一种her2核酸适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种能与人表皮生长因子受体 2 (HER2)分子相结合的核酸适配体，尤其涉及一种可抗核酸酶的HER2核酸适配体，以及该 核酸适配体在制备检测和/或治疗HER2阳性乳腺癌制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其中约20~30 %为人表皮生长因子受体 2(HER2)过表达。和其它类型的乳腺癌相比，HER2阳性的乳腺癌恶性程度更高，进展更快， 更易复发和向远处转移，对化疗药物敏感性低。此外，有超过50%的HER2阳性的乳腺癌缺 少雌、孕激素受体，以致这部分患者对内分泌治疗也不敏感。由于HR2阳性的乳腺癌患者 往往对化疗药物和内分泌治疗不敏感，所以一般预后较差。经过传统方法治疗的乳腺癌患 者中，包括手术切除，术后化疗和内分泌治疗，J1ER2过表达的乳腺癌患者的中位生存期比 HER2阴性者的中位生存期要缩短一半以上。因此，需要研发更有效的针对HER2阳性乳腺癌 的治疗技术，包括祀向治疗。
[0003] 在肿瘤的靶向治疗中，单克隆抗体是最常用到的药物之一。曲妥珠单抗 (trastuzumab,商品名赫赛汀）是目前临床上应用比较广泛的祀向HER2的人源化单克隆抗 体药物，已被批准作为治疗HER2过表达的转移性乳腺癌的一线临床用药。然而，已有临床 数据表明，有相当一部分J1ER2阳性的乳腺癌患者对曲妥珠单抗的治疗没有反应，并且对于 已有转移的J1ER2阳性的乳腺癌患者，大约60%~80%会在短时间内对该药物产生获得耐 药性。因此，目前非常有必要研发针对HER2的新型靶向治疗药物。
[0004]要想实现针对HER2的靶向治疗，我们需要能够和HER2分子结合的配体。除了抗体 以外，核酸适配体也可作为一类新型的靶向配体分子。核酸适配体（aptamer)是具有一定 序列的单链DNA、RNA或是经过修饰的寡核苷酸，可形成复杂的三维结构，与靶标分子结合。 核酸适配体和其靶标分子的结合具有特异性强、亲和力高的特点。和抗体相比，核酸适配体 有许多独特的优势，如易于大规模合成，价格便宜，易于体外修饰，体内的免疫原性较低，易 于穿透肿瘤组织等。由于具有上述特点，核酸适配体在肿瘤的靶向治疗方面，具有广泛的应 用前景，有些甚至已进入临床研究阶段。第一个被美国FBA批准的可在临床中使用的核酸 适配体药物是Mucagen，已用于治疗老年黄斑变性。此外，目前还有许多其它的核酸适配体 药物在进行临床试验，如AS1411和N0X-A12。AS1411是靶向核仁素的适配体，用于治疗急 性髓系白血病，目前处于II期临床实验阶段。N0X-A12是靶向CXCL12的镜像异构适配体， 用于治疗多发性骨髓瘤和非何杰金氏淋巴瘤，目前处于临床I期试验阶段。
[0005]核酸适配体要想应用于临床，需要克服一些药代动力学方面的问题。核酸适配体 容易被血液中的核酸酶降解，在血液中较不稳定，限制了其在体内的应用。解决这个问题 的技术路径之一，是通过化学方法修饰核酸适配体，以稳定其结构，免受血液中核酸酶的降 解，进而延长其在体内的半衰期。常用的化学修饰包括两大类：对寡核苷酸磷酸骨架的修 饰，以及对核糖2'位的化学修饰。磷酸骨架的修饰主要方法，是将磷酸基团中的氧原子用硫 原子替代而实现的硫代修饰。核苷酸中核糖2'位的修饰，主要是指将戊糖中2'位的氧原 子，用氨基、氟基、甲氧基等替代。尽管核糖2'位的修饰能增强寡核苷酸对核酸酶的抵抗， 但往往会降低该核酸适配体和靶标分子的结合能力。而磷酸骨架的硫代修饰，既能增强核 酸适配体对核酸酶的抵抗，亦能提高其对靶标分子的亲和力，是一种更为理想的技术。
【发明内容】
[0006] 本发明一方面提供了一种新的核酸适配体，所述核酸适配体能够与人表皮生长因 子受体2(HER2)相结合，所述核酸适配体包括如下核酸序列：X-GTGTGTCTGCTATTTATTTTGCT TGATTATCTCTTAGGGATIT-Y，其中：
[0007] 乂、丫各自独立地为六、1\(：、6中的至少一个碱基；
[0008] 或者X、Y至少一个不存在。
[0009] 本发明研究人员发现，与HER2相结合的核酸适配体的核苷酸分子，一级结构为 5'GTGTGTCTGCTAmAmTGCTTGATTATCTCTTAGGGAm3'（SEQID NO:1)为其核心序列，该 核心序列是保证所述核酸适配体分子与人表皮生长因子受体2相结合的关键。在该核心序 列的基础上，可以进行不同的变化，衍生得到不同的能与J1ER2相结合的核酸适配体分子， 这种衍生的方式，可以是在HB3-1核酸序列的基础上，进行插入或者延长的方式。
[0010] 因此，本发明的再一方面，进一步提供了一种优选的包括HB3-1核酸序列的延长 序列的适配体，所述优选的适配体的核酸序列为：X-GTGTGTCTGCTAITTAITITGCTTGATTATCTC TTAGGGATTT-Y，其中：X为TGCGTGTGTA，Y为GGGCGG(SEQIDN0:2)，其一级序列为：5'TGCGT GTGTAGTGTGTCTGCTATTTATTTTGCTTGATTATCTCTTAGGGATTTGGGCGG3 '。
[0011] 进一步地，本发明所述核酸适配体，在核酸适配体的两端，可以进行基团修饰，所 述修饰的基团可以是选自氨基、羧基、巯基、荧光分子、生物素、胆固醇或聚乙二醇基团修 饰。本发明的一个实施例中，提供了在所述的核心的核酸适配体的两端分别进行生物素、荧 光素修饰后得到的经修饰的核酸适配体分子，经修饰后的核酸适配体分子，能够与J1ER2多 肽以及HER2阳性肿瘤细胞相结合。
[0012] 本发明的再一方面，可以对所述的核酸适配体的碱基进行修饰，如硫代、氨代、氟 代、甲氧基修饰，得到碱基修饰后的核酸适配体分子，优选地，对所述碱基进行硫代修饰，硫 代修饰的方式为将碱基磷酸基团中的氧原子用硫原子替代。本发明的一优选实施例中，将 所述核酸适配体中所有的碱基A进行硫代，例如将核心序列的A经硫代，得到所述的硫代修 饰的核心适配体序列（命名为HB3-1);又如，将优选的核酸适配体序列碱基A经硫代，得到 优所述的硫代修饰的优选核酸适配体序列（命名为HB3)，经硫代修饰后，其具有较未经修 饰的核酸适配体更为优异的稳定性，可抗核酸酶。
[0013] 本发明所述核酸适配体，能够和HER2表位肽结合，尤其是HB3,其能与HER2表位肽 以较高的亲和力结合，Kd值为183nM。
[0014] 本发明所述核酸适配体，还能够选择性的结合HER2阳性的肿瘤细胞，而与HER2阴 性的细胞结合较弱。
[0015] 更为重要的是，对本发明所述核酸适配体碱基进行修饰后，如对其中的碱基A进 行硫代修饰，相比其它非硫代修饰的単链DNA序列，该硫代修饰的核酸适配体具有了一定 的抵抗核酸酶的能力，在血清中的存在时间显著延长。
[0016] 基于此，该核酸适配体可以直接携带细胞毒性药物（如阿霉素），选择性的杀伤 HER2阳性的肿瘤细胞，因此，本发明的再一方面，提供了本发明所述核酸适配体在制备用于 检测和/或治疗J1ER2阳性的乳腺癌制剂中的应用。
[0017] 本发明的又一方面，提供了一种组合物，该组合物包括本发明所述的核酸适配体， 以及制药上可接受的载体或赋形剂。
[0018] 本发明中，所述载体如可以是纳米药物载体，将本发明所述核酸适配体偶联到所 述纳米药物载体上（纳米载体如脂质体、胶束、纳米粒等），可以作为J1ER2靶向分子，用于 HER2阳性肿瘤的靶向治疗，将适配体欧联到纳米载体上的方法，本发明技术人员可以根据 现已有的制剂技术进行。或者本发明所述的载体也可以是造影剂粒子（如纳米铁、包裹了 造影剂的纳米粒等），将所述适配体偶联到造影剂粒子上，作为J1ER2靶向分子，用于HER2阳 性肿瘤的靶向显影，将适配体欧联到造影粒子上的方法，本发明技术人员可以根据现已有 的制剂技术进行。或者，本发明所述的载体还可以是染色分子（如辣根过氧化物酶），作为 HER2靶向分子，用于HER2阳性肿瘤的组化染色。
[0019] 本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物，包括本发明所述的 核算适配体、以及选自至少一种抗肿瘤药物，和制药上可接受的载体或赋形剂。
[0020] 本发明中，所述的核酸适配体和至少一种抗肿瘤药物，所述复合体是所述核酸适 配体与化疗药物形成的复合体，该复合体可用于HER2阳性的乳腺癌的治疗。
[0021] 本发明中，抗肿瘤药物，选自抗代谢类抗肿瘤药（如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、 吉西他滨或雷替曲塞）、抗生素类抗肿瘤药物（如丝裂霉素C、博来霉素、阿霉素、多柔比星、 表柔比星、吡柔比星或米妥蒽醌）、植物碱类抗肿瘤药（如长春碱、紫杉醇或羟基喜树碱）、 激素类抗肿瘤药（如他莫昔芬、来曲唑或强的松）、钼类抗癌药（如顺钼、卡钼、奥沙利钼、奈 达钼或乐钼）或抗肿瘤小分子靶向药物（如吉非替尼、伊马替尼或拉帕替尼）。