基于核酸适配体检测四环素的生物传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测四环素的生物传 感器，同时还涉及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 四环素是一种广谱抑制剂，高浓度时具杀菌作用。该品对弧菌、鼠疫杆菌、布鲁菌 属、弯曲杆菌、耶尔森菌等革兰氏阴性菌抗菌作用良好。多年来由于四环素类的广泛应用， 临床常见病原菌包括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐 药，并且，同类品种之间存在交叉耐药。大量资料证实，长期反复使用四环素，有可能影响牙 齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良(牙齿表面不光滑，出现小凹 陷）或牙齿畸形。因此，确定食品及农产品中的四环素的残留量已经变得至关重要。
[0003] 目前，主要用来检测四环素的方法包括液相色谱质谱联用技术（LC-ESI-MS/MS) 和高效液相色谱法（HPLC)。但是这两种方法都存在自身不可避免的缺点与限制。例如：需 要较为昂贵的仪器设备，专业的操作人员以及复杂的样品预处理过程。因此，目前急需建立 一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中四环素的残留量。
【发明内容】
[0004] 为了解决以上现有技术中检测四环素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的 问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测四 环素的生物传感器。还涉及其制备方法 本发明还提供了基于核酸适配体检测四环素的生物传感器的制备方法。
[0005] 本发明是通过以下步骤得到的： 本发明中一共用到了 5条DNA链，其序列分别是： Apatamer:5' -CGACGCACAGTCGCTGGTGCGTACCTGGTTGCCGTTGTGT-3'（SEQIDN0 :1);ProbeA:5' -TGTGTTGCCACGCAGC-3'（SEQIDNO:2); HAP：5, -GCTGCGTGGCAACACAGCTGCCTGTGTTGCCACGCAGC-3, (SEQIDNO：3)；Assistantprobe:5' -GCTGCGTGCGTTAGATCC-3'（SEQIDNO:4); Captureprobe:5'-SH-GCTGCGTGGCAACACAGCTGCCTGTGTTGCCACGCAGC-MB-3' （SEQID NO：5)； 其中aptamer与probeA组成半杂交的桥形探针。
[0006] 本发明中用到了两种酶：ExonucleaseIII和Nt.Alwl内切酶。ExonucleaseIII能 够特异性的切割DNA双链的3'平末端或凹末端，而对3'的凸末端与DNA单链却不起作用。 Nt.Alwl可以在特异性位点实现对DNA双链的特异性切割，其特异性的切割识别序列是： GGATCNNNNN，切割位点是最后两个碱基之间。
[0007] 本发明中四环素的检测是在均相溶液中实现的，通过两步循环的方式来实现信号 的放大，从而实现四环素的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
[0008] 均相中发生的反应主要有：桥型DNA双链的一条链是目标物四环素的适配体，当 有四环素存在时，由于适配体与目标物之间的特异性结合，将适配体从桥形探针上竞争下 来，从而使适配体的互补链游离（A)在均相溶液中。ProbeA序列又与HAP的3'段伸出的 部分完全互补，故可以形成互补配对的双链。使HAP的3'凸末端变成3'平末端，该构象可 以被ExonucleaseIII沿着3'端切割，直到HAP的环端单链，同时释放环HAP上的5'段序 列。本发明中设计该部分序列与probeA的序列完全一样，所以循环一次就会产生多产生 一条probeA，从而起到放大信号的作用。为了更灵敏的检测到痕量的四环素，进一步降低 该发明的最低检测限，在信号的产生过程中，我们设计了第二步的循环放大。
[0009] 在信号的产生过程中，首先在金电极表面修饰一层捕获探针，该探针的一端用巯 基（-SH)修饰，通过Au-S的共价结合可以将捕获探针很好的固定在金电极表面。然后将均 相反应后的产物及辅助探针一起滴加到修饰好的电极表面。在assistantprobe与均相中 的A的协同作用下，会在电极表面形成一种Y形的构象。并在辅助探针与捕获探针杂交的 序列中形成一个Nt.AlwI的切割位点，由于酶的切割，使得捕获探针上的电活性物质远离 电极表面，从而使电化学信号降低。游离出来的assistantprobe与probeA可以继续结 合电极上剩余的捕获探针，从而起到循环放大的目的。
[0010] 在均相反应中，反应条件为37°c，反应时间是2h。
[0011] 所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤： (1) 对电极进行预处理； (2) 将captureprobe层修饰到电极表面； (3) 将probeA和assistantprobe层修饰到电极表面。
[0012] 所述captureprobe层的厚度为 10±2nm、capture和assistantprobe层的厚度 为 20±2nm。
[0013] 所述的制备方法，优选将captureprobe层修饰到电极表面的操作步骤如下：将 10yM的captureprobe10yL滴加到经过预处理的电极表面，在25°C下孵育2h。
[0014] 所述的制备方法，优选将probeA和assistantprobe修饰到电极表面的操作步 骤如下： (1) 将灭菌水，10X的buffer缓冲液、桥形探针和待测目标物加入离心管中，震荡30s， 放入37°C的恒温箱中孵育2h; (2) 向离心管中加入HAP、ExonucleaseIII，震荡30s，放入37°C的恒温箱中孵育2h; (3) 将孵育好的混合溶液与assistantprobe-同滴加到修饰好captureprobe层的 电极上，将电极继续放在37°C的恒温箱中孵育2h，清洗。
[0015] 所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为，电极在0. 3ym和0. 05ym的氧 化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。
[0016] 所述的制备方法，优选所述电极为金电极。
[0017] 该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极， 钼丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将captureprobe 固定到电极表面。然后将反应后的均相溶液与辅助探针一起修饰到电极表面，然后在37°C 孵育2h使均相中的A和assistantprobe与电极表面的captureprobe完成杂交反应产 生Y形构型，然后用Nt.Alwl切割辅助探针与捕获探针杂交产生的切割位点，从而使MB远 离电极表面，然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为〇到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06S，采用差分脉冲 伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。
[0018] 本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，具有外切功能的核酸外切酶，核 酸内切酶在特异性位点对核酸链的切割作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生 物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补四环素现有检 测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
[0019] 本发明的有益效果： 1、 利用了核酸适配体的特异型识别，利用四环素的适体作为识别物质实现了对目标物 四环素的高特异性检测； 2、 利用外切酶的切割作用，实现了probeA的循环利用并产生相同序列的链，起到了信 号放大的作用； 3、利用核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，结合probeA与 assistantprobe的协同作用将电极表面的发夹信标打开，实现了第二步循环放大。信号的 两次循环放大实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度； 4、 该传感器的反应条件温和，反应速度快； 5、 由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用； 6、 检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程 度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测； 7、 制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中四环素的检测和生物 传感器产业化的实际应用； 8、 制作电极的