专利名称：凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法的制作方法
凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法本发明涉及新颖的凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法。凝血酶由活化的因子X(Xa)酶切凝血酶原上的两个位点产生。凝血酶将纤维蛋白原转化为活化形式，其组装为纤维蛋白。凝血酶还激活因子XI、 因子V和因子VIII。该正反馈加速凝血酶的产生。因子XIII也可由凝血酶激活。因子XIIIa为转谷氨酰胺酶，其催化纤维蛋白中的 赖氨酸和谷氨酰胺残基之间形成共价键。该共价键增加纤维蛋白凝块的稳定性。除了其在凝血级联中的活性，凝血酶还经过激活血小板上蛋白酶活化的受体促进 血小板的激活。在临床实践中，凝血酶原时间(PT)的测量，即血液变为凝块所花的时间，以活化 部分凝血激酶时间(APTT)和活化凝血时间(ACT)的方式，广泛用于筛选凝血途径的缺陷以 及监测抗凝血治疗。为了标准化凝血测试的结果，设计了国际标准化比率(INR)的概念。各组织 因子(tissue factor)的生产商为其生产的任何组织因子给出ISI(国际敏感指数， International Sensitivity hdex)。所述ISI值指示特定批次的组织因子与国际标准化 样本之间的比较。INR为患者的凝血酶原时间与对照样本的凝血酶原时间的比值，再运算所 用促凝血酶原激酶试剂的ISI值的乘方。INR= (PT 测试/PT )ISI对于PT的测量现有两种可用的测定法。一种测定法为凝血计量法(coagulometric)，其根据由纤维蛋白原至纤维蛋白转 化的凝块形成的终点。然而，该测定的结果是可变的，并特别地受患者中纤维蛋白原/纤维 蛋白转化的干扰所影响。另一种测定为非凝血计量法(non-coagulometric)，其根据使用合 成的、适合凝血酶裂解的底物。第二种测定的结果可变性较小并且不受纤维蛋白原水平的影响。US 4，061，625公开了以下通式的发色凝血酶底物D-Phe-环状亚氨基酸-Arg-pNA其中环状亚氨基酸选自2-氮杂环丁烷羧酸、脯氨酸、2-哌啶羧酸，且pNA为ρ-硝 基酰基苯胺(p-nitroanilide)。所述底物描述为适合定量测定凝血酶或适合其中凝血酶形 成、抑制或消耗的反应的研究，或适合测定发挥影响的或参与该反应的因子，例如适合测定 抗-凝血酶、凝血酶原和肝素。当使用发色底物时，在大约405nm检测反应。在该波长下不可分析全血，因为全血 自身有吸收。因此当所用样本类型为全血时发色底物不适用。使用螯合物如镧系元素螯合物的时间分辨发光光谱已经在免疫测定和DNA杂交 测定中应用多年。由于全血的吸收性质，与发色底物相比，该螯合物检测技术适用于当样本 为全血时，因为该技术可在615nm测量吸光度，而在该波长，全血吸收较低。该螯合物描述在US 7，018，851 Bl中，其公开了适合时间分辨荧光计(TRF)应用 的改进的荧光镧系元素螯合物。所述螯合物用于基于特异性生物亲和性的结合测定，例如免疫测定。TRF为非常适合要求高灵敏度和广泛动力学范围的测定的检测技术。在使用常规 荧光检测的免疫测定技术中，由光散射导致的高强度非-特异性背景例如来自样本的生物 成分严重限制了测定的灵敏度。所述荧光镧系元素螯合物传统上已经用于其中检测原理为基于捕捉和检测该螯 合物的免疫测定中。相反，其尚未用于其中检测原理为基于裂解螯合物底物和检测测定中 剩余的捕捉底物(未裂解的底物)的酶测定中。该系统的主要特征为提供一方面稳定的、另一方面可特异性地被凝血酶裂解的底 物。因此，尚存在对酶底物的需求，其可特异性地被凝血酶裂解并包括具有长寿命的 内在的稳定发光成分，因此便于检测全血并产生较少干扰。另外，尚存在对测定法的需求，其快速、简便并容易进行，可变性低，容易自动化且 成本低。已经惊人地发现通过使用一些连接基将可特异性地被凝血酶裂解的肽与发光螯 合物连接起来，提供了当样本类型为全血时可以使用的具有长寿命的稳定的底物。在第一方面中，本发明为具有以下通式的凝血酶底物A-X-Z-A，其中A或A’之一包括发光螯合物，以及A或A’的另一个包括结合配对(binding pair)的第一配偶体(partner)，任选包 括间隔基，并经肽键连接至底物的剩余部分，X 形成三-或四-肽，其选自 X，-Phe-Aze-Arg, X，-Phe-Pip-Arg 和 X，-Phe-Pro-ArgjJt^X，不存在或选自 Lys、Ahx、Ile 和 Val，Z 为 NH-R-Z，，其中 R 选自 CV6 亚烷基、亚烷基氧基、-S-Cp6 亚烷基(Uhioalkylene)、-S-C1^6 亚 烷基氧基(C^thioalkylenoxy)、羰基-(^6亚烷基、羰基-(^6亚烷基氧基、C1^6亚烷基-羰 基、CV6亚烷基氧基-羰基、Cp6亚烷基-亚芳基、Cp6亚烷基氧基-亚芳基、C^6亚烷基-NH、 C1^6亚烷基氧基-NH、C1^6亚烷基-NHC0、CV6亚烷基氧基-NHC0、C1^6亚烷基-C0NH、C1^6亚烷 基氧基-C0NH、C1^6亚烷基-COS、C1^6亚烷基氧基-COS、C1^6亚烷基-CONH-C^亚烷基-亚芳 基、亚芳基、亚芳基-CV6亚烷基、亚芳基-Cp6亚烷基氧基、R1a-亚芳基-(NHC0-R2)b、R3。-亚芳 基-(CONH-R4)d、(R5-CONH)e-亚芳基-R6f 和(R7-NHCO)g-亚芳基-R8h,其中各个 R1、! 2、! 3、! 4、 R5、R6、R7和R8在每次出现时独立地选自(卜6亚烷基、(卜6亚烷基氧基、-S-Cp6亚烷基、-S-CV6 亚烷基氧基、羰基-Cp6亚烷基、羰基-Cp6亚烷基氧基、CV6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳 基-Cp6亚烷基，且各个a、b、c、d、e、f、g和h独立地选自0至6的整数，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被 一个或多个取代基单_、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、 CV6烷氧基或CV6烷氧基羰基，Z，包括N、S和羰基之一，其中，
当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9C3N3)-NH-),当Z，包括S时，Z，选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物 (-S-S-)、(-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或当V 包括羰基时，V 选自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)，其中R9选自氢、卤素、CV6烷基、CV6烷硫基、Cp6烷氧基、Cp6硫代烷氧基、芳基氧基 和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任选被单_、二-或三-取代，且 其中氨基任选被一个或多个取代基单_或二-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2,
CV6烷基、C1^6烷氧基或Cp6烷氧基羰基。在本发明上下文中，CV6烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链基团，包括但不 局限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。甲基、乙基、丙基和异 丙基为优选基团。在本发明的上下文中，Cp6亚烷基是指具有1-6个碳原子的直链或支链二价 基团，包括但不局限于，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚叔丁基 (t-butylene)、亚戊基和亚己基。亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚异丙基为优选二价基团。在本发明上下文中，Cp6烷氧基是指连接至氧原子的具有1-6个碳原子的直链或 支链基团，包括但不局限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧 基、戊氧基和己氧基。甲氧基、乙氧基和丙氧基为优选基团。在本发明上下文中，Cp6亚烷基氧基是指连接至氧原子的具有1-6个碳原子的直 链或支链二价基团、包括但不局限于、亚甲基氧基、亚乙基氧基、亚丙基氧基、亚异丙基氧 基、亚丁基氧基、亚异丁基氧基、亚叔丁基氧基(t-butylenoxy)、亚戊基氧基和亚己基氧基。 亚甲基氧基、亚乙基氧基和亚丙基氧基为优选二价基团。在本发明上下文中，氨基酸残基具有其常规的三字母缩写。因此Ahx表示2-氨基 己酸(正亮氨酸)、Ala表示丙氨酸、Arg表示精氨酸、Asn表示天冬酰胺、Asp表示天冬氨 酸、Aze表示氮杂环丁烷-2-羧酸、Cys表示半胱氨酸、Gln表示谷氨酰胺、Glu表示谷氨酸、 Gly表示甘氨酸、His表示组氨酸、Ile表示异亮氨酸、Leu表示亮氨酸、Lys表示赖氨酸、Met 表示蛋氨酸、Phe表示苯丙氨酸、Pip表示哌啶-2-羧酸、Pro表示脯氨酸、Ser表示丝氨酸、 Thr表示苏氨酸、Trp表示色氨酸、Tyr表示酪氨酸和Val表示缬氨酸。在本发明上下文中，卤素表示氟、氯、溴或碘。为了分离裂解的和未裂解的/完整的底物，根据本发明的底物必须能够附着在固 定基质上。因此根据本发明的底物一端以结合配对的第一配偶体为末端，其可进一步与结 合配对的第二配偶体结合。所述结合配对的第二配偶体固定在固定基质上。根据本发明的底物可被凝血酶迅速裂解，且具有优良的特异性。其中心部分为小 肽，即三-或四-肽，其在位于Arg-部分和Z-部分之间的易裂键(scissile bond)处被凝 血酶裂解。当样本为血浆时可使用根据本发明的底物，且由于其适用于样本为全血的情况因 此其特别有利，因为所述底物由于使用了螯合物技术而可在615nm检测。在根据本发明的一个实施方式中，所述底物中X’不存在，Phe为D-Phe和Arg为 L-Arg0
而且，该螯合物可包括例如稳定的螯合物(包括吡啶的衍生物；联吡啶类、三联批
15在本发明的一个实施方式中，X为D-Phe-L-2-Aze-L-Arg或 D-Phe-L-2-Pip-L-Arg。这些底物已经显示提供快速裂解动力学和/或其对凝血酶的高度特异性。在本发明的一个实施方式中，Z’为N且R为亚芳基、CV6亚烷基_亚芳基或R1a-亚 芳基-(NHCO-R2)b,其中R1和R2如上文定义且a和b为O、1或2。因此其中Z在易裂键处包括芳香部分的底物已经显示提供了优良的和快速裂解 动力学。在本发明的一个实施方式中，Z，为6-取代的-1，3，5-三嗪_2，4_ 二胺 (NH-(R9C3N3)-NH)或(S-(R9C3N3)-NH)键，其中R9选自氯、氟、乙氧基、2-甲氧基乙氧基、 2_氰基乙氧基、2，2，2_三氟乙氧基、硫苯氧基(thiophenoxy)和乙氧基羰基硫甲氧基 (ethoxycarbonylthiomethoxy)。根据本发明的该实施方式的底物尤其对凝血酶特异。在根据本发明的一个实施方式中，所述发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。例如 如US 7,018,851 B2所公开，该发光镧系元素螯合物提供了以下特点因此非常适合本发明 在合适的波长处的强吸收率、在相同配体结构中的几个分开的UV吸收部分、从UV吸收部分 向镧系元素离子的有效能量转移、产生热力学稳定性和高动力学稳定性的强螯合部分、以 及允许有效偶联螯合物以用作结合试剂、却不破坏其结合性质的功能基。在根据本发明的一个优选的实施方式中，所述镧系元素螯合物A或A’选自
权利要求
1.具有以下通式的凝血酶的底物 A-X-Z-A，其中A或A’之一包括发光螯合物，以及A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体，任选包括间隔基，并经肽键连接至底物 的剩余部分，X 形成三 _ 或四-肽，其选自 X，-Phe-Aze-Arg,X‘ -Phe-Pip-Arg 和 X，-Phe-Pro-Arg,其中X，不存在或选自Lys、Ahx、Ile和Val, Z为NH-R-Z，，其中R选自CV6亚烷基、C1^6亚烷基氧基、-S-Cp6亚烷基、-S-Cp6亚烷基氧基、羰基-C^亚 烷基、羰基-Cu亚烷基氧基、CV6亚烷基-羰基、C1^6亚烷基氧基-羰基、C1^6亚烷基-亚芳 基、C1^6亚烷基氧基-亚芳基、C1^6亚烷基-NH、C1^6亚烷基氧基-NH、CV6亚烷基-NHC0、C1^6 亚烷基氧基-NHC0、CV6亚烷基-C0NH、CV6亚烷基氧基-C0NH、C1^6亚烷基-COS、C1^6亚烷基 氧基-COSXh亚烷基-CONH-CV6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-Cp6亚烷基、亚芳基-CV6 亚烷基氧基、R1a-亚芳基-(NHC0-R2) b、R3c-亚芳基-(C0NH-R4) d、(R5-CONH) e-亚芳基-R6f 和 (R7-NHCO)g-亚芳基-R8h,其中各个R1HHH和R8在每次出现时独立地选自C^6 亚烷基、CV6亚烷基氧基、-S-Cp6亚烷基、-S-CV6亚烷基氧基、羰基-Ch6亚烷基、羰基-CV6 亚烷基氧基、Cp6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-Cu亚烷基，且各个a、b、C、d、e、f、g和h 独立地选自O至6的整数，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个 或多个取代基单_、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、C1^6烷 氧基或Cp6烷氧基羰基，Z’包括N、S和羰基之一，其中，当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9CJ3)-NH-),当V包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、 (-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或当V包括羰基时，V选自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)， 其中R9选自氢、卤素、CV6烷基、Cp6烷硫基、CV6烷氧基、Cp6硫代烷氧基、芳基氧基 和氨基，其中烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基任选被一个或多个取代基单_、 二-或三-取代，且氨基基团任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自卤 素、OH、SH、CN、NO2、CV6烷基、C1^6烷氧基或C^6烷氧基羰基。
2.根据权利要求1 的底物,其中 X 为 D-Phe-L-2-Aze-L-Arg 或 D_Phe-L-2-Pip-L_Arg。
3.根据权利要求1或2的底物，其中Z’为N且R为亚芳基、C1^6亚烷基-亚芳基或 R1a-亚芳基-(NHCO-R2)b,其中a和b为0、1或2。
4.根据上述权利要求中任一项的底物，其中所述的发光螯合物为荧光镧系元素螯合物。
5.根据权利要求4的底物，其中所述的镧系元素螯合物选自
6.
7.根据上述权利要求中任一项的底物，其特征在于所述结合配对的第一配偶体经式 NH-Rici-CONH-Rll-CO-(NH-R12-NH)i的间隔基与底物的剩余部分连接，其中各个R1(l、R11和R12 独立地选自CV6亚烷基、Cp6亚烷基氧基、-S-CV6亚烷基、-S-Cp6亚烷基氧基、羰基-(V6亚烧 基、羰基-CV6亚烷基氧基、CV6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-Cu亚烷基，其中亚芳基为 亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其中亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或多个取代基单-、 二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2、C1^6烷基、Cp6烷氧基或C^6烷氧基 羰基，且i为O至6的整数，或所述间隔基为W-个氨基酸组成的肽，其中W为1至40的整 数。
8.根据权利要求7的底物，其中RlR11和R12为相同的或不同的直链CV6亚烷基、亚芳 基或亚芳基-Cp6亚烷基，且i为O或1。
9.根据上述权利要求中任一项的底物，其选自SlV6(a，b，c)、S1V8、S1V9(a, b)和 SlV12(a, b, c)
10.
11.根据权利要求10的测定方法，其中所述样本和活化剂的加入与底物向固定基质中 的加入同时或基本同时进行。
12.根据权利要求10的测定方法，其中所述样本和活化剂的加入在将底物固定在固定 基质后进行。
13.用于测定测试样本中生物活性凝血酶的浓度的两步测定方法，其包括以下步骤a)在液相中将所述样本和活化剂加入根据权利要求1-9中任一项的底物中，b)孵育所得的反应混合物以释放凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段，c)将反应混合物加入固定基质中，d)洗掉任何存在的未固定的、凝血酶-裂解的、含螯合物的底物片段和未固定的、凝血酶-未裂解的底物，e)测量来自固定的完整底物的发射光水平，和f)与不含凝血酶的标准品相比，从发射光强度的降低计算凝血酶活性。
14.根据权利要求10-13中任一项的测定方法，其中所述的活化剂选自促凝血酶原激 酶、部分促凝血酶原激酶试剂和接触活化剂。
15.根据权利要求14的测定方法，其中所述的部分促凝血酶原激酶试剂包括磷脂，且 所述接触活化剂包括二氧化硅、高岭土、硅藻土、鞣花酸。
16.根据权利要求1-9中任一项的底物在测定样本中生物活性凝血酶的浓度的用途。
17.用于测定样本中生物活性凝血酶的浓度的试剂盒，其包括a)根据权利要求1-9中任一项的发光底物，b)固体固定基质。
18.具有以下通式的酶的底物 A-X-Z-A，其中A或A’之一包括发光螯合物，和A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体，其任选包括间隔基，并经肽键连接至底 物的剩余部分，X形成三-或四-肽， Z为NH-R-Z，，其中R选自CV6亚烷基、C1^6亚烷基氧基、-S-Cp6亚烷基、-S-Cp6亚烷基氧基、羰基-C^亚 烷基、羰基-Cu亚烷基氧基、CV6亚烷基-羰基、C1^6亚烷基氧基-羰基、C1^6亚烷基-亚芳 基、C1^6亚烷基氧基-亚芳基、C1^6亚烷基-NH、C1^6亚烷基氧基-NH、CV6亚烷基-NHC0、C1^6 亚烷基氧基-NHC0、CV6亚烷基-C0NH、CV6亚烷基氧基-C0NH、C1^6亚烷基-COS、C1^6亚烷基 氧基-COSXh亚烷基-CONH-CV6亚烷基-亚芳基、亚芳基、亚芳基-Cp6亚烷基、亚芳基-CV6 亚烷基氧基、R1a-亚芳基-(NHC0-R2) b、R3c-亚芳基-(C0NH-R4) d、(R5-CONH) e-亚芳基-R6f 和 (R7-NHCO)g-亚芳基-R8h,其中各个R1HHH和R8在每次出现时独立地选自C^6 亚烷基、CV6亚烷基氧基、-S-Cp6亚烷基、-S-CV6亚烷基氧基、羰基-Ch6亚烷基、羰基-CV6 亚烷基氧基、Cp6亚烷基-羰基、亚芳基或亚芳基-Cu亚烷基，且各个a、b、C、d、e、f、g和h 独立地选自0至6的整数，其中亚芳基为亚苯基、亚联苯基或亚萘基，其亚苯基、亚联苯基或亚萘基任选被一个或 多个取代基单-、二-或三-取代，所述取代基选自卤素、OH、SH、CN、NO2, C1^6烷基、C1^6烷氧 基或Cp6烷氧基羰基，Z’包括N、S和羰基之一，其中，当Z’包括N时，Z’选自硫脲(-NH-CS-NH-)、氨基乙酰胺(-NH-CO-CH2-NH-)、酰胺 (-NH-C0-)、甲基酰胺(-NCH3-CO-)或取代的-三嗪-二胺(-NH-(R9CJ3)-NH-),当V包括S时，Z’选自硫醚(-S-)、硫基乙酰胺(-S-CH2-CO-NH-)、二硫化物(-S-S-)、 (-S-CO-CH2-NH-)或(-S- (R9C3N3) -NH-)，或当V包括羰基时，V选自酰胺(-C0-NH-，-CO-NCH3-)或酯(-C0-0-)，其中R9选自氢、卤素、CV6烷基、CV6烷硫基、CV6烷氧基、CV6硫代烷氧基、芳基氧基和氨基，其烷基、烷硫基、烷氧基、硫代烷氧基或芳基氧基基团任选被一个或多个取代基单_、 二-或三-取代，且其氨基基团任选被一个或多个取代基单-或二-取代，所述取代基选自 卤素、OH、SH、CN、NO2、CV6烷基、C1^6烷氧基或C^6烷氧基羰基。
全文摘要
本发明涉及凝血酶底物和测定样本中生物活性凝血酶水平的测定法。所述底物具有以下通式A-X-Z-A’，其中A或A’之一包括发光螯合物，例如镧系元素螯合物。A或A’的另一个包括结合配对的第一配偶体，例如生物素和任选间隔基。X形成三或四肽，例如X’-Phe-Aze-Arg、X’-Phe-Pip-Arg和X’-Phe-Pro-Arg，其中X不存在或选自Lys、Ahx、Ile和Val。Z包括连接基，例如二胺连接基。
文档编号G01N33/86GK102124346SQ200980131917
公开日2011年7月13日 申请日期2009年7月10日 优先权日2008年7月16日
发明者哈里·塔卡洛, 柯尔斯滕·M·雅各布森, 秦秋平, 阿伦·M·伯纳德 申请人:雷迪奥米特医学公司