一种肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒及制备方法与应用与流程

本发明属靶向脂质纳米粒及制备方法，主要涉及一种肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒及其制备方法。

技术背景

固体脂质纳米粒(solidlipidnanoparticle,sln)是在20世纪90年代初发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合物纳米粒的新型胶体给药系统，属于亚微粒给药系统。sln易制备并可用于静脉给药，也可用于口服或局部给药，适合多种给药途径。sln作为药物载体可提高药物的生物利用度，可控制药物释放以及发挥良好的靶向性。

核酸适配体(aptamer)是短的dna或rna片段，一般由12～30个碱基构成。适配体可形成特定结构的空间构型，与目标蛋白发生特异性结合。与抗体相比，适配体具备分子量小、低免疫原性、易获得等优点。a15为rna适配体，可识别肿瘤干细胞标志物cd133分子，且有较强亲和力和特异性。a15由15个核糖核苷酸组成，文献报道，与单克隆抗体相比，该适配体在肿瘤细胞球里渗透能力强、保留时间长。

盐霉素是一种聚醚类离子型抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和各种球虫有比较强的抑制和杀灭作用。其临床前及临床研究数据较少，少数文献报道其存在严重的肌肉和神经毒性，限制其主要应用于禽类疾病。2009年gupta等人通过高通量筛选法，发现盐霉素具有杀伤乳腺癌干细胞的能力，降低乳腺癌干细胞比例的作用比常规化疗药紫杉醇高100倍。在其他肿瘤上，如慢性淋巴细胞白血病，也已被证明可特异性的杀伤肿瘤干细胞。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种肿瘤干细胞靶向的脂质纳米粒，该纳米粒由a15-聚乙二醇-十八醇嫁接物，单硬脂酸甘油酯，单硬脂酸聚乙二醇酯，盐霉素组成，其中a15-聚乙二醇-十八醇嫁接物的重量百分比为9.1～17.9wt％、单硬脂酸甘油酯的重量百分比为69.5～72.0wt％，单硬脂酸聚乙二醇酯的重量百分比为3.6～7.6wt％，盐霉素的重量百分比为3.6～7.6wt％。

本发明的第二个目的是提供所述肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒的制备方法，具体通过以下步骤实现：

(1)分别取20mg单硬脂酸甘油酯、1.0～2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及1.0～2.0mg端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物，1.0～2.0mg盐霉素置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃加热溶解，为有机相，超纯水为分散相，磁力搅拌条件下，有机相注入分散相，继续搅拌5min，得含游离氨基的脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)；

(2)取游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)分散液，焦碳酸二乙酯处理水稀释纳米粒浓度至100μg/ml。加入氨基摩尔1～2倍的n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)，室温搅拌(400rpm)反应9h。加入等摩尔数的氨基a15，继续搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液置于分子量为30kda的超滤离心管。离心，弃滤液，加入焦碳酸二乙酯处理水清洗两次，除去未反应的适配体。未滤过液体即为a15-peg3400-sln/sal纳米分散液。

本发明的第三个目的是提供端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物的合成方法，通过以下步骤实现：分别取含有端氨基端羧基的聚乙二醇(nh2-peg3400-cooh)、溶于无水二氯甲烷配成浓度10mg/ml的溶液，加入同摩尔量的十八醇(odc)。按照摩尔比十八醇：二环己基碳二亚胺：n-羟基琥珀酰亚胺1:1:1～1.5的比例加入二环己基碳二亚胺及n-羟基琥珀酰亚胺，室温反应24h，反应结束后，将反应液滴加至8～10倍体积的冷无水乙醚，4℃过夜，使产物析出，离心收集沉淀，弃上清液，收集沉淀，40℃烘干，得端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物(nh2-peg3400-odc)。

本发明的第四个目的是提供所述的肿瘤干细胞靶向的脂质纳米粒在制备给药系统中的应用。所述肿瘤干细胞为cd133分子高表达的肝癌干细胞。所载药物为肿瘤干细胞特异性药物盐霉素。

本发明选取的a15适配体，与肝癌肿瘤干细胞的表面分子标记物cd133分子，具有较强的亲和力，可通过与cd133分子的特异性结合，靶向肝癌肿瘤干细胞。亲水的含端氨基端羧基的聚乙二醇通过酯化反应链接十八醇，十八醇的长脂肪链段可插入脂质纳米粒。该聚乙二醇的端氨基游离在脂质纳米粒外周，与a15适配体的氨基通过n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯化学连接，实现a15适配体修饰脂质纳米粒。肝癌干细胞靶向脂质纳米粒作为载体包封肿瘤干细胞特异性药物盐霉素，通过a15的靶向作用递送至肿瘤干细胞，并改善盐霉素的水难溶性及体内分布差的特点，增强盐霉素药效。

附图说明

图1是十八醇、端氨基端羧基聚乙二醇及端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物的红外分析图谱。

图2是肿瘤干细胞球摄取该纳米粒的细胞百分比及摄取荧光强度的流式分析图，空白对照为未孵育纳米粒组细胞。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

一、端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物(nh2-peg3400-odc)制备

实施例1：

取200mgnh2-peg3400-cooh、15.6mg十八醇(odc)，溶于20ml无水二氯甲烷，11.9mg加入二环己基碳二亚胺6.6mgn-羟基琥珀酰亚胺，室温磁力搅拌(300rpm)反应24h。反应结束后，将反应液中滴加至的200ml冷无水乙醚。4℃过夜，使产物充分析出。4℃条件下3000rpm离心5min，收集沉淀，烘干，得端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物(nh2-peg3400-odc)。

实施例2：

取200mgnh2-peg3400-cooh、7.8mg十八醇(odc)，溶于20ml无水二氯甲烷，加入11.9mg二环己基碳二亚胺10mgn-羟基琥珀酰亚胺，，室温磁力搅拌(300rpm)反应24h。反应结束后，将反应液中滴加至的200ml冷无水乙醚。4℃过夜，使产物充分析出。4℃条件下3000rpm离心5min，收集沉淀，烘干，得端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物(nh2-peg3400-odc)。

实施例3：

取200mgnh2-peg3400-cooh、7.8mg十八醇(odc)，溶于20ml无水二氯甲烷，加入11.9mg二环己基碳二亚胺7.9mgn-羟基琥珀酰亚胺，，室温磁力搅拌(300rpm)反应24h。反应结束后，将反应液中滴加至的160ml冷无水乙醚。4℃过夜，使产物充分析出。4℃条件下3000rpm离心5min，收集沉淀，烘干，得端氨基聚乙二醇-十八醇嫁接物(nh2-peg3400-odc)。

傅里叶变换红外光谱确证嫁接物结构，如附图1。产物红外光谱图，720ppm位置处出现归属于十八醇的连续四个亚甲基(-(ch2)4-)的变形振动峰，且3350ppm处的羟基(-oh)伸缩振动峰消失，1650ppm吸收峰归属为新形成酯键(c＝o)的伸缩振动峰。

二、游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)制备

实施例1

取20mg单硬脂酸甘油酯、1.0mg盐霉素(sal)、2mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径及表面电位分别为

实施例2

取20mg单硬脂酸甘油酯、1.5mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径90.2nm及表面电位为-9.5mv。

实施例3

取20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径93.2nm及表面电位为-10.2mv。

实施例4

取20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及1.5mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径为92.5nm及表面电位为-10.7mv。

实施例5

取20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及1.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径94.5nm及表面电位为-11.0mv。

实施例6

取20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、1.5mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径96.8nm及表面电位为-10.2mv。

实施例7

取20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、1.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径98.0nm及表面电位为-10.7mv。

实施例8

取20mg单硬脂酸甘油酯、1.0mg盐霉素(sal)、1.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物，精密称定，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相快速注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液0.5ml调节离子强度，絮凝纳米粒，得含游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)。经测定nh2-peg-sln/sal的粒径85.4nm及表面电位为-10.1mv。

三、肝癌干细胞靶向脂质纳米粒制备

实施例1

取由20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物制备的游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)分散液200μl。焦碳酸二乙酯处理水稀释纳米粒浓度至100μg/ml。加入14μl1.0mg/ml的n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)水溶液。室温搅拌反应9h。加入54.9μl1mm的端氨基适配体a15-nh2，继续搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液置于分子量为30kda的超滤离心管。4℃条件下20000rpm离心10min，弃滤液，加入0.5ml焦碳酸二乙酯处理水清洗，重复该步骤两次，除去未反应的适配体。未滤过液体即为a15-peg3400-sln/sal纳米混悬液。经测定纳米粒的粒径为126nm，电位为-14.6mv。

实施例2

取由20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物制备的游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)分散液200μl。焦碳酸二乙酯处理水稀释纳米粒浓度至100μg/ml。加入21μl1.0mg/ml的n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)水溶液。室温搅拌反应9h。加入54.9μl1mm的端氨基适配体a15-nh2，继续搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液置于分子量为30kda的超滤离心管。4℃条件下20000rpm离心10min，弃滤液，加入0.5ml焦碳酸二乙酯处理水清洗，重复该步骤两次，除去未反应的适配体。未滤过液体即为a15-peg3400-sln/sal纳米混悬液。经测定纳米粒的粒径为106nm，电位为-16.2mv。

实施例3

取由20mg单硬脂酸甘油酯、2.0mg盐霉素(sal)、2.0mg单硬脂酸聚乙二醇酯及2.0mgnh2-peg3400-odc嫁接物制备的游离氨基脂质纳米粒(nh2-peg-sln/sal)分散液200μl。焦碳酸二乙酯处理水稀释纳米粒浓度至100μg/ml。加入28μl1.0mg/ml的n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)水溶液。室温搅拌反应9h。加入54.9μl1mm的端氨基适配体a15-nh2，继续搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液置于分子量为30kda的超滤离心管。4℃条件下20000rpm离心10min，弃滤液，加入0.5ml焦碳酸二乙酯处理水清洗，重复该步骤两次，除去未反应的适配体。未滤过液体即为a15-peg3400-sln/sal纳米混悬液。经测定纳米粒的粒径为106nm，电位为-14.4mv.

连接a15适配体后，a15-peg3400-sln/sal的粒径为略有增大；端氨基消失，纳米粒电位下降。

四、肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒的肿瘤干细胞球摄取

实施例1：

取20mg单硬脂酸甘油酯、2mg单硬脂酸聚乙二醇酯，2mg盐霉素及2mgnh2-peg3400-odc，精密称定；另取100μg的硬脂胺-异硫氰酸荧光素，置于2.0ml无水乙醇，水浴50℃溶解，为有机相。20ml超纯水为分散相，机械搅拌条件下(400rpm)，有机相注入分散相，搅拌5min。饱和氯化钠溶液调节分散液的离子强度，絮凝纳米粒，制备荧光标记的游离氨基脂质纳米粒

取制备的荧光标记nh2-peg-sln纳米粒，焦碳酸二乙酯处理水稀释纳米粒浓度至100μg/ml。21μl1.0mg/ml的n,n-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(dsc)溶液。室温搅拌反应9h。加入54.9μl1mm的端氨基适配体a15-nh2，继续搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液置于分子量为30kda的超滤离心管。4℃条件下20000rpm离心10min，弃滤液，加入适量焦碳酸二乙酯处理水清洗，重复该步骤两次，除去未反应的适配体。未滤过液体即荧光标记的a15-peg-sln/sal纳米混悬液。

取免疫磁珠分选法分选得cd133⁺的肝癌肿瘤干细胞，并进行无血清悬浮球培养，待细胞球直径生长至约200μm时，加入荧光标记的a15-peg-sln/sal纳米混悬液，孵育不同时间(0.5h、2h、6h、12h)。

参见附图2，流式细胞仪检测摄取阳性细胞比例及细胞荧光强度，0.5h时7.5％的细胞可检测到高于未孵育对照组细胞的荧光值，6h时94.9％的细胞有绿色荧光信号，几乎细胞球所有细胞均有摄取。孵育时间继续延长，荧光强度右移，细胞内摄取量不断增多。a15修饰脂质纳米粒形成的肝癌干细胞靶向脂质纳米粒摄取递送至肿瘤干细胞。

五、肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒作为药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用

实施例1

采用酸性磷酸酶试验法法，测定游离盐霉素及肝癌干细胞靶向脂质纳米粒a15-peg-sln/sal的肿瘤干细胞抗增殖活性。取分选得cd133+肿瘤干细胞，无血清悬浮球培养，待细胞球直径生长至约200μm时，加入a15-peg-sln/sal纳米粒及盐霉素二甲亚砜溶液。37℃条件下与细胞球孵育48h。测定405nm处的吸光度值并计算细胞存活率。

肝癌肿瘤干细胞靶向脂质米粒的肿瘤干细胞ic50值为0.69±0.015μg/ml。盐霉素组细胞存活率随浓度的增加而下降，浓度为0.8μg/ml时，存活率降至55％时，继续增加盐霉素浓度，因受制于盐霉素溶解性，药物析出，细胞存活率改变不明显。研究结果表明，肝癌肿瘤干细胞靶向脂质纳米粒，可改善盐霉素的溶解性，作为药物载体可增强盐霉素药效。