，优选叠氮化钠，在弱路易斯酸催化剂，优选高氯酸锂或镁存在下反应，得到中间体醇叠氮化物。将该中间体还原，优选用氢气，在金属催化剂存在下进行，接着用适当氮保护基，优选叔丁氧羰基，苄氧羰基或苄基进行保护，生成式XVII’化合物， 其中X，R6，R4和R5定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
然后，式XVII’化合物与酰化剂或磺酰化剂，优选甲烷磺酰氯或对甲苯磺酰氯，在非亲核碱，优选三乙胺或二异丙基乙胺存在下，在适当的能使至少一种反应物至少部分溶解的溶剂中反应，得到活化羟基。该活化羟基被适当亲核物，优选硫代酸盐，更优选硫代乙酸钾置换，得到式XVIII’化合物， 其中A，X，R6，R4，R5和Ac定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
或者，用三苯膦，氮杂二羧酸二乙酯或二甲酯和酸性亲核物，优选硫代乙酸，在适当溶剂中，通过某种化学操作将式XVII’化合物转变成式XVIII’化合物。
式XVIII’化合物用亲核碱，优选碳酸钾，碳酸钠，氢氧化钠或氢氧化钾，在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中，在烷基化剂，优选氯代丙二酸二甲酯或二乙酯存在下处理，得到式XIX’化合物， 其中A，X，R6，R4和R5定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。在适当条件下处理式XIX’化合物，除去保护基R4和R5，生成式XX’化合物， 其中A，X和R6定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
如果保护基是叔丁氧羰基，则除去该保护基的适当条件优选用三氟乙酸处理，然后进行中和，生成式XX’化合物。
式XX’化合物与烷基化剂，优选三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁，在适当溶剂，优选二氯甲烷中反应，形成中间体内酰亚胺醚。该中间体内酰亚胺醚与胍在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中反应，形成式XXI’化合物， 其中A，X和R6定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。
或者，通过式X’化合物与硫化剂，优选P2S5或2，4-二(4-甲氧基苯基)-1，3-二硫-2，4-二膦-2，4-二硫化物反应，形成中间体硫代内酰胺，将式XXI’化合物转化成式X’化合物。然后，用烷基化剂将其烷基化，优选的烷基化剂是甲基碘或三甲基或三乙基四氟硼酸氧金翁。然后，在醇溶剂，优选甲醇，乙醇或异丙醇中与胍反应，得到式XXI’化合物。
在碱性条件下将式XXI’化合物水解，形成式XXII’化合物， 其中A和X定义如上，除了Z不是CH2外，Z如上面式I中定义。如果式XXI’化合物中的R6是氢，则不需要水解反应，式XXI’化合物如下所述被肽偶合。
可用本领域普通技术人员熟知的方法，将游离羧酸形式的式XXII’化合物(如果R6是氢，则为式XXI’化合物)与谷氨酸二酯盐酸盐进行肽偶合，形成式XXIII’二酯， 其中A和X同式XXII’中定义，R1和R2分别为与相连的CO2形成易水解酯基的部分，如C1-C6烷基，羟基烷基，烷基芳基或芳烷基。
最后，如果需要游离酸形式，可将式XXIII’水解成其中R1和R2分别为H的式I化合物。
制备式I化合物的详细实例提供如下。
(C29H33N5O7S.0.75H2O)C，H，N，S.e.N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯 将N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(959mg，1.6mmol)和10％钯炭(1.5g，150％wt.eq.)的三氟乙酸(30ml)悬浮液在50psi H2中振荡22小时。粗反应混合物用CH2Cl2稀释，用Celite(硅藻土)滤垫过滤并真空浓缩。将所得剩余物溶解于CH2Cl2(120ml)，用饱和NaHCO3(2×100ml)洗涤，Na2SO4干燥并真空浓缩，得到一种棕色胶。经快速色谱纯化，用CH2Cl2∶CH3OH(49∶1)洗脱，生成一种橙色固体(772mg，产率80％)。分析结果表明，该产物为N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯。
NMR(CDCl3)δ8.60(1H，d，J＝2.2Hz)，8.49(1H，宽峰)，8.32(1H，d，J＝2.2Hz)，7.22(1H，s)，6.78(1H，d，J＝7.5Hz)，4.72(1H，ddd，J＝4.8，7.5，9.5Hz)，4.23(2H，q，J＝7.1Hz)，4.11(2H，q，J＝7.1Hz)，3.12-3.00(4H，m)，2.52-2.41(2H，m)，2.37-2.22(1H，m)，2.16-2.04(1H，m)，2.02(3H，s)，1.33(9H，s)，1.29(3H，t，J＝7.1Hz)，1.23(3H，t，J＝7.1Hz).分析.(C29H37N5O7S.0.5H2O)C，H，N，S.f.N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯
将N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(2.98g，5mmol)和10％钯炭(1.5g，50％wt.eq.)和PtO2(1.5g，50％wt.eq.)的三氟乙酸(170ml)悬浮液在800psi H2中摇动40小时。粗反应混合物用CH2Cl2稀释，用硅藻土滤垫过滤并真空浓缩。将所得剩余物溶解于CH2Cl2(150ml)，用饱和NaHCO3(2×150ml)洗涤，Na2SO4干燥并真空浓缩，得到一种棕色树脂。经快速色谱纯化，用CH2Cl2∶CH3OH(24∶1)洗脱，开始得到一种未反应的作用物(1.42g，产率48％)，然后生成黄色固体(293mg，产率10％)。分析结果表明，该产物为N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯。NMR(CDCl3)δ7.24(1H，s)，6.75(1H，d，J＝7.6Hz)，5.57(1H，broad)，4.72(1H，ddd，J＝4.8，7.6，12.6Hz)，4.22(2H，q，J＝7.1Hz)，4.11(2H，q，J＝7.1Hz)，3.43-3.36(1H，m)，3.06-2.98(1H，m)，2.89-2.68(3H，m)，2.52-2.40(3H，m)，2.37-2.23(1H，m)，2.15(3H，s)，2.14-2.03(1H，m)，1.94-1.83(1H，m)，1.73-1.63(2H，m)，1.32 (9H，s)，1.29(3H，t，J＝7.1Hz)，1.23(3H，t，J＝7.1Hz).分析(C29H41N5O7S.0.5H2O)C，H，N，S.g.N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸(化合物1)将N-(5-[(2-[新戊酰氨基]-4(3H)-氧5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸二乙酯(293mg，0.5mmol)的1N NaOH(25ml)溶液在室温搅拌90小时，然后用6NHCl中和。过滤收集沉淀，用水(4×100ml)洗涤，得到黄色固体(63mg，产率28％)。分析结果表明，该产物为N-(5-[2-(2-氨基-4(3H)-氧-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)乙基]-4-甲基噻吩-2-基)-谷氨酸。
NMR(DMSO-d6)δ12.44(2H，宽峰)，9.89(1H，宽峰)，8.42(1H，d，J＝7.8Hz)，7.57(1H，s)，6.39(1H，brs)，6.12(2H，br s)，4.30(1H，ddd，J＝4.8，7.8，9.6Hz)，3.26-3.18(2H，m)，2.83-2.74(3H，m)，2.31(2H，t，J＝7.4Hz)，2.12(3H，s)，2.09-2.01(1H，m)，1.94-1.80(2H，m)，1.68-1.47(3H，m).分析(C20H25N5O6S.1.1H2O)C，H，N，S.生物和生化评价GAR甲酰转移酶抑制常数的测定修改并采用的Young等人(Biochemistry 23(1984)，3979-3986)的GAR-甲酰转移酶(GARFT)测定方法如下所述。
反应混合物中含有人体GARFT催化域，0-250nM试验化合物，20μM甘氨酰胺核苷酸(GAR)，10或20μM N10-甲酰基-5，8-二脱氮叶酸酯(FDDF)，50mM HEPES-KOH(pH7.5)和50mM KCl。该反应从添加酶开始，到最后浓缩为11nM，然后在20℃监测294nm处吸收度的增加情况(e294＝18.9mM-1cm-1)。
GARFT抑制常数(Ki)是由稳定状态催化率对抑制剂的依赖性和底物浓度来测定的。所观察到的抑制类型取决于与FDDF的竞争，通过表观Ki(Ki，app)对FDDF浓度的依赖性来确定抑制赖类型，它们之间的这种关系可以用下式表示Ki，app＝Ki+(Ki/Km)[FDDF]FDDF的Michaelis常数Km独立地由催化率对FDDF浓度的依赖性测定。通过对Michaelis方程或近似竞争抑制情况下的Michaelis方程进行非线性拟合，得到Km和Ki数据。对紧密结合抑制作用所得数据进行分析，并用非线性方法对该数据进行Morrison紧密结合方程的拟合(BiochemBiophys Acta 185(1969)，269-286)，得到Ki。人体叶酸酯结合蛋白离解常数的测定人体叶酸酯结合蛋白(FBP)的离解常数(Kd)的测定是以竞争结合测定方式，用由培养的KB细胞制备的FBP缔合膜测定的。KB细胞膜(部分)的制备将粘连的KB细胞从烧瓶上刮下，用冰冷的PBS冲洗一次，然后在4℃以5000×g离心5分钟。将细胞颗粒(2×108个细胞)重新悬浮于悬浮缓冲液(KH2PO4-KOH pH7.410mM EDTA10mM 2-巯基乙醇)，用声波短暂地振动一下以完成细胞团的裂解，并在4℃以12000×g离心10分钟。通过重新悬浮于20ml酸性缓冲液(KH2PO4-KOH pH3.510mM EDTA10mM 2-巯基乙醇)将内生结合叶酸酯从颗粒中剥离，然后离心同前。将细胞颗粒重新悬浮于20ml pH7.4的悬浮缓冲液中，并离心同前。再将颗粒重新悬浮于5ml无EDTA的pH为7.4的悬浮缓冲液中，用Bradford法以BSA为标准定量测定蛋白质含量。这种方法典型的产率是每2×108个细胞生成总共4-5mg膜蛋白。最后的悬浮液作为人体FBP缔合膜的来源。FBP竞争性结合的测定允许抑制剂与3H-叶酸竞争与FBP的结合能力。
将含有50-100mg含有3-6pmol(10-12摩尔)(3-6nM)FBP的细胞膜蛋白，17.25pmol3H-叶酸(17.25nM，0.5μCi)，各种浓度的竞争物和1ml50mM KH2PO4-KOH pH7.410mM 2-巯基乙醇的反应混合物在25℃进行反应。因为结合的3H-叶酸释放非常缓慢，所以在没有3H-叶酸时竞争物就已经预先结合了30分钟。然后加入3H-叶酸，并允许混合物平衡2.5小时。通过硝基纤维素过滤器真空抽滤全部反应混合物以收集带有结合的3H-叶酸的细胞膜，然后将收集的细胞膜用1ml反应缓冲剂洗涤4次。通过测量该硝基纤维素膜的闪烁计数测定结合的3H-叶酸的数量。所得数据用上述方法进行非线性拟合。3H-叶酸的FBP Kd——用于计算竞争物的Kd——是通过3H-叶酸对FBP的直接滴定，接着用所得数据对紧密结合Kd方程进行非线性拟合得到的。细胞线所用细胞线及其来源被列于表1。每个细胞线和生长条件和需要的培养基汇总于表2。所有培养保持在37℃，5％空气-CO2的潮湿培养皿中进行。体外生长抑制作用抑制物的Stock溶液在10mM碳酸氢钠水溶液中制成，然后以1ml等份存储于-20℃，进行细胞培养实验。用改进的Mosmann方法(J.Immunol.Methods65(1983)，55-63)测量细胞生长抑制性。
在由渗析的胎牛血清(Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)提供的新鲜RPMI生长基(Mediatech，Washington，DC)中，每个细胞线的对数中期细胞被稀释成18500个细胞/ml，然后等分到2列12个96孔微滴定盘中。第1列充满相同体积的135ml无细胞新鲜培养基，用作空白本底。然后将这些盘子放在37℃充有5％空气-CO2的培养器中。1-4小时后将盘子移出培养器，并加入10倍最终浓度的试验化合物，从第12列到第4列为两倍稀释度15ml/孔。对于相反的实验，所有药物溶液(最终浓度为175mM)中包含次黄嘌呤(1.75mM)或AICA(1.75mM)。对于各孔的试验化合物的浓度各盘之间依次为4倍关系。15毫升不含试验化合物的培养基被加到各盘的第1列。然后将细胞送回到培养器中，不间断地经过整个培养期。在第3天将L1210和L1210/CI920细胞，或在第5天将CCRF-CEM细胞，以及溶于组织培养基的50ml 0.8mg/ml MTT(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑全翁(Sigma分类号M2128)加到所有盘的每个孔中，之后将细胞放回培养器。4小时后从培养器中移出各盘，并以1200rpm离心7分钟。虹吸除掉培养基，并将150ml DMSO加到所有盘的每个孔中。将各盘于黑暗中和室温下在旋涡混合器上慢速混合1小时。用Molecular Devices VmaxTM动力微片计数器和分光光度分析法在540nm处测量代谢MTT的程度。抑制细胞生长50％(通过测量MTT代谢而得)所需的药物浓度由上述O.D.(扣除空白本底)与下面对照组O.D.(扣除空白本底)的50％之间的内推来确定。
表1用于体外研究的源组织和细胞线源细胞线 源 源组织L1210 ATCC# 鼠，淋巴白血病CCRF-CEM ATCC# 人，急性原始淋巴细胞白血病#ATCC＝美国典型物培养中心(American Type Culture Collection)表2用于微滴定测定的培养条件，盘密度和培养时间细胞线培养基 DFCS 盘密度 培养时间浓度*(％)(细胞/孔)(天)L1210RPMI-1640 52500 3CCRF-CEM RPMI-1640 10 2500 5*DFCS浓度＝渗析的胎牛血清浓度表3试验化合物和6R-DDATHF对生长抑制(连续暴露72小时)的比较数据L1210 CCRF-CEM人体叶酸酯化合物GARFT 细胞培养 细胞培养 结合蛋白Ki(nM) IC50(nM)aIC50(nM)aKd(nM)11.4 13.5 6.1 28DDATHFb25 17.5 1.5 0.020a平均IC50±标准偏差；b6R-DDATHF，5，10-二脱氮四氢叶酸(Lomeyrexol)(见F.M.Muggia，“Folate antimetabolites inhibitor to de novo purine synthesis”，New Drugs，Concepts and Results in Cancer Chemotherapy，KluwerAcademic Publishers，Boston(1992)，65 87)。
如上面比较数据所示，化合物1的叶酸酯结合蛋白Kd相对于6RDDATHF约小1400倍。
向搅拌的5-(3-羟基丙基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯(3.74g，17mmol)，N-甲基吗啉-N-氧化物(3.00g，26mmol)和粉末4(埃)分子筛(4.5g)的CH2Cl2(50ml)悬浮液中加入四丙基过钌酸铵(300mg，0.85mmol)。将所得悬浮液在室温搅拌40分钟，真空浓缩除去溶剂。剩余物经快速色谱纯化，用己烷∶EtOAc(4∶1)洗脱，得到的产物为黄色油(1.82g，产率49％)。分析结果表明，该产物为4-甲基-5-(3-氧丙基)噻吩-2-羧酸甲酯。NMR(CDCl3)δ9.83(1H，t，J＝0.8Hz)，7.50(1H，s)，3.84(3H，s)，3.07(2H，t，J＝7.4Hz)，2.83(2H，dt，J＝0.8，7.4Hz)，2.17(3H，s).分析.(C10H12O3S)C，H，Se.5-(3-丁链烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯 在0℃和氩气下向搅拌的甲基三苯基溴化磷金翁(3.14g，8.8mmol)的THF(50ml)悬浮液中加入2.5M正丁基锂的己烷溶液(3.4ml，8.5mmol)。将所得浆液在0℃搅拌10分钟，在室温搅拌75分钟，再冷却到-65℃，然后滴加4-甲基-5-(3-氧丙基)噻吩-2-羧酸甲酯(1.71g，8.1mmol)的THF(30ml)溶液。移去冷却浴，逐渐升至室温的同时搅拌反应物90分钟。将粗反应混合物真空浓缩至20ml，然后用乙醚(200ml)稀释，经硅藻土滤垫过滤。真空浓缩滤液，得到橙色油。经快速色谱纯化，用己烷∶EtOAc(95∶5)洗脱，得到的产物为黄色油(772mg，产率46％)。分析结果表明，该产物为5-(3-丁链烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯。
NMR(CDCl3)δ7.50(1H，s)，5.84(1H，ddt，J＝10.2，17.0，6.6Hz)，5.07(1H，dd，J＝1.6，17.0Hz)，5.02(1H，dd，J＝1.6，10.2Hz)，3.84(3H，s).分析(C11H14O2S)C，H，S.f.5-(3，4-二羟基丁基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯 向搅拌的N-甲基吗啉-N-氧化物(735mg，6.3mmol)和四氧化锇(5mg，0.02mmol)的丙酮(30ml)溶液中加入5-(3-丁链烯基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯(701mg，3.3mmol)的丙酮(20ml)溶液。将所得溶液在室温和氩气下搅拌48小时，然后经硅藻土滤垫过滤。加入0.5M H2SO4(10ml)使滤液酸化，真空浓缩除去丙酮。水性残余物用水(20ml)稀释，用EtOAc(3×25ml)萃取。合并的有机萃取液用水(3×25ml)洗涤，用Na2SO4干燥，真空浓缩得到棕色胶。经快速色谱纯化，用CH2Cl2∶EtOAc(2∶3)洗脱，得到的产物为乳白色固体(577mg，产率71％)。分析结果表明，该产物为5-(3，4-二羟基丁基)-4-甲基噻吩-2-羧酸甲酯。
NMR(CDCl3)δ7.50(1H，s)，3.84(3H，s)，3.79-3.72(1H，m)，3.86(1H，dd，J＝3.2，10.9Hz)，3.48(1H，dd，J＝7.4，10.9Hz)，3.00-2.80(2H，m).分析.(C11H16O4S)C，H，S.
上面实施例用以说明本发明各个方面。应该理解，本领域普通技术人员能力范围内的适当修改也属于本发明范围。
如果可能有化学问题，这里所列举的化学基团可以被替代。在某些情况下，例如取代或未取代C1-C3烷基会使这种可能性变得更明显。
如果一个以上的R6基团在任何通式中被列举，每一个R6可以从所给的可能性中独立地选择。
权利要求
1.式II化合物， 其中R是卤素；X是取代的或未取代的C1-C6烷基；及B是氨基酸或其衍生物，连到氨基部分形成酰胺。
2.权利要求1的化合物，其中R是溴。
3.权利要求1的化合物，其中X是被取代的，取代基选自OH，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。
4.权利要求1的化合物，其中X是未被取代的。
5.权利要求1的化合物，其中X是甲基或乙基。
6.权利要求1的化合物，其中B是谷氨酸二乙酯。
7.式VII化合物， 其中X是取代的或未取代的C1-C6烷基；及B是氨基酸，连到氨基部分形成酰胺，或C1-C6醇，连到醇部分形成酯。
8.权利要求7的化合物，其中X是被取代的，取代基选自OH，NH2，O-甲基，O-乙基，SH，SCH3和NH-甲基。
9.权利要求7的化合物，其中X是未被取代的。
10.权利要求9的化合物，其中X是甲基或乙基。
11.权利要求7的化合物，其中B是谷氨酸二乙酯，或甲醇或乙醇。
全文摘要
式(I)化合物—它们以4－羟基互变异构体的平衡物形式和非对映体的混合物形式存在—及其药物上可接受的盐是极好的甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶(GARFT)抑制剂。
文档编号C07D471/04GK1394857SQ0114273
公开日2003年2月5日 申请日期2001年12月5日 优先权日1994年7月28日
发明者M·D·瓦尔尼, W·H·罗米尼斯 申请人:阿格罗尼制药公司