一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，属于食品安全检测领域。该试纸条由样品垫、金标垫、包被膜和吸水膜依次粘贴组合到PVC底板上，所述金标垫上涂覆有树枝状聚合物?金?适配体复合物增敏探针，包被膜上具有检测线和质控线，检测线上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体，质控线上包被有链霉亲和素。该试纸条的制备方法包括树枝状聚合物?金?适配体复合物增敏探针的制备、金标垫的制备、包被膜的制备以及试纸条的组装等。该试纸条利用树枝状聚合物?金?适配体复合物增敏探针进行信号放大，极大提高检测灵敏度，且操作简单、检测速度快，无需专用仪器设备，成本低廉，适合于大批量样品中沙门氏菌的高灵敏快速检测。
【专利说明】
一种用于检测沙门氏菌的増敏型核酸适配体试纸条及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌属于革兰氏阴性菌，是一种肠道杆菌致病菌，在自然界中广泛存在，极易污染水源、肉类(尤其是禽类)、蛋类及蛋制品等，人或动物食用被污染的食品即会引发食物中毒。目前，在全世界范围内，特别是发展中国家沙门氏菌感染事件逐年增多，我国70?80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的，可见沙门氏菌污染已经严重威胁到人类健康和公共食品卫生安全。因此，建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于保障食品安全和国民健康具有重要意义。
[0003]目前沙门氏菌检测方法主要有传统的微生物检验技术、仪器分析法、分子生物学技术和免疫检测方法等。其中，传统的微生物检测技术存在操作复杂，检测时间长，灵敏度和特异性不高等缺点；仪器分析法简单快速，但仪器设备价格昂贵，不适合现场快速检测；分子生物学方法能缩短检验时间，灵敏度和特异性好，但费用昂贵，易污染，假阳性偏高；ELISA方法灵敏、快速、特异性好，已广泛的应用于食品中微生物的检测，但其结果解读或者配套仪器较复杂，需要一定的专业知识。
[0004]而金标层析试纸条正好可以避免这些弊端，不需要专用仪器，只需要插入、比对即可，具有快速、低成本，操作简单易行，能满足绝大部分食品样品的检测，非常适用于大量样品的初筛。但是，常规的金标试纸条灵敏度较低，难以实现痕量目标物的快速分析。同时，随着政府监管体系的完善和检测力度的加强，食品中目标检测物的浓度会越来越少，这对金标试纸条的灵敏度提出了更高的要求。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有金标试纸条的灵敏度难以满足沙门氏菌高灵敏检测的研究现状，利用树枝状聚合物做为信号放大载体，将树枝状聚合物、金纳米粒子、核酸适配体(Aptamer)进行组装，制备树枝状聚合物-金-核酸适配体纳米复合物，将其作为信号增敏探针应用于金标试纸条中，进行金标试纸条检测信号增强研究，提供一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，实现对食品中沙门氏菌的高灵敏快速检测。
[0006]本发明的技术方案如下:
[0007]—种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条包括PVC底板，在所述PVC底板上依次粘贴有样品膜，信号增敏探针-金标结合垫，硝酸纤维素膜和吸水膜四种粘贴物;所述相邻粘贴物之间相互连接叠放;所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线和质控线。
[0008]所述信号增敏探针-金标结合垫上包被有树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体纳米复合物;所述树枝状聚合物为端巯基的树枝状聚合物;所述核酸适配体的5 ’端被巯基标记，3’端被生物素标记。
[0009]所述检测线上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体。
[0010]所述质控线上包被有链霉亲和素。
[0011]所述用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，其具体制备步骤如下:
[0012](I)树枝状聚合物-金纳米粒子复合物的制备
[0013]称取0.l-0.4mg的树枝状聚合物溶解到5mL丙酮中，取新合成的粒径为10-20nm的胶体金溶液ImL胶体金溶液分散到5mL纯水中，在氮气保护和快速搅拌下，将胶体金溶液逐滴滴加到树枝状聚合物溶液中，磁力搅拌下室温反应12h后，1000rpm 4°C离心30min，弃上清，用纯水洗涤沉淀物，离心洗涤并重复3次后将沉淀用重悬液(2OmM Na3P04，5 % BSA，
0.25% Tween-20，10 %蔗糖)重悬，得到10倍浓缩的树枝状聚合物-金纳米粒子复合物溶液。
[0014](2)树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物的制备
[0015]取1uL IuM的核酸适配体加入到2uL醋酸缓冲液(0.5M，pH5.0)和3uL ImM三羧甲基磷酸溶液中，室温避光放置lh，得到活化的核酸适配体溶液。
[0016]取10倍浓缩的树枝状聚合物-金纳米粒子复合物溶液200uL，逐滴加入到活化的核酸适配体溶液中，室温下搅拌60min;取170uL 10uM的dATP加入到上述反应液中，室温下继续搅拌30min;逐步将0.1M的NaCl溶液加入到反应液中，使NaCl的终浓度达到30mM，室温下反应Ih后放置与4°C冰箱过夜孵育;9400g离心1min后沉淀用重悬液重悬至200uL，得到树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物。
[0017]沙门氏菌核酸适配体序列为:5’-SH-TATGGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTTGAC ATT ATG ACA G-b1tin-3’，由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0018](3)树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体增敏探针金标结合垫的制备
[0019]用三维平面点膜喷金仪将上述制备的树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，置于37°C烘干后封装备用。
[0020](4)包被膜的制备
[0021 ]用三维平面点膜喷金仪将浓度为0.5-lmg/mL的抗沙门氏菌单克隆抗体溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线(T线)；将浓度为0.5-2mg/mL的链霉亲和素溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线(C线)。
[0022](5)增敏型沙门氏菌核酸适配体层析试纸条的制备
[0023]将样品膜、树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体增敏探针金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2_，用切割机切成3_宽的试纸条，得到基于增敏探针的增敏型沙门氏菌适配体试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。
[0024]本发明试纸条采用胶体金层析试纸技术，以树枝状聚合物做为载体，利用其外围大量的巯基，通过金硫键自组装可偶联大量金纳米粒子。当待测样品中存在沙门氏菌时，沙门氏菌先和金标结合垫上的树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物特异结合，随着毛细管作用继续层析到硝酸纤维素膜上，再与检测线上包被的抗沙门氏菌的抗体发生免疫识别反应，在检测线上显现出一定颜色的沉淀线；多余的树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物继续向前，核酸适配体上标记的生物素和质控线上包被的链霉亲和素发生结合，金纳米粒子富集使得质控线显色；如果待测样品中不存在沙门氏菌时，树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物在检测线上不产生富集，继续层析迀移和质控线上的链霉亲和素发生结合，试纸条检测线不显色，而质控线显色。
[0025]试纸条的检测线和质控线均是由金纳米粒子聚集而显色，与常规试纸条相比，当沙门氏菌浓度极低时，检测线上也可富集更多的金纳米粒子，其沉淀线显色也会更深，因此，可实现比常规试纸条更低浓度目标物的超灵敏检测，显著提高试纸条检测方法的灵敏度。
[0026]本发明的有益效果:本发明针对现有金标试纸条的灵敏度难以满足沙门氏菌高灵敏检测的要求，提供一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，借助于树枝状聚合物的端巯基来偶联大量的金纳米粒子，进一步与特异性识别沙门氏菌的核酸适配体组装制备树枝状聚合物-金-核酸探针，并做为信号增敏探针代替常规的金-核酸适配体探针，能够显著提高传统试纸条检测方法的灵敏度，实现对沙门氏菌的高灵敏检测，同时具有简单、快速、结果容易判读等特点。
【附图说明】
[0027]图1本发明试纸条的组成结构示意图。
[0028]图2本发明试纸条的检测原理示意图。
[0029]图3本发明试纸条的检测结果判定图。
[0030]附图中序号说明:1:PVC底板；2:样品垫；3:增敏探针金标结合垫;4:硝酸纤维素膜;5:吸水垫;6:检测线;7:质控线。
【具体实施方式】
[0031]为更好的理解本发明，下面结合具体的实施例来进一步阐明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
[0032]实施例1
[0033]如图1所示，一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条，其中序号I为PVC底板，其两端分别设有样品垫2和吸水垫5;在PVC底板的中部设置有硝酸纤维素膜检测层4，其上有检测线6和质控线7;在硝酸纤维素膜检测层4和样品垫2之间设置有金标结合垫3。
[0034]所述金标结合垫3上包被有树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物增敏探针；所述树枝状聚合物为端巯基的树枝状聚合物;所述核酸适配体的5 ’端被巯基标记，3，端被生物素标记。
[0035]所述检测线6上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体。
[0036]所述质控线7上包被有链霉亲和素。
[0037]实施例2
[0038]—种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条及其制备方法，具体操作步骤如下:
[0039](I)树枝状聚合物-金纳米粒子复合物的制备
[0040]称取0.2mg的树枝状聚合物溶解到5mL丙酮中，取新合成的粒径为1nm的胶体金溶液ImL胶体金溶液分散到5mL纯水中，在氮气保护和快速搅拌下，将胶体金溶液逐滴滴加到树枝状聚合物溶液中，磁力搅拌下室温反应12h后，10000rpm4°C离心30min，弃上清，用纯水洗涤沉淀物，离心洗涤并重复3次后将沉淀用重悬液(20mM Na3PO4，5 %BSA，0.25 % Tween-20,10%蔗糖)重悬，得到1倍浓缩的树枝状聚合物-金纳米粒子复合物溶液。
[0041 ] (2)树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物的制备
[0042]取1uL IuM的沙门氏菌核酸适配体加入到2uL醋酸缓冲液(0.5M，pH5.0)和3uLImM三羧甲基磷酸溶液中，室温避光放置lh，得到活化的沙门氏菌核酸适配体溶液，沙门氏菌核酸适配体DNA序列为:5’-SH-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT GAC ATT ATGACA G-b1tin-3，0
[0043]取10倍浓缩的树枝状聚合物-金纳米粒子复合物溶液200uL，逐滴加入到活化的沙门氏菌核酸适配体溶液中，室温下搅拌60min;取170uL 10uM的dATP加入到上述反应液中，室温下继续搅拌30min;逐步将0.1M的NaCl溶液加入到反应液中，使NaCl的终浓度达到30mM，室温下反应Ih后放置与4 °C冰箱过夜孵育;6500rpm离心15min后沉淀用重悬液重悬至200uL，得到树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物。
[0044](3)树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体增敏探针金标结合垫的制备
[0045]用三维平面点膜喷金仪将上述制备的树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体复合物均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，置于37°C烘干后封装备用。
[0046](4)包被膜的制备
[0047]用三维平面点膜喷金仪将浓度为lmg/mL的抗沙门氏菌单克隆抗体溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线(T线)；将浓度为1.5mg/mL的链霉亲和素溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线(C线)。
[0048](5)增敏型沙门氏菌核酸适配体试纸条的制备
[0049]将样品膜、树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体增敏探针金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成3mm宽的试纸条，得到基于树枝状核酸增敏探针的增敏型沙门氏菌核酸适配体试纸条，与干燥剂一起装于铝箔袋中密封保存备用。
[0050]具体使用时，将制备好的金标试纸条取出，其样品玻璃纤维膜端插入到待测样品溶液中，等待1min后取出用肉眼进行观察。如果质控线7不显色，则试纸条出现质量问题，检测结果无效;如果质控线7和检测线6均显色时，说明待测样品中含有目标物沙门氏菌，检测线6显色越深则检测溶液中沙门氏菌浓度越高，待测样品为阳性;如果检测线6不显色，只有质控线7显色时，说明待测样品中不含有沙门氏菌，待测样品为阴性。
【主权项】
1.一种用于检测沙门氏菌的增敏型核酸适配体试纸条，包括PVC底板(I)，在所述PVC底板(I)上依次粘贴有样品膜(2)，增敏探针金标结合垫(3)，硝酸纤维素膜(4)和吸水膜(5)四种粘贴物;所述相邻粘贴物之间相互连接叠放;所述硝酸纤维素膜(4)上依次设置有检测线(6)和质控线(7);其特征在于，所述金标结合垫(3)上包被有树枝状聚合物-金粒子-核酸适配体纳米复合物;所述树枝状聚合物为端巯基树枝状聚合物;所述核酸适配体为能特异性识别沙门氏菌的核酸适配体，其DNA序列的5 ’端被巯基标记，3 ’端被生物素标记;所述检测线(6)上包被有抗沙门氏菌单克隆抗体;所述质控线(7)上包被有链霉亲和素。2.制备权利要求1所述的试纸条，其特征在于包括如下操作步骤: (1)制备树枝状聚合物-金纳米粒子复合物 (2)制备树枝状聚合物-金粒子-适配体复合物 (3)将步骤(2)制备的树枝状聚合物-金粒子-适配体复合物喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，制备金标结合垫，烘干备用。 (4)在硝酸纤维素膜上的检测线位置喷涂抗沙门氏菌单克隆抗体溶液，在质控线位置喷涂链霉亲和素，烘干备用。 (5)将样品膜、金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，切成3mm宽的试纸条，与干燥剂一起封装于铝箔袋中保存备用。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中所用胶体金的粒径为1nm;步骤(4)中所述喷涂于检测线位置的抗沙门氏菌单克隆抗体是浓度为lmg/mL的抗沙门氏菌单克隆抗体溶液;步骤(4)中所述喷涂于质控线位置的链霉亲和素是浓度为1.5mg/mL的链霉亲和素溶液。
【文档编号】G01N33/543GK106053805SQ201610582015
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月21日 公开号201610582015.2, CN 106053805 A, CN 106053805A, CN 201610582015, CN-A-106053805, CN106053805 A, CN106053805A, CN201610582015, CN201610582015.2
【发明人】孙凤霞, 康立超, 彭夏雨, 杨井泉, 罗小玲, 李红敏, 党富民, 向晓黎, 王东健, 罗瑞峰
【申请人】新疆农垦科学院, 孙凤霞