一种基于唾液中的雌二醇的核酸适配体及检测用金标试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及激素检测技术领域，具体涉及一种基于唾液中的雌二醇的核酸适配体及检测用金标试纸条。
【背景技术】
[0002]雌二醇(170-estrad1l)属于内源性雌激素，分子量为272.38，在女性各种激素表达的生物活性中是最强的一种。随着对雌二醇的深入研究，发现内源性雌激素产生的代谢产物仍然能发挥各种各样的生物效应，正常情况下并不具有致癌作用。卵巢分泌雌激素，而且无排卵性功血、多囊卵巢综合征、功能性卵巢肿瘤等疾病可导致卵巢分泌雌激素增加，子宫内膜长期受单一雌激素刺激，无孕激素拮抗，可导致子宫内膜增生及癌变。
[0003]随着社会的发展，情绪疾病越来越受到社会的重视，而女性更易患各种情绪疾病，尤其是近几年经前焦虑性障碍的患病率明显提高，逐渐受到国内外妇科界的重视。经前期综合征(premenstrua I syndrome，PMS)是指在月经周期的黄体期有规律、反复发作的一组症状集合，主要包括躯体和心理症状。经前期烦躁不安征(premenstrual dysphonicdisorder，PMDD)是一种PMS严重状态，国外研究表明大约75%的妇女患PMS，而在患PMS者中又有14%患有PMDD。国内研究以乔明琦等为代表对PMS流行病学调查研究表明，该病的发生率占成年女性的41.9%。
[0004]女性生理期内，体内雌激素及孕酮的水平都有所变化，这两者与情绪变化相关。
[0005]对于体内雌二醇的水平变化的检测，具有非常重要的临床意义，然而传统的各种检测方法中一般都是基于尿液或者血液来检测，在取样的过程中给用户带来了不便或痛苦，且检测过程复杂，耗时长，成本高，并且不能保证批间的稳定性。
【发明内容】
[0006]由于雌二醇在唾液中性质较为稳定，并不影响测定效果，人体的唾液是通过口腔上皮细胞分泌，唾液中的雌二醇浓度与血液中的雌二醇浓度呈正相关性。又基于胶体金标记适配体识别雌二醇特异性抗原的技术避免了现有检测技术中的缺陷，具有稳定性高、易于合成等优点，因此，为了解决现有检测技术中的上述问题，本发明基于胶体金标记适配体识别雌二醇特异性抗原的技术原理，提供了一种雌二醇的核酸适配体，其相应的互补探针，以及由其组成的金标试纸条。
[0007]本发明提供的一种雌二醇的核酸适配体，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中序列5’端经过巯基修饰。该核酸适配体能够识别雌二醇并与其结合。
[0008]SEQ ID NO:15 ’-SH-TGTTCAATACGAAGGGATGCCGTTTGGGCCCAAGTTCGGCATAGTGTGGTGATAGTAAGAGCAATC-3，。
[0009]本发明提供的一种互补探针A，与上述雌二醇的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针A与雌二醇竞争性结合上述核酸适配体。
[0010]SEQ ID N0:25’-b1tin-GATTGCTCTTACTAT-3’。
[0011]本发明提供的一种互补探针B，与上述雌二醇的核酸适配体互补配对，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，其中序列5’端经过生物素修饰。互补探针B能够与上述核酸适配体的另外一部分结合，该部分不同于与雌二醇结合的序列段，也就是说，互补探针B与雌二醇之间没有竞争关系。
[0012]SEQ ID N0:35’-b1tin-GATTGCTCTTACTATCACCACACTATGCCG-3’。
[0013]本发明公开的一种检测雌二醇的金标试纸条，是在塑料衬板上依次搭接样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜，并且硝酸纤维膜上划有检测线和参照线，参照线靠近吸水玻璃纤维膜一端;其中核酸探针金标垫上附着表面经修饰的胶体金，检测线由核酸适配体A溶液划成，参照线由核酸适配体B溶液划成；
[0014]所述胶体金的表面经过活化了巯基的雌二醇的核酸适配体修饰；
[0015]核酸适配体A溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针A;
[0016]核酸适配体B溶液包括结合了链霉亲和素的互补探针B。
[0017]以上金标试纸条，特别适合于唾液中雌二醇的检测。通过适配体检测唾液中的雌二醇浓度，利用唾液中微量的雌二醇浓度与血液中的雌二醇浓度存在显著相关性，从而推算出人体的雌二醇水平，为一种非侵入式检测方案，可用于监测女性的生理周期及健康状
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[0018]本发明的金标试纸条，检测线中的互补探针A与雌二醇是竞争关系，竞争性结合核酸适配体。检测时，将唾液样品浸润或滴加到样品玻璃纤维膜，由于毛细现象，唾液向样品玻璃纤维膜的对向端渗透，渗透的过程中雌二醇会与核酸探针金标垫的核酸适配体结合并继续一起移动，核酸适配体一端有胶体金颗粒，核酸适配体与胶体金颗粒的结合体将吸附在检测线和参照线上，最终显色的深浅通过与标准色(梯度浓度标准品在金标试纸条上的显色情况)对比就能得到雌二醇的浓度。当唾液中含有高浓度的雌二醇时，雌二醇与互补探针A竞争性结合核酸适配体，从而检测线颜色就会变弱。阴性对照(空白对照)是有两条线都显色，因为当唾液中不含有雌二醇，两条互补探针都会截留雌二醇的核酸适配体。
[0019]优选地，上述金标试纸条，所述胶体金溶液的制备方法如下:
[0020]将醋酸缓冲液和TCEP溶液混合，再向其中加入雌二醇的核酸适配体，进行巯基活化反应，反应结束后向其中加入金纳米粒子溶液，震荡;再加入dATP，250C震荡反应后静置30分钟，再在4°C下静置6小时;然后离心，沉淀用磷酸缓冲液溶解既得。
[0021 ]优选地，上述金标试纸条，所述醋酸缓冲液浓度为0.5M，pH值6.5，用量IyL;所述TCEP溶液的浓度为10mM，用量1.5yL;所述dATP浓度ΙΟμΜ，用量85yL;所述金纳米粒子粒径30?40nm，用量10yL;所述磷酸缓冲液浓度0.01M，pH值7.4，用量520yL。
[0022]优选地，上述金标试纸条，所述互补探针A溶液制备方法为:将40?SOyLI?100D值的生物素修饰的互补探针A溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?1.000M pH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液。
[0023]优选地，上述金标试纸条，所述互补探针B溶液的制备方法为:将40?SOyLI?100D值的生物素修饰的互补探针B溶液和200?300yL I?5mg/mL链霉亲和素溶液混合后在25°C下静置I小时，在向其中加入500?600yL 0.001?I.000Μ pH值6.0?8.0的磷酸盐缓冲溶液得到结合了链霉亲和素的生物素修饰的互补探针B溶液。
[0024]本发明还提供了以上任一所述的金标试纸条的制备方法，是将样品玻璃纤维膜、核酸探针金标垫、硝酸纤维膜和吸水玻璃纤维膜依次粘贴到塑料衬板上，相邻两粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，干燥封装，在4°C?25°C条件下保存。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0026]1、本发明将纳米粒子比表面积大这一显著特点应用于传统的金标试纸条的建立和相应的检测方法，建立了可用于现场快速超灵敏检测的基于核酸探针的胶体金标记试纸条和相关的检测方法，通过肉眼直接观察实现目标检测物的快速定性检测和通过检测条带上显色程度的降低对目标检测物进行定量检测。无需其他辅助仪器设备，检测工作可在10?15分钟内完成并得到检测结果。
[0027]2、本发明为通用型基于胶体金标记适配体的胶体金标记试纸条，只需将试纸条中适配体进行相应替换，即可实现其他目标物的检测。
[0028]4、本发明还具有特异性高，稳定性好，应用范围广，成本低廉，操作使用方法简单易于推广应用。可应用于医院、家庭、以及食品安全与检验检疫的海关、机场等口岸等需要现场快速检测机构。
[0029]5、本发明中的检测方法不需要穿刺取血或取尿液，只需要取唾液，取样简单，属于非侵入式检测，检测方法简单，成本低廉。
[0030]6、本方法检测的灵敏度和高，监测浓度可以达到pmol级别。
【附图说明】
[0031]图1为基于胶体金标记抗体的金标试纸条的侧面结构示意图，图中序号:I样品玻璃纤维膜、2核酸探针金标垫、3硝酸纤维膜、4检测线、5参照线、6吸水玻璃纤维膜、7塑料衬板；
[0032]图2为基于胶体金标记抗体的金标试纸条的正面检测结果判断示意图；
[0033]图3为金标试纸条对阴性、弱阳性、阳性和无效样品检测结果图；
[0034]图4为含不同浓度雌二醇的唾液和尿液样品检测结果。
【具体实施方式】
[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作