一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素氯霉素四环素三种抗生素残留的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素、氯霉素、四环素三种抗生素残留的方法，属于分析化学技术领域。
【背景技术】
[0002]抗生素的科学合理使用可以造福人类，但不恰当的使用则会危害人类的健康。随着人们发现抗生素对禽畜生长有促进作用，各种抗生素便在很多国家的畜牧业中得到广泛应用。我国的饲料业也将抗生素用作添加剂，其在动物疾病防治方面起到十分显著的作用，取得了显著的经济效益。但是抗生素的滥用也同样给畜牧业造成不良影响，近年来多种食品被屡次曝光含有抗生素残留，存在安全隐患，人们对动物源性食品的安全问题也日益关注。因此，应尽快建立能够用于动物源性食品中抗生素残留检测的有效方法，提高动物源性食品的安全性。
[0003]传统的抗生素残留检测方法有微生物检测法和仪器检测法。微生物检测法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，因此不能适应高通量、高灵敏定量检测的需求。仪器检测法包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(HPLC-MS)、液相色谱-串极质谱法(HPLC-MS/MS)、紫外分光光度计法(UV)、酶联免疫分析法(ELISA)等，是利用抗生素分子结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，其灵敏度高，准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。而抗生素的滥用还会造成动物源性食品中多种抗生素残留物同时存在，因此建立高效、高灵敏度的针对多种抗生素残留同时检测的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是拟将生物传感技术，纳米生物器件构建技术及通过SELEX技术筛选出的具有特定序列的，能分别与链霉素、氯霉素、四环素特异性结合的适配体分子联合应用于动物源性食品中抗生素残留的同时检测。
[0005]本发明的技术方案:一种基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素，氯霉素，四环素三种抗生素残留的方法，其设计合成了三段互补DNA1序列(cDNAls)，分别与链霉素(STR)，氯霉素(CHL)，四环素(TET)这三种抗生素特异性的适配体DNA序列(Ap-DNAs)相互补，同时还与三种抗生素各自的捕获探针DNA序列(Cap-DNAs)和互补DNA2序列(cDNA2s)部分互补；三种cDNAl首先和各自互补的适配体DNA杂交形成各自的双链DNA，当样品中存在链霉素，氯霉素及四环素时，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNAl ;游离的cDNAl与修饰在金电极表面的捕获探针DNA结合；随后PbS、CdS及ZnS三种量子点修饰的cDNA2序列进一步与cDNAl的另一端杂交；间接固定在金电极表面的三种量子点经酸溶后产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰(图1)。
[0006]本方法包括以下步骤:PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备；将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上；将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上；在金电极表面修饰三种捕获探针DNA序列；三种cDNAl序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成三种双链DNA ;含有三种目标抗生素的样品与三种双链DNA混合，适配体DNA会优先与其对应的抗生素结合从而使得双链DNA去杂交并释放出cDNAl ?’游离cDNAl序列与对应的捕获探针DNA序列结合；加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNAl序列另一端结合；酸溶量子点；检测三种抗生素对应的溶出伏安峰电流。具体步骤为:
1、PbS、CdS及ZnS三种量子点的制备
将9.22 μ L的巯基乙酸加入到50 mL 0.4 mM的Pb (N03) 2溶液中，用0.5 Μ的NaOH调pH至7，随后通氮气30min，将37.3 mL 1.34 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10 nm左右的棕色PbS量子点，于4°C黑暗保存；
将7.68 μ L的巯基乙酸加入到100 mL 1 mM的CdCl2溶液中，用0.5 Μ的NaOH调pH至11，随后通氮气30 min，将50 mL 1.34 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24h后即得直径在10 nm左右的黄绿色CdS量子点，于4°C黑暗保存；
将38.4 μ L的巯基乙酸加入到50 mL 5 mM的ZnCl2溶液中，用0.5 Μ的NaOH调pH至8，随后通氮气30 min，将50 mL 5 mM的Na2S溶液逐滴加入上述混合溶液中，通氮气搅拌24小时后即得直径在10 nm左右的微白色ZnS量子点，于4°C黑暗保存；
2、将链霉亲和素标记到合成的三种量子点上
将步骤1中配制好的三种量子点溶液各取2 mL后分别用4 mL 10 mM、pH 7.4的PBS缓冲溶液悬浮，形成3份6 mL的混合溶液，向每份混合溶液中加入20 μ L新鲜配制的10mg/mL EDC[l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]溶液活化10 min，随后迅速加入30μ L新鲜配制的10 mg/mL sulfo_NHS [N-轻基硫代琥泊酰亚胺]溶液，10 min后加入100μ L 1 mg/mL链霉亲和素溶液并将pH调至7，将上述溶液黑暗震荡2 h后用0.22 μ m的滤膜过滤，随后在4°C下10000 r/min离心20 min，去上清，水洗三次，最后重悬于2 mL 10mM、pH 7.4的PBS溶液中于4°C黑暗保存，得链霉亲和素标记的三种量子点；
3、将链霉亲和素标记的三种量子点修饰到对应的三种带有生物素的cDNA2序列上将三种带有生物素的cDNA2序列分别与200 μ L链霉亲和素标记的对应的三种量子点于37°C孵育1.5 h，随后在4°C下10000 r/min离心20 min去上清，水洗三次，最后重悬于200 μ L 10 mM, pH 7.4的PBS溶液中于4°C黑暗保存；
链霉素cDNA2浓度为1.5 μ M，序列为:
5’ -TTCTGTCTCTCG-B1tin-3’
氯霉素cDNA2浓度为1.4 μΜ，序列为:
5’ -ACGGTCGGTTACA-B1tin-3’
四环素cDNA2浓度为1.8 μΜ，序列为:
5’ -GCTACACGCCTTT-B1tin-3’
(此处及下文所述的所有DNA序列皆用超纯水作为溶剂，不再重述)；
4、在金电极表面修饰捕获探针DNA序列
用0.5 Mm及0.05 Mm的氧化招粉末在抛光布上先后打磨金电极表面。然后对金电极进行超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理5 min，用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面。将金电极置于0.5 mol/L的H2S04S液中在-0.2V?1.6 V电位范围内以100 mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V左右的出峰不再增加即可认为清洗完成。用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净。将金电极倒立放置，将三种捕获探针DNA溶液同时覆盖在金电极表面，用小离心管盖在金电极表面防止溶液过快蒸发，室温下放置过夜，使捕获探针DNA—端的巯基与金电极表面之间进行共价结合；
链霉素捕获探针DNA浓度为1 μ Μ，序列为:
5 ’ -HS- (CH2) 6-CGTGTTGGTGTT-3 ’
氯霉素捕获探针DNA浓度为1.2 μ M，序列为:
5 ’ -HS-(CH2) 6-GAGGATTCAGTGA-3，
四环素捕获探针DNA浓度为1.5 μΜ，序列为:
5， -HS-(CH2)6-ATGTAGCTAGGTG-3，；
5、三种cDNAl序列与对应的适配体DNA序列互补杂交形成双链DNA；
将cDNAl序列与对应的适配体DNA序列两段序列于95°C加热3 min,于37°C孵育1.5
h ；
链霉素适配体DNA序列和cDNAl浓度一致为0.8 μ M，序列分别为:
Ap-DNA:5’ -TAGGGAATTC GTCGACGGAT CCGGGGTCTG GTGTTCTGCT TTGTTCTGTCGGGTCGTCTG CAGGTCGACG CATGCGCCG-3’
cDNAl:5，-GACAGAACAA AGCAGAACAC CA-3，
氯霉素适配体DNA序列和cDNAl浓度一致为1 μ Μ，序列分别为:
Ap-DNA:5’ -AGCAGCACAG AGGTCAGATG ACTTCAGTGA GTTGTCCCAC GGTCGGCGAGTCGGTGGTAG CCTATGCGTG CTACCGTGAA-3’
cDNAl:5’ -CCGACCGTGG GACAACTCAC TGAA-3’
四环素适配体DNA序列和cDNAl浓度一致为1 μ Μ，序列分别为:
Ap-DNA:5’ -CGTACGGAAT TCGCTAGCGG GCGGACGCTA GGTGGTGATG CTGTGCTACACGTGTTGTGG ATCCGAGCTC CACGTG-3’
cDNAl:5’ -CGTGTAGCAC AGCATCACCA CCTACC-3’ ；
6、加入含有三种目标抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品
向步骤5中所述的含对应的cDNAl序列与对应的适配体DNA序列的混合溶液中同时加入含有每种抗生素链霉素、氯霉素及四环素的样品各20 yL，于室温孵育1 h;
7、游离cDNAl序列与捕获探针DNA序列的结合
由于适配体会优先与其对应的抗生素结合从而会使得双链DNA解旋并释放出cDNAl序列，将释放出游离cDNAl序列的溶液覆盖于修饰有捕获探针DNA序列的金电极之上，于37°C孵育1.5 h ;
8、加入修饰有量子点的cDNA2序列使之与cDNAl序列另一端结合
将步骤3制备的修饰有量子点的cDNA2序列的溶液覆盖于修饰cDNAl序列的金电极之上，于37°C孵育1.5 h;
9、酸溶量子点
用1 Μ的硝酸溶解间接固定在金电极上的量子点45 min ；
10、三种抗生素残留的检测将酸溶后的量子点溶液加入含500 Pg/L铋离子的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，随后通过玻碳电极用方波溶出伏安法进行检测，间接固定至金电极表面的三种量子点经酸溶后会产生与目标抗生素对应的溶出伏安峰。检测条件如下:首先在0.6V预处理60s，随后在搅拌条件下于-1.4V沉积120s，最后用方波伏安法在-1.4V?-0.5V扫描，其中跨步电压为5mV，频率为20Hz，振幅为25mV。
[0007]本发明的有益效果:①高灵敏度、高特异性、多种靶标残留物同时检测，对动物源性食品中抗生素残留检测具有重要意义；②利用纳米颗粒易于制备、修饰，能起到很好的信号放大作用以及适配体的构象变化等实现信号转换和放大，通过合理的设计，将纳米生物技术、电化学检测等多领域的优势联合起来，可广泛应用于多领域样品的检测。
【附图说明】
[0008]图1:基于核酸适配体和量子点同时检测链霉素，氯霉素，四环素三种抗生素残留的原理图。
[0009]图2:不同浓度链霉素存在下，峰电流值与链霉素浓度关系标准曲线图。
[0010]图3:不同浓度氯霉素存在下，峰电流值与氯霉素浓度关系标准曲线图。
[0011]图4:不同浓度四环素存在下，峰电流值与四环素浓度关系标准曲线图。
[0012]图5:标准样品中不同浓度链霉素，氯霉素及四环素存在下的方波溶出