复方氨基酸(15)双肽(2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种复方氨基酸（15）双肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算。该方法能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺含量，具有低廉、快速及灵敏度高的优点，通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸（15）双肽（2）注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。
【专利说明】复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺 含量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种氨基酸制剂的含量检测方法，特别是复方氨基酸（15)双肽⑵注 射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法。
【背景技术】
[0002] 复方氨基酸（15)双肽（2)注射液为15种氨基酸和2种二肽组成的灭菌水溶液， 处方为每 l〇〇〇ml 含有：L-丙氨酸（C3H7N02) 16. 00g，L-精氨酸（C6H14N402) 11. 30g，L-天冬 氨酸（C4H7N04)3.4g，L-谷氨酸（C 5H9N04)5 . 60g，L-组氨酸（C6H9N302)6.80g，L-异亮氨酸 (C 6H13N02) 5 . 60g，L-亮氨酸（C6H13N02)7 . 90g，L-赖氨酸醋酸盐（C6H14N202 · C2H402) 12. 70g， L_ 蛋氨酸（C5HnN02S) 5. 60g，L-苯丙氨酸（C9HnN02) 5 . 85g，L-脯氨酸（C5H9N02) 6. 80g， L_ 丝氨酸（C3H7N03) 4. 50g，L-苏氨酸（C4H9N03) 5. 60g，L-色氨酸（CnH12N202) 1. 90g，L-缬氨 酸（C5HnN02)7 . 30g，一水合甘氨酰谷氨酰胺（C7H13N304 · Η20)30· 27g，二水合甘氨酰酪氨酸 3. 45g(相当于甘氨酸0. 94g ;酪氨酸2. 28g)
[0003] 该产品含18种人体必须或非必须氨基酸组成的肠外营养注射剂，根据患者肠外 营养的需要提供相应的氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸三种氨基酸以甘氨酸-谷氨 酰胺、甘氨酰-酪氨酸的双肽形式存在。两种双肽（甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸） 用于提供谷氨酰胺和酪氨酸以促进蛋白质的合成，在体内直接完全分解为甘氨酸、谷氨酰 胺、酪氨酸三种游离氨基酸。
[0004] 由于复方氨基酸（15)双肽（2)注射液中成分复杂，对其各组分进行定量分析较为 困难。现有技术如中国专利CN103134892A公开了复方氨基酸（15)双肽（2)注射液的分析 方法，采用高效液相色谱检测方法，色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反 相色谱柱检测，检测波长为265-280nm，流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为甲 醇，流动相B是通过缓冲溶液调节的pH值2. 0-4. 0的水溶液，但此方法只是测定的色氨酸 和甘氨酰-酪氨酸的含量；叶晓林等人在《复方氨基酸（15)双肽（2)注射液中两组分的含 量测定》（中国药业，2008年07期）中报道了用反相高效色谱法测定氨基酸（15)双肽（2) 注射液中两种多肽，即甘氨酰-谷氨酰胺（GQ)和甘氨酰-酪氨酸（GY)的含量，该文献公开 的方法，使用乙腈与〇. 〇5mol/L的磷酸二氢钠溶液作为流动相，采用了梯度淋洗法，并且还 采用了 FDNB进行了柱前衍生化处理，该方法检测方法复杂，操作步骤多，而且不能同时检 测出十五中氨基酸的含量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种复方氨基酸（15)双肽（2)注射 液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷 氨酰胺含量，具有低廉、快速及灵敏度高的优点，通过周密的方法学验证，结果表明可用于 同时检测复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品 中十七种主药含量的变化。
[0006] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基 酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带 磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进 行梯度洗脱与再生平衡，以及衍生试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm 和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面积计算；
[0007] 其中，所述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11. 8g、柠檬酸6. 0g、乙醇 65ml、37%的盐酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2?4 ;
[0008] 所述流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19. 6g、氢氧化钠3. lg、硼酸 5. 0g、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10?11 ;
[0009] 所述再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTAO. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻 度；
[0010] 所述衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL。
[0011] 作为优选方案，所述流动相缓冲液A的pH为3. 45,流动相缓冲液B的pH为10. 85。
[0012] 作为优选方案，所述方法包括以下步骤：
[0013] S1.制备被测样品溶液：精念'称取被测样品5ml，直于50ml各量瓶中，用样品稀释 液定容至刻度，摇匀；再精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述 样品稀释液为取36%盐酸1. 5ml稀释至1000ml ;
[0014] S2.制备对照品溶液：精患、称取对照品，用样品稀释液制成每lml中含有门冬氣 酸0· 34mg、谷氨酸0· 56mg、丝氨酸0· 45mg、组氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸 1. 13mg、苏氨酸0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、缴氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、异 亮氨酸〇. 56mg、亮氨酸0. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸赖氨酸1. 27mg的对照品溶液；所述 样品稀释液为取36%盐酸1. 5ml稀释至1000ml ;
[0015] S3.上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20 μ 1注入色谱 仪，通过流动相缓冲液A、Β和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生 试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法 以峰面积计算；
[0016] 其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高 温反应器温度为：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止时间：47min ;采集时间： 50min ;流动相缓冲液A的流速：0. 45ml/min ;流动相缓冲液B的流速：0. 45ml/min ;再生液 的流速：〇. 45ml/min ;氨基酸分析柱温：57?74°C。
[0017] 所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含量（％) =(供试品溶液峰面积 /标准品溶液峰面积）X 100%。
[0018] 本发明中测定的氨基酸为：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬 氨酸、甘氨酰谷氨酰胺（简称GQ)、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、醋酸赖 氨酸、精氨酸。
[0019] 本发明具有以下优点：本发明使用普通的磺酸基强酸性阳离子交换树脂为色谱柱 填充剂，设备要求不高，流动相选用两个介质普通易得，可行性高，操作过程简单方便，重复 性好，样品分析时间短，只需要约62分钟，能同时检测出十五种氨基酸及甘氨酰谷氨酰胺 含量，通过周密的方法学验证，结果表明可用于同时检测复方氨基酸（15)双肽（2)注射液 氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量，考察稳定性样品中十七种主药含量的变化。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所 述：
[0021] 实施例1 :
[0022] 1.测定条件
[0023] 仪器：德国sykam公司的S-433D氨基酸分析仪。
[0024] 色谱柱：采用阳离子交换色谱柱LCAK06/Na(4. 6X 150mm)磺酸基强酸性阳离子交 换树脂
[0025] 2.测定法
[0026] S1.制备流动相缓冲液、再生液及衍生试剂
[0027] A.述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11. 8g、柠檬酸6. 0g、乙醇 65ml、37 %的盐酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2?4 ;
[0028] B.流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19. 6g、氢氧化钠3. lg、硼酸 5. 0g、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10?11 ;
[0029] C.再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTA0. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度；
[0030] D.衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇使溶解成100mL，即得。
[0031] S2.制备被测样品溶液：精密称取被测样品5ml (生产厂商：四川科伦药业股份有 限公司，生产批号为：H14092501)，置于50ml容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度，摇匀；再 精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述样品稀释液为取36%盐 酸1. 5ml稀释至1000ml ;
[0032] S3.制备对照品溶液：精密称取对照品门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酰谷氨酰胺（简称GQ)、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、 组氨酸、醋酸赖氨酸、精氨酸，用样品稀释液制成每lml中含有门冬氨酸0.34mg、谷氨酸 0· 56mg、丝氨酸0· 45mg、组氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸1. 13mg、苏氨酸 0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、缴氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、异亮氨酸0· 56mg、 亮氨酸〇. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸赖氨酸1. 27mg的对照品溶液；所述样品稀释液为取 36 %盐酸1. 5ml稀释至1000ml ;
[0033] S4.上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20 μ 1注入色谱 仪，通过流动相缓冲液A、Β和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生 试剂茚三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法 以峰面积计算，计算公式为：
[0034] 供试品标示含量（％) =(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积）X 100%
[0035] 其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高 温反应器温度为：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止时间：47min ;采集时间： 50min ;流动相缓冲液A的流速：0. 45ml/min ;流动相缓冲液B的流速：0. 45ml/min ;再生液 的流速：〇. 45ml/min ;氨基酸分析柱温：57?74°C。
[0036] 柱温程序如表1所示，泵梯度如表2所示。
[0037] 表1 :柱温程序
【权利要求】
1. 复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量检测方法，其特征 在于，该方法包括精密量取被测样品及对照品溶液，注入带磺酸基强酸性阳离子交换树脂 LCAK06/Na柱的色谱仪，通过流动相缓冲液A、B和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，以及衍 生试剂讳三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标 法以峰面积计算； 其中，所述流动相缓冲液A的配制为：二水合柠檬酸三钠11. 8g、柠檬酸6. Og、乙醇 65ml、37%的盐酸5. 6ml、辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至2?4 ; 所述流动相缓冲液B的配制为：二水合柠檬酸三钠19. 6g、氢氧化钠3. lg、硼酸5. 0g、 辛酸0. lml置1000ml量瓶中，加水定容至刻度，调pH至10?11 ; 所述再生液的配制为：氢氧化钠20g、EDTA 0. 2g置1000ml量瓶中，加水定容至刻度； 所述衍生试剂茚三酮溶液的配制为：取茚三酮2g，加乙醇溶解至100mL。
2. 如权利要求1所述的复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含量 检测方法，其特征在于，所述流动相缓冲液A的pH为3. 45,流动相缓冲液B的pH为10. 85。
3. 如权利要求1所述的复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨酰谷氨酰胺含 量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
51. 制备被测样品溶液：精密称取被测样品5ml，置于50ml容量瓶中，用样品稀释液定 容至刻度，摇匀；再精密量取定溶液2ml，用样品稀释液定容至100ml，摇匀，即得；所述样品 稀释液为取36%盐酸1. 5ml稀释至1000ml ;
52. 制备对照品溶液：精患、称取对照品，用样品稀释液制成每lml中含有门冬氣酸 0· 34mg、谷氨酸0· 56mg、丝氨酸0· 45mg、组氨酸0· 68mg、甘氨酰谷氨酰胺3. 027mg、精氨酸 1. 13mg、苏氨酸0· 56mg、丙氨酸1. 6mg、脯氨酸0· 68mg、缴氨酸0· 73mg、甲硫氨酸0· 56mg、异 亮氨酸〇. 56mg、亮氨酸0. 79mg、苯丙氨酸0. 585mg、醋酸赖氨酸1. 27mg的对照品溶液；所述 样品稀释液为取36%盐酸1. 5ml稀释至1000ml ; 的对照品溶液；所述样品稀释液为取36%盐酸1. 5ml稀释至1000ml ;
53. 上样、分离及梯度洗脱：分别将待测样品溶液和对照品溶液20 μ 1注入色谱仪，通 过流动相缓冲液A、Β和再生液进行梯度洗脱与再生平衡，于高温反应器中采用衍生试剂茚 三酮溶液进行柱后衍生反应，在检测波长为440nm和570nm下记录色谱图，按外标法以峰面 积计算； 其中，色谱仪的色谱条件为：带磺酸基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na柱；高温反应 器温度为：130°C ;茚三酮流速：0. 25ml/min ;茚三酮停止时间：47min ;采集时间：50min ;流 动相缓冲液A的流速：0. 45ml/min ;流动相缓冲液B的流速：0. 45ml/min ;再生液的流速： 0. 45ml/min ;氨基酸分析柱温：57?74°C。
4. 如权利要求1-3中任意一项所述的复方氨基酸（15)双肽（2)注射液氨基酸和甘氨 酰谷氨酰胺含量检测方法，其特征在于，所述按外标法以峰面积计算公式为供试品标示含 量（％)=(供试品溶液峰面积/标准品溶液峰面积）X100%。
【文档编号】G01N30/06GK104280475SQ201410604021
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】邓茂林, 伍丹, 何颖, 谭鸿波, 刘思川, 程志鹏, 葛均友, 万阳浴, 饶小莉, 刘文军, 罗成鑫, 吴小愚, 陈柯志 申请人:四川科伦药业股份有限公司