一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法。

背景技术：

核酸适配体(aptamer)是从随机序列的寡聚核酸文库中筛选得到的能够与目标分子高亲和力和高选择性结合的单链核酸分子。与免疫抗体相比，核酸适配体显示出诸多优点，如筛选制备无需动物，可以通过化学方法合成、容易引入修饰基团用于标记和固定化等。核酸适配体在分析传感、疾病诊断治疗、药物开发等方面都显示出潜力。凝血酶是血液中的一种重要蛋白酶负责血液的凝固等，同时也是一些疾病的标志物。1992年研究者报道了一种可与人α凝血酶(humanα-thrombin)特异结合的含15个核苷酸的dna适配体(5’-ggttggtgtggttgg-3’,这里简称为apt15)(l.c.bock,l.c.griffin,j.alatham,e.h.vermaas,j.j.toole,selectionofsingle-strandeddnamoleculesthatbindandinhibithumanthrombin,nature1992，355，564-566)，它的解离常数kd约为100nm,可与凝血酶表面的纤维蛋白原结合位点作用。apt15较低的亲和力限制了apt15在分析传感等领域的应用。具有高亲和力的核酸适配体在应用中显示出优势。发展一种可增强已有核酸适配体序列的亲和力的方法，将有助于改善适配体的亲和性能，有利于其应用。

技术实现要素：

本发明的1个目的是提供一种提高α凝血酶的核酸适配体apt15亲和力的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在α凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t，得到α凝血酶的dna核酸适配体，实现提高α凝血酶的核酸适配体apt15亲和力。

所述凝血酶核酸适配体apt15的核苷酸序列为序列11，即为5’-ggttggtgtggttgg-3’。

上述方法中，所述在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t且小于等于35个t；

或所述在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长18、19、20、21、22、23、24、25、30或35个t；

或，所述提高α凝血酶的核酸适配体apt15亲和力体现在所述α凝血酶的dna核酸适配体的亲和力大于所述核酸适配体apt15的亲和力。

在apt15的3’端增加具有若干长度的聚胸腺嘧啶(t)核苷酸(polyt)，发现增加的polyt长度大于等于18个t后，核酸适配体的亲和力明显增强。利用这种在apt15的3’端带有polyt的高亲和力适配体，在核酸适配体亲和毛细管电泳分析法中能形成稳定的凝血酶-核酸适配体复合物，可以和未结合的适配体探针很好地分离开，进而实现对人α凝血酶的灵敏检测。

本发明另一个目的是提供一种α凝血酶的dna核酸适配体。

本发明提供的α凝血酶的dna核酸适配体，为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t，得到α凝血酶的dna核酸适配体。

上述中，在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t且小于等于35个t；

或所述在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长18、19、20、21、22、23、24、25、30或35个t。

上述dna核酸适配体的核苷酸序列为序列1-序列10中任一种。

本发明第3个目的是提供一种制备上述α凝血酶的dna核酸适配体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t，得到α凝血酶的dna核酸适配体。

上述方法中，所述在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t且小于等于35个t；

或所述在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t为在凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长18、19、20、21、22、23、24、25、30或35个t。

本发明第4个目的是提供一种dna核酸适配体。

本发明提供的一种dna核酸适配体，为在上述α凝血酶的dna核酸适配体上标记荧光染料。

荧光染料可以标记在上述α凝血酶的dna核酸适配体的5’或3’末端，也并不限于5’或3’末端。

本发明的实施例中，荧光染料为tmr，其它荧光染料也是可以的。

上述的dna核酸适配体在检测α凝血酶中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的dna核酸适配体在制备检测α凝血酶的产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述方法在提高α凝血酶的核酸适配体apt15亲和力中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第5个目的是提供一种检测α凝血酶的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的dna核酸适配体和α凝血酶反应，检测反应产物，实现检测α凝血酶。

上述中，所述检测为激光诱导荧光毛细管电泳。

本发明的实验证明，本发明在与人α凝血酶特异性结合的核酸适配体apt15序列(5’-ggttggtgtggttgg-3’)的3’末端延长增加若干个胸腺嘧啶核苷酸t(增加的t的数目大于等于18个)，可明显增强核酸适配体与人α凝血酶的亲和作用，增强了核酸适配体与人α凝血酶的复合物的稳定性。具有增强亲和力的核酸适配体在核酸适配体亲和毛细管电泳法中显示出优势，可形成稳定的复合物峰，有利于灵敏检测凝血酶。高亲和力核酸适配体序列apt15-25t对人α凝血酶的灵敏检测限达到0.1nm。这种增强α凝血酶核酸适配体apt15亲和力的方法简单易行，t核苷酸很容易通过化学合成的方法增加到核酸适配体序列的末端，合成成本低，纯度高。apt15可以与人α凝血酶的纤维蛋白原位点特异性结合，在特异检测人α凝血酶有优势，这种末端增加了t核苷酸的具有高亲和力的适配体更有利于相应的核酸适配体在分析传感、疾病治疗诊断等领域的应用,在相关应用领域显示出应用潜力。

附图说明

图1为利用激光诱导荧光毛细管电泳法分析apt15与人α凝血酶的相互作用。

图2为利用激光诱导荧光毛细管电泳法分析在apt15的3’末端带有不同长度的聚胸腺嘧啶核苷酸(polyt)的核酸序列与人α凝血酶的相互作用。

图3为利用激光诱导荧光毛细管电泳法和5’端标记了tmr的apt15-25t灵敏检测人α凝血酶。

图4为利用激光诱导荧光毛细管电泳法和3’端标记了tmr的apt15-25t灵敏检测人α凝血酶。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

人α凝血酶(humanα-thrombin)购自haematologictechnologiesinc.(essexjunction,vt,usa)

核酸适配体序列通过生工生物工程(上海)股份有限公司合成纯化。

石英毛细管(fused-silicacapillary)(外径365μm；25μm内径)长度为40厘米，检测窗距离进样端的距离为34厘米。

激光诱导荧光毛细管电泳实验中样品缓冲溶液：10mmtris-hcl(ph7.0)、5mmkcl和1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)

激光诱导荧光毛细管电泳实验中分离缓冲溶液：ph8.3，25mmtris水溶液和192mm甘氨酸(glycine)。

激光诱导荧光毛细管电泳仪可用商购的，也可以用实验室自制的：主要包括高压电源、激光激发光源(543.5nm氦氖激光)、光电倍增管等(maoyongsong,yuexia.zhang,taoli,zhixinwang,junfa.yin,hailinwang,highlysensitivedetectionofhumanthrombininserumbyaffinitycapillaryelectrophoresislaser-inducedfluorescencepolarizationusingaptamersasprobes,journalofchromatographya2009,1216,873-878)

实施例1、毛细管电泳检测凝血酶核酸适配体的亲和力

在核酸适配体apt15(ggttggtgtggttgg，序列11)的5’端标记tmr染料，获得tmr标记的apt15(简称5’tmr-apt15)，生工生物工程(上海)股份有限公司订购合成。

利用激光诱导荧光毛细管电泳法分析apt15与人α凝血酶的相互作用

将含有5’tmr-apt15(10nm)、humanα-thrombin(0nm,10nm,20nm,50nm,100nm,或200nm)和tmr内标(约0.1nm)的样品缓冲溶液在冰盒中温育1小时，然后采用激光诱导荧光毛细管电泳进行分析。样品采用加电压的方式进样(15kv,5s),分离电压为20kv，分离缓冲溶液包含25mmtris和192mmglycine(ph8.3)。

结果如图1所示，在考察的浓度范围内，没有观察到凝血酶和tmr标记的apt15的复合物峰，表明apt15的亲和力弱，在毛细管电泳分离过程中不能形成稳定的复合物。

为了便于比较，图1中的多条电泳检测曲线采用origin作图软件的二维瀑布图(waterfall)绘制功能绘制在同一张图中，电泳检测曲线在x轴和y轴方向进行了相应的平移。其余的图2、3和4也进行了类似的处理。

实施例2、增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法及具有高亲和力的凝血酶的适配体的获得

一、增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法的建立

在核酸适配体apt15的3’端延长不同长度的polyt(长度为10t，15t，16t，17t，18t，19t，20t，21t，22t，23t，24t，25t，30t，35t)，命名为apt15-10t、apt15-15t、apt15-16t、apt15-17t、apt15-18t、apt15-19t、apt15-20t、apt15-21t、apt15-22t、apt15-23t、apt15-24t、apt15-25t、apt15-30t、apt15-35t。

apt15-18t、apt15-19t、apt15-20t、apt15-21t、apt15-22t、apt15-23t、apt15-24t、apt15-25t、apt15-30t、apt15-35t的核苷酸序列依次为序列1-序列10。

将上述apt15-10t、apt15-15t、apt15-16t、apt15-17t、apt15-18t、apt15-19t、apt15-20t、apt15-21t、apt15-22t、apt15-23t、apt15-24t、apt15-25t、apt15-30t、apt15-35t的5’端或3’标记上tmr，序列有生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、增强凝血酶核酸适配体亲和力的检测

分别将含有上述一合成的5’tmr标记的apt15-10t、apt15-15t、apt15-16t、apt15-17t、apt15-18t、apt15-19t、apt15-20t、apt15-21t、apt15-22t、apt15-23t、apt15-24t、apt15-25t、apt15-30t或apt15-35t(10nm)与humanα-thrombin(10nm)和tmr内标(约0.1nm)的样品缓冲溶液在冰盒中温育1小时，然后采用激光诱导荧光毛细管电泳进行分析。样品采用加电压的方式进样(15kv,5s),分离电压20kv，分离缓冲溶液包含25mmtris和192mm甘氨酸(ph8.3)。

结果如图2所示，当polyt长度为10t，15t，16t，17t时，对应的tmr标记的核酸适配体探针与凝血酶温育后，在激光诱导荧光毛细管电泳实验中，没有观察到明显的凝血酶和核酸适配体探针的复合物的峰；apt15-t18对应的tmr标记的探针与凝血酶温育后的电泳分离结果表明在内标(迁移时间约1.5min)和未结合的tmr标记的核酸适配体探针峰(迁移时间约为2.5min)之间出现了明显的复合物峰。随着polyt长度增加，所产生的复合物峰的峰面积逐渐增大，25t，30t，35t对应的峰面积达到最大。表明在3’端通过增加适当长度的polyt(大于等于18t)，核酸适配体的亲和力明显增强，可以形成稳定的复合物峰。

因此，在α凝血酶核酸适配体apt15的3’末端延长大于等于18个t得到α凝血酶的dna核酸适配体为具有高亲和力的凝血酶的适配体，且可标记tmr。

实施例3、具有增强亲和力的凝血酶的适配体的应用

1、5’端标记有tmr的apt15-25t在检测凝血酶中的应用

5’端标记有tmr作为适配体探针，利用激光诱导荧光毛细管电泳法分析检测了不同浓度的人α凝血酶，具体如下：

10nm5’端标记有tmr的apt15-25t、不同浓度的人α凝血酶和tmr内标(约0.1nm)在样品缓冲液中温育(冰盒)1小时。然后采用激光诱导荧光毛细管电泳进行分析。样品采用加电压的方式进样(15kv,5s),分离电压20kv，分离缓冲溶液包含25mmtris和192mm甘氨酸(ph8.3)。

结果如图3a所示，随着凝血酶浓度的增加，复合物峰面积逐渐增加。

将复合物峰面积和凝血酶浓度作图如图3b，显示了复合物峰面积和凝血酶浓度间的关系，最低检测限为0.1nm。

2、3’端标记有tmr的apt15-25t在检测凝血酶中的应用

将apt15-25t核酸适配体的3’端标记有tmr作为适配体探针，利用激光诱导荧光毛细管电泳法分析检测了不同浓度的人α凝血酶，具体如下：

10nm3’端标记有tmr的apt15-25t、不同浓度的人α凝血酶和tmr内标(约0.1nm)在样品缓冲液中温育(冰盒)1小时。然后采用激光诱导荧光毛细管电泳进行分析。样品采用加电压的方式进样(15kv,5s),分离电压20kv，分离缓冲溶液包含25mmtris和192mm甘氨酸(ph8.3)。

结果如图4a所示，3’端标记有tmr的apt15-25t具有更高的荧光强度，所得到的凝血酶和适配体探针的复合物峰面积更大，随着凝血酶浓度的增加，复合物峰面积逐渐增加。

将复合物峰面积和凝血酶浓度作图如图4b，显示了复合物峰面积和凝血酶浓度间的关系，最低检测限为0.1nm。

序列表

<110>中国科学院生态环境研究中心

<120>一种增强凝血酶核酸适配体亲和力的方法

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