一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物领域，具体涉及一种筛选靶蛋白核酸配体的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 许多核酸（DNA/RNA)因可特异结合某些靶蛋白而成为其配体，并发挥其各自的生 物学作用，例如抑制HIV逆转录酶活性的单链DNA配体、抗组蛋白H4-K16位赖氨酸乙酰化 的DNA配体，上市核酸药物Macugen即为血管表皮生长因子VEGF的RNA配体，作为抗肿瘤药 靶向载体的前列腺膜表面抗原PMSA的配体，作为基因转录因子调控元件的DNA配体等等。 核酸配体作为可以折叠成明确三维结构，通过空间构型互补与靶蛋白或靶分子高特异性高 亲和性结合的寡聚核酸，与靶分子以氢键和范德华力等相结合，与抗体抗原结合相比较，核 酸配体的结合范围更广，不仅结合于蛋白等大分子，也可与一些小分子产生结合，而且结合 的特异性和亲和力更高，与靶分子结合的解离系数可达纳摩尔甚至皮摩尔级，并且结合核 酸自身易修饰和标记，可逆，结构相对稳定等特点，因此核酸配体在医药、诊断和检测等领 域得以重视、研究和开发。
[0003] 作为研究核酸与蛋白相互作用、特异结合、鉴定与筛选的传统方法，包括凝胶阻滞 电泳法（GEL SHIFT或称EMSA法）、DNA足迹法，核酸酶保护法、指数富集的配基系统进化技 术（SELEX法），ChIP-on-chip等。EMSA电泳等前几种方法操作繁复、灵敏度低，不能高通 量。SELEX等后两种方法需要使用PCR仪、或毛细管电泳或测序或芯片等昂贵仪器，筛选过 程长，成本也较高，有一定的应用限制。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种一种快速筛选高特异 亲和靶蛋白的核酸配体的方法和试剂盒。
[0005] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的 核酸配体的方法，包括如下步骤：将各种待筛选的核酸配体用生物素标记5'端，加入结合 缓冲液、靶蛋白或含靶蛋白的混合物，结合反应后再加到预包被的链霉亲和素多孔板中，依 次经亲和孵育、洗脱、再加入抗靶蛋白的抗体孵育、洗脱、再加入标记二抗、孵育、洗脱，然后 加入底物显色或直接检测信号强度，从而确定高亲和的核酸配体。
[0006] 本发明同时提出了应用上述方法的试剂盒，该试剂盒包括生物素标记的阳性核酸 探针、竞争对照探针、靶蛋白或含靶蛋白提取物，抗靶蛋白抗体、标记二抗、结合缓冲液、洗 脱液、显色液和链霉亲和素包被的微孔板。
[0007] 其中，所述的靶蛋白为酶、转录因子、标志蛋白、受体、信号蛋白和病毒蛋白中的任 意一种。
[0008] 所述的含靶蛋白的混合物为细胞裂解物或提取物、组织消化与提取物、血清、体液 和尿液中的任意一种。
[0009] 所述的核酸配体为DNA或RNA ;或者是经结构修饰的DNA或RNA，构型为单链、双链 或茎环。
[0010] 所述的标记二抗为标记酶或荧光素标记，如以辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶 ALP等各种标记酶和各种荧光素标记的二抗。
[0011] 所述的底物显色通过化学发光或荧光底物显色实现，如为以四甲基联苯胺TMB或 鲁米诺化学发光或荧光底物进行显色。
[0012] 其中，所述的检测信号强度通过使用酶标仪、微孔读板机、荧光光谱仪检测可见光 信号、化学发光信号和荧光信号等实现。
[0013] 本发明进一步提出了所述试剂盒在筛选核酸药物、疫苗、诊断与检测用核酸探针 中的应用。
[0014] 在具体应用时，根据靶蛋白的种类来确定相应的核算配体、标记二抗等。
[0015] -般地，本发明的核酸配体筛选试剂盒因靶蛋白的不同而组成有异，每种试剂盒 均由特异组份（组份1-5)和通用组份（组份6-14)两大部份所组成，每种试剂盒也可按检 测方法不同而区分。具体如下表所列：
[0018] 具体地，对应的靶蛋白和相应的待筛选的核酸序列的选择如下表所示：
[0019]
[0022] 缩写说明：B = BIOTIN 生物素 ；ssRNA =单链 RNA ;ssDNA =单链 DNA ;dsDNA =双 链DNA ;L =线形；SL =莖环；H =发夹heparin ;修饰类型：全硫代0 = WPS ;两端硫代2 = EPS ;特定位点硫代I = PPS，锁核酸3 = LNA ;肽核酸4 = PNA ;吗啉代氨基磷酸酯5 = MF， 3'氨基代6 = NP ;2'_氧甲基7 = OMe ; (RNA) 2'-氧甲氧乙基8 = MOE (RNA) 2'-氟代9 = F嘧啶U T C ;2'_氟代戊糖核酸=FANA ;其它修饰M = OM ;碱基有下划线为特定修饰位点。
[0023] 有益效果：本发明采用高通量筛选与靶蛋白特异结合核酸配体的方法，方法基于 设计和合成不同序列或修饰的待筛核酸并标记上生物素，将核酸与既定的靶蛋白或混合物 进行结合反应后，加到预包被链霉亲和素的微孔板中，再经与抗靶蛋白抗体及标记二抗的 孵育和洗脱后，检测标记二抗的信号强度，从而的找到与靶蛋白结合最高的核酸配体。本方 法具有高通量、快速、灵敏、可定量、简便、经济的特点，其中高通量是本方法使用96孔、384 孔、1536孔等多孔板，也可用自动液体工作站进行筛选，适用大规模多样本筛选；快速是即 可将传统EMSA等数小时至数日的试验，缩短至三个半小时内即可完成，比EMSA法的快40 倍；灵敏是每孔只需不低于〇. 5 μ g的细胞提取物，或不低于0. 5ng的靶蛋白，比EMSA方法 灵敏10倍以上。通过生物传感级联放大，并使用荧光、化学发光等灵敏信号，可检测到pmol 的信号；可定量是指在〇. 5~10 μ g细胞提取物范围内，可提供定量检测结果；简便是因微 孔板读板仪普及，自动化程度高，操作简便。经济是指筛选的试剂使用非常微量，而且微孔 读板仪型号多价格不高。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明筛选方法的示意图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明提供了一种快速筛选高特异亲和靶蛋白的核酸配体的的试剂盒，包括生物 素标记的阳性核酸探针、竞争对照探针、靶蛋白或含靶蛋白提取物，抗靶蛋白抗体、标记二 抗、结合缓冲液、洗脱液、显色液和链霉亲和素包被的微孔板。筛选方法包括如下步骤：将待 筛选的核酸配体用生物素标记5'端，加入结合缓冲液、靶蛋白或含靶蛋白的混合物，结合反 应后再加到预包被的链霉亲和素多孔板中，依次经亲和孵育、洗脱、再加入抗靶蛋白的抗体 孵育、洗脱、再加入标记二抗、孵育、洗脱，然后加入底物显色或直接检测信号强度，从而确 定高亲和的核酸配体。整个流程如图1所示。
[0026] 本发明的核酸配体筛选试剂盒因靶蛋白的不同而组成有异，每种试剂盒均由特异 组份（组份1~5)和通用组份（组份6~14)两大部份所组成，每种试剂盒也可按检测方 法不同而区分。如表1所示：
[0030] 试剂盒中的靶蛋白或提取物（组份5)的准备与配制：
[0031] 本项发明试剂盒因靶蛋白的不同，可分别采用重组蛋白、细胞裂解物或提取物，定 量后按试剂盒中的配方用量作为其中靶蛋白的组分。其中既可使用商品化的重组蛋白或 细胞提取物，也可自行制备。本发明所使用的重组蛋白多以常规基因重组方法表达和纯化 目的蛋白，细胞提取物可自行培养细胞中按一定方法提取，如以K-562、Hela、Jurkat、MCF7 细胞的核提取物为例，其制备方法为：按常规细胞培养方法分别培养Hela、Jurkat、MCF7和 K-562等细胞，待细胞生长至IO7-IO8个/mL时，Hela细胞直接离心收集，Jurkat细胞在收 集前2小时加入50ng/ml佛波酯TPA和0. 5 μ M钙离子载体A23187 (CAS号52665-69-71、 Κ-562细胞加入50ng/ml佛波酯ΤΡΑ，刺激和37C培养后、离心收集细胞，按商品化核蛋白提 取试剂盒的说明书上的方法，提取各自的细胞核提取物，测定蛋白含量后备用，
[0032] 各试剂盒中组分结合缓冲液（组份8)的配方和配制：
[0033] 结合缓冲液的配方选择和优化，分别对下述五个配方进行试验和优化；
[0034] 配方 I : IOmM HEPES-KOH (pH 8. 0)、60mM KCl、4mM MgCl2、0.1 mM EDTA 0· lmg/mL BSA(nuclease-free) n0. 25mM DTTn 10% Glyceral.
[0035] 配方 2 :13. 5mM HEPES-K0H(pH 7. 9)、67mM KC1、7. 5mM MgC12、0. 135mM EDTA、 1.135mM DTT、0.125mg/mL BSA、0.335mM PMSF、13.5 % Glyceral(V/V)、20ng/yL poly (dl-dC)〇
[0036] 配方 3 :25mM HEPES-KOH (pH 7.6)、150mM NaCl、0· ImM EDTAUmM DTT、200ng/μ L salmon sperm DNA(sheared)
[0037] 配方 4 :50mM Tris-HCl(pH7. 5)、100mM NaCl、0.1 mM EDTA、50μg/mL BSA IOmM 2-ME、10% 甘油
[0038] 配方5 :50mM Tris-HCl ρΗ(7· 5)、250mM NaCl、5mM MgCl2、2. 5mM EDTA、2. 5mM DTT、 20%甘油、0.25mg/mL poly(dl-dC)
[0039] 根据试剂盒选用靶蛋白或提取物和提取方法的不同，所采用的结合缓冲液配方体 系均有所不同，一般基本配方采用两种缓冲体系，如下表所示：
[0041] 本发明试剂盒从中优选出最佳配方，并作为试剂盒的通用组份（组份8)。
[0042] 试剂盒其它通用的组份：复合蛋白酶抑制剂、洗液、抗体孵育液、显色液、终止液、 化学发光底物、反应液、荧光底物、链霉亲和素预包被多孔板等均为常规通用试剂。
[0043] 各组待筛选核酸序列（仅列其中一部份，反义链略）（缩写等说明详见备注1和备 注2)如表2所示：
[0044] 表 2
[0048] 备注I :将5' -生物素-待筛序列-3与互补链3' -生物素-反义互补序列等摩 尔数混合、水浴加温至85°C 10分钟，自然冷却至室温，退火结合成双链，备用；
[0049] 备注 2 :缩写说明：B = BIOTIN 生物素 ；ssRNA =单链 RNA ;ssDNA =单链 DNA ;dsDN =双链