脂质纳米颗粒及其应用

脂质纳米颗粒及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种脂质相关吲哚菁绿纳米颗粒，用于改善淋巴管、淋巴结、淋巴系统异常、肿瘤，炎症和血管造影的功能性高分辨率近红外荧光医学成像。
【专利说明】
脂质纳米颗粒及其应用
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2015年2月8日提交的美国临时专利申请第62/113,480号的权益和 优先权以及2015年4月7日提交的中国专利申请第201510160468. 1号的权益和优先权， 上述美国临时专利申请和中国专利申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及包含诸如吲哚菁绿（ICG)之类的染料的脂质纳米颗粒的制备和使用， 用于增强吲哚菁绿近红外荧光成像的强度和分辨率，并用于体内正常或异常组织和细胞的 显影及诊断。
【背景技术】
[0004] 为了对疾病进行有效治疗和诊断，能够对受影响的器官进行成像是比较有利的。 目前在本领域中已有多种被广泛使用的成像技术；然而，这些技术往往不具有通用性或者 缺乏能够识别脉管系统或淋巴系统的对比度。一种研究这些系统的新兴技术是光成像技 术，其被称为近红外荧光（NIRF)成像（~700-900nm)，该技术因不涉及电离辐射而具有非 常高的安全性，具有最小的来自血液和组织自体焚光（~500-600nm) ( 即，背景信号/焚 光）的干扰，并且是无创的。荧光成像方法涉及使用光线激发荧光染料并且检测从染料中 发射出的荧光，该荧光成像方法被广泛用于各种类型的生物成像。该方法用于血管造影术， 并且可用于手术过程中对血管功能和/或肿瘤转移的评估。不像其他技术那样，NIRF成像 还具有使淋巴系统成像的能力，这为临床医师提供了关于患者体内淋巴结构和功能的重要 信息。尽管如此，NIRF成像由于无法使深层组织成像（因光散射问题仅能使~lcm深度的 组织成像）而面临很多问题。
[0005] ICG是临床上NIRF成像中所使用的染料（具有820nm发射波长）并且是美国食品 与药品管理局（FDA)和欧洲药物管理局（EMA)唯一批准的用于人体的NIRF分子。ICG被 批准用于心输出量、肝脏功能和肝脏血流检测，以及眼部血管造影术。ICG存在着大量的标 签外和以研究为目的的使用情况，包括液体填充的解剖学结构（例如，血液、脑脊液、淋巴 或尿液）的可视化，或作为对比剂用于血管、肾脏或其它排泄途径的显影（1)。在水性环境 中，ICG分子聚集并且ICG荧光强度容易衰减（降低整体荧光强度）（2-5)。在血液中，ICG 与血浆蛋白结合，部分且暂时地改善了其荧光强度，但是最终仍然会与血浆蛋白解离进入 水相环境中被降解。在体内，ICG荧光强度和持续时间可随血浆蛋白和脂蛋白浓度的波动 以及个体之间的差异而发生变化。
[0006] 最近关于具有多种不同的生理化学性质的ICG和脂质体的报道描述了将ICG包裹 在脂质体内的资源密集型制备步骤（多4个步骤）（8-12)。然而，这些具有不同组成的脂质 体是在没有完全理解ICG和脂质之间的相互作用的条件下制备的。在一些条件下，当ICG 包裹在脂质体的水性腔室内时，ICG可能部分或通过物理键的形式与脂类分子膜发生相互 作用。根据这些方法结合的脂质-ICG以及脂质-ICG组合物是不完全且不稳定的。这些制 剂不以使ICG插入或嵌入脂质中为目的，从而导致ICG脂质体组合物无论在产品稳定性还 是在真正有效被稳定组装的ICG分子数目上均存在着很大的变异度，并且在其用作成像产 品方面的结果也各不相同。而且，哪怕仅一部分ICG可能被包裹进入脂质体的水性腔室，也 需要在制备过程中除去游离的ICG，该步骤会增加潜在的污染，并且由于损耗和分离过程而 增加成本。
[0007] 本领域亟需对ICG递送系统进行改善。

【发明内容】

[0008] -方面，本发明提供一种组合物，其包含（i)含有脂质膜和水性核的脂质纳米颗 粒，以及（ii)多个吲哚菁绿（ICG)，其中，ICG中的一个或多个嵌入所述脂质膜中。
[0009] 在一些实施方式中，脂质分子包含1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱 (l，2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphocholine，DSPC)和 1，2_ 二硬脂酰基 _sn_ 丙三 基-3_磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二醇-2000 (1，2-distearoyl-sn-glycero_3-phosphoe thanolamine-N-methoxy-polyethylene glycol-2000, DSPEmPEG2000)〇
[0010] 在一些实施方式中，至少约95%的ICG嵌入脂质膜中。在一些实施方式中，至少约 99%的ICG嵌入脂质膜中。在一些实施方式中，基本约100%的ICG嵌入脂质膜中。
[0011] 在一些实施方式中，低于5 %的ICG包裹在水性核中。在一些实施方式中，低于1 % 的ICG包裹在水性核中。在一些实施方式中，没有可检测量的ICG包裹在水性核中。
[0012] 在一些实施方式中，脂质纳米颗粒悬浮于盐组合物中，所述盐组合物包含生物相 容性缓冲液，例如，pH为5-8且渗透压为约303m0SM的生物相容性缓冲液。这些缓冲液的 实例包括生理盐水，林格氏溶液，5%葡萄糖水溶液或0.9%似(：1和约2〇1111似110) 3的缓冲 液。
[0013] 在一些实施方式中，纳米颗粒的平均尺寸是50nm至100nm。
[0014] 在一些实施方式中，纳米颗粒表面带有负电荷。
[0015] 在一些实施方式中，纳米颗粒在血清中稳定，并且，在25°C下，在热灭活的大鼠血 清中六小时后保留所述纳米颗粒的初始荧光的约90%至约100%。
[0016] 在一些实施方式中，所述纳米颗粒的荧光强度是水性溶液中游离ICG的荧光强度 的4倍至5倍。
[0017] 在一些实施方式中，在4°C下储存0至约300天之后，所述纳米颗粒的荧光强度是 水性溶液中游离ICG的荧光强度的4倍至100, 000倍。
[0018] 在一些实施方式中，所述组合物在低于约0. 5mg/kg体重的ICG剂量条件下有效。 在一些实施方式中，所述组合物在约0. 〇lmg/kg体重的ICG剂量条件下有效。
[0019] 另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文提供的组合物/LNP以及 任选地包含如何使用所述试剂盒的说明书。
[0020] 又一方面，本发明提供一种使受治者体内的组织或器官成像的方法，所述方法包 括：将适量的本文提供的组合物给药于需要进行成像的受治者，获取所述受治者的组织或 器官的图像。
[0021] 在一些实施方式中，所述组合物的给药途径选自全身给药和局部给药，其中，所述 全身给药包括血管内注射，所述局部给药包括皮下注射、皮内注射、粘膜下注射、浆膜下注 射、肿瘤内注射、肌肉内注射、口服、经鼻给药和肿瘤内注射。在本发明优选的实施方式中， 在通过血管内注射的方式给药的情况下，所述组合物的量等于约0.0 lmg/kg体重ICG剂量 至约0. 5mg/kg体重ICG剂量。在局部给药本发明的组合物的情况下，所述组合物的单点注 射量等于约〇? lng至约0? lmg ICG剂量。
[0022] 在一些实施方式中，所述组织或器官选自：淋巴管、二级淋巴组织、血管、诸如动脉 粥样硬化之类的内皮病变，癌症/肿瘤、诸如在炎症位点的三级淋巴组织、肝脏、胆管、胆囊 和肠道。
[0023] 再一方面，本发明提供一种制备纳米颗粒的方法，所述方法包括：(a)在有机溶剂 中混合吲哚菁绿（ICG)和脂质分子；(b)蒸发所述有机溶剂以形成包含所述脂质分子和ICG 的薄膜，以及（c)使用缓冲盐水水合所述薄膜并减小颗粒尺寸。
[0024] 在一些实施方式中，所述脂质分子包括1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷 酸胆碱（DSPC)和1，2_二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二 醇-2000(DSPEmPEG2000)。
[0025] 在一些实施方式中，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或DMS0。
[0026] 在一些实施方式中，所述缓冲盐水包含约0. 9% NaCl和约20mM NaHC03。
[0027] 在一些实施方式中，所述方法不包括过滤步骤，纯化步骤或分离步骤或者它们的 组合。
[0028] 再一方面，本发明提供一种含吲哚菁绿的颗粒，所述颗粒包含吲哚菁绿以及含有 脂质膜和水性核的颗粒，其中，所述吲哚菁绿嵌入所述脂质膜中。
[0029] 在一些实施方式中，基本上100%的吲哚菁绿嵌入所述脂质膜中。在一些实施方式 中，在所述水性核中没有可检测量的吲哚菁绿。
[0030] 另一方面，本发明提供一种用于光成像的对比剂，所述对比剂包含本文提供的含 吲哚菁绿的颗粒和用于分散所述含吲哚菁绿的颗粒的分散介质。
【附图说明】
[0031] 结合下文列出的示例性实施方式的具体描述可更好地理解本发明的特点和优势， 示例性的实施方式基于本发明的基本构思，其中涉及的【附图说明】如下：
[0032] 图1显不了二步制备过程的一种实例的不意图。
[0033] 图2显示了通过肌肉组织检测的ICG-LNP的荧光强度与游离ICG的荧光强度比 较。（A)填充了 30yM游离ICG (顶部）和ICG-LNP (底部）的毛细管的NIR荧光图像强度。 (B)图A中填充了不同ICG制剂的两个相同的毛细管的白光图像。（C)重叠于填充有游离 ICG (顶部）或ICG-LNP (底部）且放置于鸡胸组织方块下0. 5cm、1. 0cm和1. 5cm (分别从左 至右）的毛细管的可见光图片上的NIR荧光图像。（D)图C中的鸡胸组织方块的可见光图 像。（E)重叠于放置在鸡胸组织方块下0. 5cm、1. 0cm和1. 5cm的ICG-LNP毛细管的可见光 背景上的NIR荧光图像。（F)组织方块厚度的侧视图。
[0034] 图3显示了 ICG-LNP荧光强度以及荧光产量vs.游离ICG的荧光强度以及荧光产 量。（A)脂质：ICG摩尔比对ICG荧光产量（每微摩尔ICG的荧光强度）的影响。制备具 有不同脂质：ICG摩尔比的ICG-LNP，在标示的浓度条件下测量它们的每单位ICG的荧光强 度。为了清楚起见，只提供八个ICG-LNP制剂中的三个，根据它们的脂质：ICG摩尔比标记它 们的数据点：（#)250:1脂质：ICG摩尔比，（0 ) 350:1脂质：ICG摩尔比，和（_)100:1 脂质：ICG摩尔比以及（A)仅ICG。每个荧光强度数据点是八次重复测量的平均值土SD。 (B)脂质：ICG摩尔比对荧光产量的影响。图A中的数据用于计算斜率（每微摩尔ICG的荧 光强度）并且在不同摩尔比条件下相对于脂质：ICG摩尔比绘图：（〇）仅游离ICG和（鲁） ICG-脂质纳米颗粒（ICG-LNP)。每个数据点是六次重复测量的平均值土SD。
[0035] 图4是肿瘤的检测，显示了分离的肿瘤的切片中ICG-LNP的荧光强度，所述肿瘤由 执业病理学家表征为恶性纤维肉瘤（顶部）和鳞状细胞癌（底部）。
[0036] 图5显示了来自两只不同的小鼠左腿下方皮肤处的图像。使用ICG-LNP检测到两 只链脲佐菌素（STZ)l型糖尿病小鼠的皮肤中的炎症、淋巴管新生以及三级淋巴器官。
[0037] 图6显示了使用ICG-LNP在小鼠右腿中检测到带有血管周围单核细胞（淋巴细胞 和组织细胞/巨噬细胞）累积的淋巴异常。该图像中小鼠的皮肤被除去。
[0038] 图7显示了使用ICG-LNP检测到小鼠的左膝后窝淋巴结的左淋巴输入管中的淋巴 管新生、淋巴管扩张以及三级淋巴器官。这些图像中的每一个中小鼠的皮肤已被除去。
[0039] 图8显示了使用ICG-LNP检测到淋巴管中的淋巴管示踪和淋巴管扩张，在两只不 同的小鼠中，所述淋巴管将左髂骨下（腹股沟）的淋巴结连接至左腋淋巴结。
[0040] 图9显示了使用ICG-LNP检测到小鼠中的髂骨肌淋巴结、乳糜池以及胸淋巴导管 的高分辨图像。
[0041] 图10显示了皮下足部注射之后淋巴结中的ICG-LNP的NIR荧光与游离ICG的NIR 荧光比较。（A，B)腋窝淋巴结，（C，D)髂骨肌&胃淋巴结，（E，F，G，H)膝后窝&坐骨淋巴结。
[0042] 图11显示了足部皮下给药ICG-LNP的小鼠腋窝淋巴结的组织切片的NIR荧光显 微图像。间断的荧光表明ICG-LNP颗粒的体内稳定性以及从注射位点通过淋巴系统沿着广 泛路径进入淋巴结和淋巴组织的内部。一些ICG-LNP是细胞内的并且与巨噬细胞和树突细 胞相关。
[0043] 图12显示了 ICG-LNP的储存稳定性。ICG-LNP和游离ICG在4°C下储存于暗处持 续多达313天，并且在标记的时间点分析ICG荧光：（A )游离ICG和（鲁）ICG-脂质纳米 颗粒（ICG-LNP)。基于指数衰减模型分析时间过程数据，并且列出半衰期t1/2(天数）值和 速度常数k(天数的倒数）值。虚线表示检测限。每个数据点是三次至八次重复测量的平 均值土标准差（SD)。
[0044] 图13显示了 ICG-LNP减少了由于暴露于光线引起的ICG荧光淬灭。ICG-LNP和游 离ICG暴露于顶部荧光光线持续12小时。在6小时和12小时记录ICG荧光。黑色柱代表1CG-LNP数据，灰色柱数据表示仅ICG。每个数据点是八次重复测量的平均值土SD。
[0045] 图14显示了 ICG浓度依赖性LNP聚集以及表观尺寸增加。图A :ICG浓度对LNP 的90°光散射强度的影响。在固定液量中，使用不同浓度的ICG孵育固定浓度的LNP。在 第20分钟，稀释混合物以停止反应并且用荧光光度计测量90 °光散射强度。空心圆符号表 示只有空脂质的纳米颗粒，实心圆符号表示ICG脂质纳米颗粒（ICG-LNP)，并且空心三角形 符号表示仅游离ICG。每个数据点是十次重复测量的平均值土SD。图B:由与入射光（hv) 路径呈90°的光电倍增管（PMT，黑色水平柱）检测到的光散射效率随LNP聚集和粒度直径 增加而发生变化的示意图。图C:通过LNP光子相关光谱分析ICG浓度对粒度的影响。在 收集了图A的数据之后，进行粒度分析。空心圆符号表示只有空脂质的LNP，实心圆符号表 示ICG脂质纳米颗粒（ICG-LNP)。每个数据点是数据收集八分钟之后由数字自动关联计算 得到的平均值土 SD。
[0046] 图15显示了 ICG脂质纳米颗粒（ICG-LNP)的荧光强度增加。在固定液量中，用不 同浓度的ICG孵育固定浓度的LNP。在第20分钟，用缓冲液稀释混合物20倍以停止反应 并用荧光光度计测量荧光强度，如实施例所描述的那样。空心三角形符号表示仅有游离的 ICG，实心圆符号表示ICG脂质纳米颗粒（ICG-LNP)。每个数据点是八次重复测量的平均值 土SD。
[0047] 图16显示了皮下注射之后小鼠体内的ICG脂质纳米颗粒与游离ICG NIR图像表 现的比较。图A :皮下注射ICG脂质纳米颗粒（ICG-LNP，左足）或游离ICG(右足）并且在 第六分钟收集NIR荧光图像。荧光图像重叠于可见光图像上，以用于解剖学表示。虚线圆 表示局部膝后窝结。以仰卧位观察小鼠。在仅用游离ICG(图B)或ICG-LNP(图C)处理六 分钟的另一组小鼠中，除去皮肤并进行进一步分析。图B :可见光图像是收集的在小鼠右足 用游离ICG处理的小鼠的右腿图像。对应的荧光图像重叠于其上。双箭头（>>)表示游离 ICG看起来扩散在整个肌肉组织中和膝后窝淋巴结（虚线圆）中的隐静脉。以仰卧位观察 小鼠。图C:可见光图像是收集的在小鼠右足用ICG-LNP处理小鼠的右腿图像。将对应的 荧光图像重叠于其上。虚线圆表示膝后窝淋巴结并且粗体箭头表示腹部骨盆和生殖器/局 部淋巴结。以仰卧位观察小鼠。
[0048] 图17显示了在小鼠足部皮下给药后通过皮肤检测到的在第二引流淋巴结（坐骨 淋巴结，从膝后窝坐骨淋巴结开始~2cm)中游离ICG和ICG-LNP的荧光强度的药物动力 学。平均值土标准误（SEM)。图17显示了采用用于使注射位点的第二下游淋巴结（坐骨 淋巴结）可视化的ICG-LNP实现了荧光强度的提高。使用ICG-LNP实现的荧光强度是游离 ICG实现的荧光强度的两倍至三倍。仅采用ICG-LNP而不使用游离ICG还显示出清楚的分 布和清除特特征。
[0049] 图18显示了在尾静脉内注射ICG-LNP之后通过皮肤检测到的肝脏药物动力学。当 在小鼠尾静脉内IV注射ICG-LNP时，ICG-LNP容易从肝脏中清除，且终末消除半衰期为1. 2 小时。因此，在大约8小时（约7个半衰期）内ICG-LNP完全从肝脏中清除。这与传统脂 质体的表现完全不同，传统脂质体由于Kupffer巨噬细胞的摄取而残留在肝脏中（Daemen T 1997H印atology 26(2) :416-423)。ICG-LNP从肝脏中通过胆管清除进入肠道。因此， ICG-LNP可用于评估肝-胆功能。
[0050] 图19显示了在正常小鼠、糖尿病小鼠或带有实体肿瘤的小鼠的足部皮下注射游 离ICG和ICG-LNP之后，通过淋巴结（膝后窝和坐骨）的皮肤的体内荧光强度。图19显示 了 ICG-LNP在正常小鼠和患病（糖尿病或者带有肿瘤）小鼠中通过足部皮下注射位点检测 膝后窝和坐骨淋巴结（分别检测第一和第二引流淋巴结）的能力。如上图1和表2、表3所 示，ICG-LNP可用于评估这些疾病模型中的淋巴功能。在正常小鼠中，由ICG-LNP获得的比 游离ICG更亮的图像表明获得增强的荧光强度和更高的分辨率是可能的。
[0051] 图20显示了通过足部皮下给药ICG-LNP的小鼠的膝后窝淋巴结附近的皮肤检测 淋巴管异常。图20显示了 ICG-LNP通过皮肤检测淋巴管异常的能力。左图显示了小鼠右 膝后窝淋巴结上方移动的异常淋巴管。在右图的正常小鼠中，没有检测到这种淋巴管。这 些观察结果在将皮肤去除之后使皮肤下方淋巴管成像而得到证实。
[0052] 通讨引用的并入
[0053] 本发明说明书中提到的所有公开出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本 文，其程度与具体且单独地说明每个单独的公开出版物、专利或专利申请通过引用并入本 文相同。
【具体实施方式】
[0054] 下文结合实例应用来描述本发明的几个方面，用于举例说明。应当理解的是，以下 通过列举多种具体细节、相互关系以及方法以提供对本发明的全面理解。然而，本领域技术 人员易于意识到，本发明可不采用具体细节中的一种或多种来实施或者可采用其他方法来 实施。本发明不限于举例说明的操作顺序或事件顺序，一些操作可以不同的顺序发生和/ 或与其他操作或事件同时发生。
[0055] 而且，不要求将所有举例说明的操作或事件都用于实施根据本发明的方法。
[0056] 术语"约"或"大约"意指由本领域技术人员确定的特定数值在可接受的误差范围 内，所述可接受的误差范围部分取决于如何测定或确定所述数值，即，测量系统的限制。例 如，根据本领域的实践，"约"可指在1或大于1的标准偏差范围内。可选地，"约"可指给定 值的高达20%的范围，优选地，给定值的高达10%的范围，更优选地，给定值的高达5%的 范围，以及更加优选地，给定值的高达1 %的范围。可选地，尤其针对生物系统或过程，术语 "约"可指数值的某数量级范围内，优选地，数值的5倍范围内，更优选地，数值的2倍范围 内。在本申请和权利要求中描述具体数值时，除非另有说明，应当假设术语"约"是指该具 体数值在可接受的误差范围内。
[0057] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语总体上具有与本领域技术人员通 常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和在细胞培养、细胞遗传学、有机化学 和核酸化学以及杂交中的实验步骤是本领域所熟知且常用的。标准技术用于核酸和肽合 成。技术和步骤通常根据本领域的常规方法和各种常用参考文献来实施，这些常规方法和 常用参考文献在全文中提供。本文使用的命名法和下文描述的分析化学和有机合成的实 验步骤是本领域所熟知的并且是本领域常用的。标准技术或其改良用于化学合成和化学分 析。
[0058] I.组合物
[0059] 本发明涉及生物医学成像的组合物以及应用，更加具体而言，本发明涉及独特的 制备方法、组合物和直径为纳米尺寸的用于近红外荧光（NIRF)医学成像的红外荧光发光 颗粒，所述成像包括血液成像、组织成像以及淋巴脉管系统和淋巴结（LN)成像。
[0060] 一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含：（i)含有脂质膜和水性核的脂 质纳米颗粒（例如，球体）；和（ii)多个吲哚菁绿（ICG)，其中，多个ICG中的一个或多个嵌 入所述纳米颗粒的脂质膜。
[0061] A.脂质纳米颗粒
[0062] 总体而言，本文提供的组合物包含纳米颗粒。
[0063] 本发明的纳米颗粒的尺寸可为约20nm至20 ym，例如，约20nm至5 ym，约80nm至 2 y m，约80nm至1 y m。因此，虽然本文中称为"纳米颗粒"，但是微米尺度的颗粒也包括在 本文的范围内。对于静脉内或动脉内注射给药而言，颗粒尺寸优选为约80nm至100nm。对 于其他给药途径而言，例如，经鼻给药，可使用较大的颗粒。在一些实施方式中，使用尺寸为 约20nm至300nm，例如，约20nm至lOOnm，20nm至50nm的颗粒。每种可能性代表本发明的 单独的实施方式。
[0064] 在一些实施方式中，颗粒的粒度不受特定限制，条件是当所述颗粒用作对比剂时， 尤其是用于淋巴结的对比剂时，将所述颗粒的流体动力学平均粒度设定为1，〇〇〇nm或更小 可提高所述颗粒被淋巴管或组织摄取的容易性（组织渗透性）及其在淋巴结或组织中的保 持力。
[0065] 当粒度为1，OOOnm或更小时，相对于在生物体的正常位点的积累量，更大量的颗 粒可通过提高的渗透性和滞留效应（EPR)积累在生物体的肿瘤位点。肿瘤位点可通过检测 具有各种不同的成像形态（例如，荧光和光声学）的积累的颗粒而进行特异性成像。此外， 当粒度超过1，〇〇〇nm时，无法预期在诸如淋巴管之类的组织中的有效摄取。因此，平均粒度 优选地设定为l〇nm或更大以及1，OOOnm或更小。平均粒度更加优选地为20nm或更大以及 500nm或更小，尤为优选地为20nm或更大以及200nm或更小，特别优选地为20nm至lOOnm。 这是因为当颗粒的粒度为200nm或更小时，颗粒很难被血液中的巨噬细胞摄取，因此，可改 善颗粒在血液中的保持力。
[0066] 粒度可通过采用电子显微镜观察测量或可通过基于动态光散射法的粒度测量方 法进行测量。当基于动态光散射法测量粒度时，采用动态光散射分析仪（Particle Sizing Systems, Port Richey, FL生产的PSS-NICOMP 380ZLS仪器）由动态光散射（DLS)法测量流 体动力学直径。
[0067] 本文使用的术语"约"涉及诸如量或尺寸之类的可测量的数值时，意在包括特定值 的+/-10 %的变量，更加优选地+/-5 %的变量，甚至更加优选地+/-1 %的变量，以及尤为优 选地+/-0. 1%的变量，这些变量适于实现所期望的目的。
[0068] 本文使用的纳米颗粒的"尺寸"是指纳米颗粒的最长维度（宽度、长度或直径）在 指定的范围内。通常，含有纳米颗粒的制剂中的平均粒度在指定范围内。所述纳米颗粒可具 有均一的形状，例如，球形或细长形，或可具有多种形状。优选地，本文的纳米颗粒是球形。
[0069] 在一些实施方式中，纳米颗粒的平均尺寸为50nm至100nm，优选地为50nm至 80nm〇
[0070] 总体而言，本文提供的组合物（例如，药物组合物）中的纳米颗粒具有约 50 ± 5nm,约 55±5nm,约 60±5nm,约 65±5nm,约 70±5nm,约 75±5nm,约 80±5nm,约 85±5nm,约90±5nm,约95±5nm,或约100±5nm的均一性。在一些实施方式中，LNP具有 ± lnm, ±2nm, ±3nm, ±4nm,或 ±5nm 的均一f生。
[0071] 本发明的纳米颗粒可带有正电荷或负电荷。本文使用的纳米颗粒的"电荷"是指 它们的表面电荷，称为G电位。对于静脉内给药或动脉内给药而言，带有负电荷的颗粒目 前是优选的。带负电荷的颗粒的表面电荷电位）的范围可为约-20mV至-55mV。
[0072] 粒度和G电位的测量可通过本领域已知的方法进行，例如，使用商售仪器（例如， Zetasizer NanoZS (Malvern, UK))通过动态光散射（DLS)进行粒度和G电位的测量。
[0073] 在一些实施方式中，纳米颗粒带有约_5mV至-100mV的表面负电荷。
[0074] 在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒是脂质体。
[0075] 本发明中使用的脂质颗粒可被制备成包括脂质体成型脂质和磷脂以及膜活性固 醇（例如，胆固醇）。脂质体可包括其他不是脂质体成型脂质的脂质和磷脂。
[0076] 磷脂可选自例如：卵磷脂（例如，鸡蛋或大豆卵磷脂），磷脂酰胆碱（例如，鸡蛋磷 脂酰胆碱），氢化的磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，二棕榈酰基磷脂酰胆碱，二硬脂酰基磷脂 酰胆碱，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱，双月桂酰基磷脂酰胆碱，甘油磷脂（例如，磷脂酰甘油， 磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇磷酸，磷脂酰肌 醇双磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸），鞘磷脂，心磷脂，磷脂酸，缩醛磷脂，或者它们的混合物。每 种可能性代表本发明的单独的实施方式。
[0077] 可使用的其他脂质的实例包括糖脂（例如，甘油糖脂，例如，半乳糖脂和硫代脂 质，鞘糖脂，例如，脑苷脂，葡萄糖脑苷脂和半乳糖脑苷脂，以及糖基磷脂酰肌醇），鞘磷脂 (例如，神经酰胺磷酸胆碱，神经酰胺磷酰基乙醇胺和神经酰胺磷酰基甘油），或者它们的 混合物。每种可能性表示本发明的单独的实施方式。
[0078] 带负电荷或带正电荷的脂质纳米颗粒可例如通过使用阴离子或阳离子磷脂或脂 质获得。这些阴离子/阳离子磷脂或脂质通常具有亲脂基团，例如，固醇，酰基或二酰基链 并且其中，脂质具有总体净负电荷/正电荷。
[0079] 上述脂质和磷脂可购买获得或根据本领域公开的方法制备。
[0080] 脂质颗粒可通过本领域已知的方法制备，参见例如Scholar等 人,2012,International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, 3 (2) : 14-20 ;Akbarzadeh 等人，2013, Nanoscale Research Letters, 8:102 中公 开的方法。示例性的方法在下文中描述。通过小孔膜（例如聚碳酸酯膜）挤出脂质体是将 尺寸降低至相对明确界定的尺寸分布的有效方法。通常，使悬浮液循环穿过膜几次（使用 孔径递减的膜），直至得到理想的脂质体尺寸分布。连续通过孔较小的膜挤出脂质颗粒能够 逐步将脂质体尺寸降低至理想尺寸。经过尺寸降低处理的脂质颗粒悬浮液可易于通过颗粒 识别尺寸为例如约0. 2 ii m的灭菌膜进行杀菌，例如常规0. 22 ii m厚的膜过滤器。如果需要 的话，脂质体悬浮液可在存在合适的储存用冷冻保护剂的条件下被冻干并在使用前通过简 单水化而复溶。
[0081] 总体而言，如本文更加详细地描述的，本发明的脂质纳米颗粒通过将诸如ICG之 类的染料与脂质分子混合，随后产生颗粒来制备。
[0082] 在一些实施方式中，形成纳米颗粒的脂质分子包括两种磷脂种类，1，2-二硬脂酰 基-sn-丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC)和1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲 氧基-聚乙二醇-2000 (DSPEmPEG2000)。
[0083] B.荧光染料
[0084] 在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒包含至少一种嵌入脂质中的近红外（NIR) 荧光染料（或探针）。
[0085] 在一些实施方式中，结合是非共价结合。
[0086] 本文中的"近红外（NIR)荧光染料"或"近红外（NIR)荧光探针"是指适于成像 应用的分子或实体，其能够在NIR光谱范围内吸收和发射光。具体而言，本文中的"近红外 (NIR)荧光染料"或"近红外（NIR)荧光探针"是具有在NIR光谱范围内，优选地在约700nm 至900nm的范围内的激发光和发射光的荧光实体。NIR辐射通常限定为具有约700nm至 1400nm的波长。本发明的NIR荧光探针优选地是那些吸收和发射在约700nm至900nm的范 围内的NIR光的NIR荧光探针，所述约700nm至900nm的范围被认为是生物"NIR窗口 "。
[0087] 合适的NIR荧光探针的实例包括染料，例如，花青染料，例如，吲哚菁绿（ICG)， Cy5, Cy5. 5, Cy5. 18, Cy7 和 Cy7. 5 ; IRBYE?, ALEXA FLUOR? 染料，BODIPY? 染 料，ANGIOS TAMP?染料，SENTIDYE ?染料，XENOLIGHT DIR ?荧光染料，VIVOTRACK ?NIR 荧光显像剂，KODAK X-SIGHT?染料和共辄物，DYLIGHT ?染料。NIR量子点也可用作探针 (NIR量子点的合成和功能化在例如Ma等人，2010，Analyst，135:1867-1877中描述）。每 种可能性代表本发明的单独的实施方式。其他染料包括亚甲基蓝、ProSense和MMPSense。 Figueiredo, J. L. , Alencar, H. , ffeissleder, R. &Mahmood, U. Near infrared thoracoscopy of tumoral protease activity for improved detection of peripheral lung cancer. Int.J.Cancer 118,2672 - 2677(2006)，以及 Nguyen，Q. T?，和 Tsien，R.Y. (2013) Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation:A new cutting edge. Nat. Rev. 13, 653-662。
[0088] 在一些实施方式中，荧光染料是亲脂性（Log P>2)荧光染料，分子量为 300_1500g/mol，例如，吲噪普绿，亚甲基蓝，ProSense和MMPSense。
[0089] 下表列出了可嵌入本发明的脂质纳米颗粒中的其他NIR染料。任何发荧光的疏水 小分子可嵌入本发明的脂质纳米颗粒中。
[0090] 近红外荧光染料列表。
[0091]
[0092]
[0093] 用于本发明的纳米颗粒的NIR荧光探针的特定实施方式是吲哚菁绿（ICG)。
[0094] ICG是临床上用于NIRF成像的染料（具有820nm的发射波长）并且是唯一由美国 食品和药品管理局（FDA)和欧洲药物管理局（EMA)批准的用于人体的NIRF分子。ICG被 批准用于心输出量、肝脏功能和肝脏血流检测，以及眼部血管造影术。ICG存在着大量的标 签外和以研究为目的的使用情况，包括液体填充的解剖学结构（例如，血液、脑脊液、淋巴 或尿液）的可视化，或作为对比剂用于血管、肾脏或其它排泄途径的显影（1)。在水性环境 中，ICG分子聚集并且ICG荧光强度容易衰减（降低整体荧光强度）（2-5)。在血液中，ICG 与血浆蛋白结合，部分且暂时地改善了其荧光强度，但是最终仍然会与血浆蛋白解离进入 水相环境中被降解。在体内，ICG荧光强度和持续时间可随血浆蛋白和脂蛋白浓度的波动 以及个体之间的差异而发生变化。
[0095] 本发明的纳米颗粒可包括高达约10% (w/w)的NIR焚光探针，例如高达约5% (w/ W)的NIR荧光探针，高达约1% (w/w)的NIR荧光探针，高达约0. 5% (w/w)的NIR荧光探 针，约0? 005% -5% (w/w)的NIR荧光探针。
[0096] C. ICG-LNP
[0097] 另一方面，本发明提供ICG-LNP，其中，ICG中的一个或多个嵌入纳米颗粒的脂质 中。
[0098] 脂质体包裹的ICG(即，ICG在脂质体的水性核内）（8-12)导致ICG和脂质之间发 生弱相互作用。
[0099] 为了克服这些限制，尝试将ICG加至疏水聚合物、血清白蛋白和脂质体中。不是所 有脂质体和脂质纳米颗粒都具有类似结构，一些脂质体和脂质纳米颗粒可能由具有不同头 部基团和脂肪酰基链的磷脂构成，而其他脂质体和脂质纳米颗粒可包括胆固醇或其他添加 物，所有这些均可改变脂质体的生理化学性质（6)。脂质的极性头部基团影响颗粒表面电荷 和水合程度，其影响体内调理素作用的水平和引起清除的补体结合的水平，并且脂质脂肪 酰基尾部的饱和量和链长通过改变脂质双层的刚性、厚度和均匀性影响脂质相变温度（Tc) (6)。因此，每个变量可能不仅仅影响ICG和脂质之间的稳定性和相互作用，并且还影响颗 粒的体内行为。
[0100] 本发明提供具有很强（不可逆地结合）的ICG-脂质相互作用的新型ICG-LNP，所 述ICG-脂质相互作用由本发明提供的将ICG嵌入脂质颗粒中而产生。制备脂质体包裹的 ICG需要纯化/过滤步骤以除去游离（未包裹的）ICG，在本发明中不需要进行所述纯化/ 过滤步骤，因为在本发明中能够达到脂质中基本上完全100 %的嵌入效率。
[0101] ICG-LNP的一个重要特性是其减低或甚至消除与ICG的浓度依赖性自淬灭性质有 关的缺陷。参见图3。因为ICG的吸收光谱和发射光谱高度重叠，所以ICG表现出浓度依赖性 荧光淬灭（自淬灭）。因此，重要的是，不仅仅限定脂质-ICG的相互作用，而且还限定脂质中 ICG分子的最佳密度，所述最佳密度表现出每个ICG分子的最大焚光强度和最小自淬灭。参 见图3。与大部分红外染料的普遍荧光性质相反，ICG在浓度低至几微摩尔（y M) ICG时发生 自淬灭。虽然已对脂质体和脂质-ICG混合物进行了很多研究，但是没有研究从整体上考虑 自淬灭性质，该自淬灭性质导致荧光稳定性和强度发生改变，并且更加重要的是，实现本发 明的改进（通过最小化自淬灭）。本发明提供简单的三步骤程序产生稳定的ICG脂质纳米颗 粒产品，用于高分辨率的NIRF成像。Kraft JC, Ho RJ(2014) Interactions of indocyanine green and lipid in enhancing near-infrared fluorescence properties:the basis for near-infrared imaging in vivo. Biochemistry ;Mar 4 ;53 (8): 1275-83,该参考文南犬 的全部内容通过引用并入本文。
[0102] 在一些实施方式中，至少约90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，97. 5% ，98%，98. 5%，99%，99. 5%或99. 9%的ICG嵌入脂质膜中。在一些实施方式中，偏差为+/ ~0. 1 % , +/-0. 2 % , +/~0, 3 % , +/-0. 4 % , +/~0, 5 % , +/-0. 6 % , +/-0. 7 % , +/-0. 8 %, +/-0. 9 % , +/- 10. 0%。在一些实施方式中，至少97. 8+/-0. 6%的ICG嵌入脂质膜中。
[0103] 在一些实施方式中，基本上或全部100%的ICG嵌入脂质膜中。
[0104] 在一些实施方式中，少于5%，4%，3%，2%，1%，0? 9%，0? 8%，0? 6%，0? 5%，0? 4 % ,0.3% ,0.2%，0. 1% ,0.01%或0.001%的ICG包裹在脂质纳米颗粒的水性核中。
[0105] 在一些实施方式中，没有可检测量的ICG包裹在脂质纳米颗粒的水性核中。
[0106] 嵌入脂质膜或包裹在脂质纳米颗粒的水性核中的ICG的量或百分比使用本 领域已知的方法测量，例如，Bilayer/water partitioning studies by equilibrium dialysis, Joguparthi V, Feng S, Anderson BD. Determination of intraliposomal pH and its effect on membrane partitioning and passive loading of a hydrophobic camptothecin,DB-67.Int J Pharm. 2008Mar 20 ；352 (1-2):17-28.Epub 20070ctl2. PubMed PMID:18065174;PubMed Central PMCID:PMC2277365,该参考文献的全部内容通过 引用并入本文。
[0107] 在一些实施方式中，ICG与脂质的比例为约0. 3至约0. 2mol/mol，0. 3至0. lmol/ mol，0. 3 至 0.09mol/mol，0. 3 至 0.08mol/mol，0. 3 至 0.07mol/mol，0. 3 至 0.06mol/mol， 0? 3 至 0? 05mol/mol，0. 3 至 0? 04mol/mol，0. 3 至 0? 03mol/mol，0. 3 至 0? 02mol/mol 或 0? 3 至 0. 001mol/mol。
[0108] 在一些实施方式中，在脂质嵌入组合物中使用的ICG的剂量是水性ICG(临床使 用）剂量的十分之一，如在每个患者/程序中使用的ICG-LNP的量中所反映的。
[0109] 在一些实施方式中，本发明的纳米颗粒除了包括NIR荧光探针之外，还可包括至 少一种可由核磁共振成像（MRI)检测的磁性探针。
[0110] 在一些实施方式中，所述磁性探针以共价或非共价的方式结合至纳米颗粒的外表 面。在其他实施方式中，磁性探针被包含在或嵌入纳米颗粒的内核中或被纳米颗粒包裹。
[0111] 磁性纳米颗粒包括永久磁性颗粒和在暴露于外部磁场之后可磁化但是当外部磁 场移除时失去其磁性的那些颗粒。磁性材料或在暴露于磁场之后可磁化，当磁场移除时失 去其磁性的材料是指超顺磁材料。合适的超顺磁材料的实例包括但不限于：铁、混合的铁氧 化物（磁铁矿）或y-三氧化二铁（磁赤铁矿）以及包括诸如锌之类的其他元素的取代的 磁铁矿。超顺磁颗粒的尺寸可为约lnm至约20nm，例如约lnm至10nm，约5nm-20nm〇
[0112] 超顺磁颗粒的制备以及包含这些超顺磁颗粒的纳米颗粒的制备可通过本领域 已知的方法进行，例如，在 De Cuyper et al.，1988, Eur Biophys J, 15:311-319 中所 描述的方法。其他方法例如在US 7，175,912，US 7，175,909和1^20050271745以及 TO2014002100A1中描述，这些参考文献的全部内容通过引用并入本文。
[0113] D. ICG-LNP 的件质
[0114] 总体上，本发明提供脂质相关颗粒，例如，吲噪青绿颗粒，其具有提尚的稳定性和 体内性能（参见，例如图12和图13)，用于改善淋巴管、淋巴结、淋巴异常、肿瘤和炎症的功 能性高分辨率近红外荧光医学成像（参见，例如，图4-11和16-20)。
[0115] 本发明提供的颗粒所实现的荧光强度高于并超出先前含有吲哚菁绿（ICG)的脂 质体或其他聚合物载体所实现的荧光强度。
[0116] 本发明提供研发用于生物相容性吲哚菁绿（ICG)纳米颗粒的独特的、简单的和可 成比例扩大生产的组合物和制备方法，所述纳米颗粒使ICG强度提高4. 5倍或更高，由此改 善成像分辨率和灵敏度，从而使用近红外荧光（NIRF)生物成像检测被掩蔽的组织和细胞。 这种4. 5倍或更高的ICG荧光强度的增大是前所未有的并且是新颖的。不像先前描述的包 裹有ICG的脂质体组合物和有限的脂质-ICG的偶然结合那样（所述包裹有ICG的脂质体 组合物和有限的脂质-ICG的偶然结合涉及难处理的且资源密集型制备步骤），本文所述的 组合物和方法提供一种简单而又有效的三步制备程序（参见，例如，图1)，所述组合物和方 法绝对稳定地将100% ICG嵌入脂质中并且在生物液体和溶液中带来潜在的最大强度。这 种由简单且有效的制备程序产生的ICG荧光强度和稳定性的提高的组合（参见，例如图3， 图12和图13)先前并未实现。
[0117] 在一些实施方式中，本文提供的颗粒使ICG荧光强度相对于水性ICG(13)的荧光 强度提高至少2倍，3倍，4倍，4. 5倍，5倍，6倍或甚至更高倍，这是任何所报道的包含脂质 体的载体未实现的。
[0118] 本领域技术人员已尝试将ICG包裹在蛋白质中或将ICG与蛋白质结合，但是并未 实现这种荧光强度的提高以及伴随产生的本发明的稳定性（参见，例如，图11-图13)。许 多科学家已尝试包裹过高浓度的ICG(10-12,14)，这实际上因荧光信号的浓度依赖性自淬 灭而使ICG的荧光强度降低。
[0119] 本文提供的纳米颗粒产生的ICG荧光强度的大幅度增大使光线透射穿过厚度为 lcm或更厚的组织（参见，例如，图2)。这相对于游离ICG所达到的光线透射穿过的组织厚 度产生了显著改善（13)，游离ICG的荧光强度使光线仅仅渗透约0. 5cm的组织（参见，例如 图2)。这种由荧光强度的增大而产生的提高的组织渗透深度是本发明另一非显而易见且新 颖的元素。
[0120] 具体而言，在美国专利公开US2014/0341813A1中提供一种使用离散剂（例如，尿 素、胍、碘或其他离子）的pH-梯度方法，从而防止ICG的J-聚集并且使高浓度的单体形式 的ICG(多ImM ICG)包裹在脂质体的水性核中。然而，本领域已知，在水中，ICG在浓度为 约5 y M ICG的条件下开始形成聚集体（2,15-17)。虽然离散剂用于降低水分子和ICG之间 的引起不稳定和聚集的相互作用，但该专利申请中所述的浓度（比导致ICG聚集的那些浓 度高至少200倍）易于发生浓度依赖性淬灭并且易于损失荧光强度。实际上，虽然NIRF成 像是建议的应用/领域，但是发明人注意到在第0135段中公开了"在本发明中，由于染料的 累积而产生的淬灭是由抑制染料的泄露而产生的"。因此，这些颗粒中的荧光发射强度会非 常有限。
[0121] 在一些实施方式中，纳米颗粒的荧光强度是水性ICG的荧光强度的2倍至10倍。
[0122] 在一些实施方式中，纳米颗粒的荧光强度是水性溶液中的游离ICG的荧光强度的 4倍至5倍。
[0123] 本文提供的纳米颗粒相对于本领域已知的颗粒具有优异的稳定性（参见，例如图 11-13)〇
[0124] 除了优化ICG-LNP制剂以实现最大荧光产量之外，相对于环境作用的稳定性也是 必需的。光线使ICG产生单态氧，其通过二氧杂环丁烷反应化学分解ICG(ICG的聚甲炔链 裂解成两种羰基产物，其可能具有细胞毒性）（18,19)。通常在光线充足的临床环境和手术 视野中，这种光线分解是需要避免的问题。
[0125] 在其目前提供的形态中，水性溶液中的游离ICG因光线而在数秒内分解。本发明 公开了将ICG嵌入脂质中避免光线降解（参见，例如，图13)。ICG-LNP可在室温下暴露于 光线持续若干小时并且保持几乎全部其原始荧光强度（参见，例如，图13)。
[0126] 本文提供的纳米颗粒保持荧光强度超过其他报道（例如，室温下42天（9)以及 4°C下70天（20))中的那些荧光强度（参见，例如，图12)。
[0127] 在一些实施方式中，当本文提供的ICG颗粒产品在黑暗、4°C条件下储存于水性悬 浮液中时，保持其荧光强度持续至少约2个月，3个月，4个月，5个月，6个月，7个月，8 个月，9个月，10个月，11个月，或12个月或更长时间（参见，例如，图12)。总体而言， 保持至少约50%至约60%，约50%至约65%，约50%至约70%，约50%至约75%，约 50%至约80%，约50%至约85%，约50%至约90%，约50%至约95%，或约50%至约 100%的荧光。
[0128] 在一些实施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清中稳定，并且在25°C下在热灭活 的大鼠血清中6小时后保持其初始荧光的约50%至约60%，约50%至约65%，约50% 至约70%，约50%至约75%，约50%至约80%，约50%至约85%，约50%至约90%， 约50%至约95%，或约50%至约100%。在一些实施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清 中稳定，并且在25°C下，在热灭活的大鼠血清中6小时后保持其初始荧光的94±0. 6%。
[0129] 在一些实施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清中稳定，并且在热灭活的大鼠血 清中持续一段时间段保持其初始荧光的至少约90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97 %，98%，99%，或 100%，所述时间段例如约 lhr, 2hr, 3hr, 4hr, 5hr, 6hr, 8hr, 10hr, 12hr, 1 4hr, 16hr, 18hr, 20hr, 24hr 或更长时间。
[0130] 在一些实施方式中，在黑暗中4°C下储存超过300天之后，纳米颗粒的荧光强度是 其初始荧光强度的50 %至100%。
[0131] 在一些实施方式中，纳米颗粒的平均半衰期为0. 5hr至lhr，0. 5hr至2hr, 0. 5hr 至 3hr, 0. 5hr 至 4hr, 0. 5hr 至 5hr, 0. 5hr 至 6hr, 0. 5hr 至 7hr, 0. 5hr 至 8hr, 0. 5hr 至 9hr, 或0. 5hr至lOhr或者更长时间。
[0132] 本文提供的ICG颗粒产品的进一步稳定通过用诸如海藻糖或蔗糖之类的冷冻保 护剂的冷冻干燥法实现，所述冷冻保护剂在ICG颗粒产品与水水合之后维持颗粒特性。
[0133] 综上所述，所观察到的光线、储存和血清稳定性表明ICG-LNP具有很强的临床使 用稳定性，尤其是用于淋巴系统的成像，所述淋巴系统中，淋巴包含的血清蛋白浓度比血液 中的血清蛋白浓度低大约两倍。
[0134] 本文提供的LNP由于其较高的荧光强度而比本领域已知的其他ICG试剂更加有 效。本文中的"有效"是指在施用于组织或器官之后能够通过相同或更少的ICG分子发射 更高的荧光，从而产生图像用于期望的目的。
[0135] 在一些实施方式中，组合物按单位体重给药剂量在小于约0. 5mg/kg, 0. 4mg/ kg, 0. 3mg/kg, 0. 2mg/kg, 0. lmg/kg, 0. 09mg/kg, , 0. 08mg/kg, 0. 07mg/kg, 0. 06mg/ kg, 0? 05mg/kg, 0? 04mg/kg, 0? 03mg/kg, 0? 02mg/kg,或 0? Olmg/kg ICG 剂量的条件下有效。
[0136] 在一些实施方式中，组合物按单位体重给药剂量在约0.0 lmg/kg至约0. 5mg/kg, 约 0? Olmg/kg 至约 0? 4mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 3mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 2mg/kg, 约 0? Olmg/kg至约 0? lmg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 09mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 08mg/kg, 约 0? Olmg/kg 至约 0? 07mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 06mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 05mg/ kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 04mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 03mg/kg,或约 0? Olmg/kg 至约 0.02mg/kg ICG剂量（包括端点值）的条件下有效。
[0137] 在一些实施方式中，组合物在约0. 05mg/kg至0. 5mg/kg ICG剂量（包括端点值） 的条件下有效。
[0138] 本文提供的组合物或ICG-LNP的有效性通过使用本领域已知的方法测量。例如， 在公开的文献值中，比较纳米颗粒相对于水性ICG的荧光增强倍数。
[0139] 脂质体的一种熟知特性是它们在肝脏组织中积累（7)。然而，本发明的ICG-LNP不 在肝脏中积累，但是其通过肝胆管几乎被完全清除而进入肠道，这是这些ICG颗粒的不同 之处和新颖之处（参见，例如，图19)。
[0140] 本文提供的ICG颗粒比任何报道过的组合物和方法都更加稳定。而且，这些颗粒 可用于识别肿瘤（参见，例如，图4)和带有淋巴血管形成的炎症位点（参见，例如，图5-8 和图20)。本发明研发的颗粒稳定且特异性地将NIRF分子传送至淋巴系统以进行NIRF成 像。
[0141] II.制备 ICG-LNP 的方法
[0142] 另一方面，本发明提供一种解决ICG的水不稳定性、聚集和降解的限制的简单方 案并且使更深层的组织水平以比单独使用ICG更好的分辨率成像。在本发明提供的方法 中，由于ICG100% (或大约100% )嵌入脂质中，因此不需要分离步骤，强ICG-脂质结合相 互作用通过简单的三步制备程序产生（参见，例如，图1)，并且ICG自淬灭被降低以最大程 度增大ICG荧光强度产量（参见，例如，图3)。
[0143] 本发明提供一种仅涉及三个步骤的简单/流畅的制备方法：（1)在有机溶剂中混 合吲哚菁绿（ICG)与脂质分子，（2)蒸发含有完全混合的脂质和ICG的有机溶剂，以及（3) 降低水合的ICG-脂质混合物的粒度，并且由于ICG完全嵌入ICG-脂质纳米颗粒而不需要 过滤/纯化/分离步骤除去游离的未合并的ICG(参见，例如，图1)。
[0144] 在一些实施方式中，制备纳米颗粒的方法包括：(a)在有机溶剂中混合吲哚菁绿 (ICG)与脂质分子；(b)蒸发有机溶剂以产生含有所述脂质分子和所述ICG的薄膜；（c)使 用缓冲盐水水合所述薄膜；（d)使用超声能量或均质步骤减小粒度，从而减小用所述缓冲 盐水水合的薄膜的粒度。
[0145] 本文提供的方法与本领域已知的方法不同，本领域已知的方法忽略了在形成脂质 薄膜之前的作为初始制备步骤的在有机溶剂中混合ICG和脂质，该步骤是将ICG稳定地嵌 入脂质所必须的。相反，本领域已知的方法将ICG的水性溶液加至已形成的脂质薄膜中，这 导致ICG无法有效包裹至脂质体的水性核中。
[0146] 在一些实施方式中，脂质分子包括1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸 胆碱（DSPC)和1，2_二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二 醇-2000(DSPEmPEG2000)。
[0147] 在一些实施方式中，有机溶剂包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或DMS0。
[0148] 在一些实施方式中，脂质纳米颗粒悬浮于包含生物相容性缓冲液的盐组合物中， 所述生物相容性缓冲液例如pH为5-8且Osm为约303m0SM的缓冲液。这些缓冲液的实例 包括生理盐水、林格氏溶液、5%葡萄糖水溶液或0. 9% NaCl和约20mM NaHC03的缓冲液。
[0149] 在一些实施方式中，缓冲盐水包括约0. 9% NaCl和约20mM NaHC03。
[0150] 在一些实施方式中，所述方法不包括过滤步骤，纯化步骤或分离步骤，或者它们的 组合。
[0151 ] 在一些实施方式中，所述方法不包括任何过滤步骤、纯化步骤或分离步骤。
[0152] 美国专利公开US2014/0341813A1公开了一种使用离散剂（例如，尿素、胍、碘或其 他离子）的pH梯度方法以防止ICG的J-聚集并使高浓度的单体形式的ICG (彡ImM ICG) 包裹在脂质体的水性核中。然而，该引用的专利申请中所描述的制备步骤鉴于下述多种其 他原因而非常繁琐（多5个步骤），所述原因包括需要使用pH-梯度，ICG在水性溶液中不 稳定（虽然存在离散剂）以及由于所有游离ICG的不完全包裹而需要进行过滤和纯化（该 美国专利公开中报道了仅27. 4%的包裹率）。
[0153] 本文公开的制备方法简单得多，因为其不涉及pH-梯度或纯化步骤，其仅仅涉及 三个简单步骤：混合、干燥和水合/尺寸减小。
[0154] 在一些实施方式中，脂质纳米颗粒悬浮于包含约0. 9% NaCl和约5_50mM(例如， 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,或 50mM)的 NaH〇y9盐组合物中。
[0155] 本文提供的方法和组合物基于意想不到地发现了简单且可成比例扩大生产的3 步制备方法和组合物，其能够使吲哚菁绿（ICG)几乎100%地嵌入脂质以形成稳定的脂质 纳米颗粒（LNP)。
[0156] 这种使ICG与脂质结合的独一无二的方法极大地提高了 ICG的稳定性和近红外荧 光（NIRF)强度，超过了游离ICG所能达到的稳定性和近红外荧光强度，这使更深层的组织 能够成像。虽然本发明的LNP制剂类似于脂质体制剂，但是本发明公开了新的特性，这在早 期的脂质体生理化学研究和体内研究中是非显而易见的，并且这些ICG-LNP表现出比其他 已报道的ICG脂质体更加优异的特性，即，（1)100%嵌入效率，这排除了任何纯化步骤，（2) 产生高稳定性颗粒的简单的3步制备步骤，以及（3)优化ICG光谱学性质从而避免ICG荧 光发射的自淬灭并极大地提高ICG的荧光强度产量。将这些要素综合在一个具有高度特异 性组成的系统中是非显而易见的并且提供了前所未有的增加体内NIR成像时间和分辨行 为的协同作用。具体而言，本发明的组合物特别适于用于淋巴结构和淋巴网络绘图，识别淋 巴病理学和淋巴异常，识别带有淋巴血管形成的肿瘤，识别带有三级淋巴器官的炎症位点， 以及将药物递送至淋巴系统以及与淋巴相关的病理学的淋巴管和淋巴结中的摄取、留滞和 广泛分布。
[0157] 本发明提供的纳米颗粒的制备方法提供了相对于本领域已知方法的各种新颖的 方面和优势，例如：（1)综合组合物和三步制备方法生成物理上稳定的带有独特性质的产 品（稳定且高ICG荧光产量），（2)综合ICG光谱学性质提高效力，（3)避免游离ICG的除去 的简单三步过程，这降低了总体成本并且控制由于复杂的多步过程而产生的潜在污染，（4) 荧光分子（吲哚菁绿（ICG))嵌入ICG-脂质纳米颗粒（ICG-LNP)中，这提高了荧光强度，使 其大大超过包裹在脂质体或脂质囊泡中的水性ICG所能达到的荧光强度，（5)在嵌入脂质 的组合物中使用的ICG剂量相对于用于体内近红外（NIR)成像的水性ICG(临床使用）降 低了约10倍，这产生了更高的分辨率和荧光强度，以及（6)使ICG几乎100%嵌入脂质膜中 的独特的组成、尺寸和表面性质，提高的稳定性（储存和体内这两方面），以及对于淋巴系 统的体内功能性医学成像而言非常重要的性能。
[0158] III.药物制剂和给药方式
[0159] 本发明还涉及包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学 上可接受的载体的药物制剂。
[0160] A.对比剂
[0161] 本文提供的纳米颗粒可用作荧光成像或光声成像的对比剂，因为该颗粒包含ICG 并且可吸收近红外光以发射荧光或声波。此外，该颗粒可用作视觉检查的对比剂，因为ICG 具有绿色。
[0162] 本文中的"对比剂"是指能够在想要观察的组织或分子，存在于标本中的组织或分 子和所述组织或分子周围的组织或分子之间进行比较产生不同以改善想要观察的组织或 分子的形态信息或位置信息的检测灵敏度的物质。
[0163] 本文中的"荧光成像"或"光声成像"是指通过例如荧光检测设备或光声信号检测 设备成像的组织或分子。
[0164] 根据本实施方式的对比剂包括根据本文提供的颗粒和所述颗粒分散于其中的分 散介质。所述分散介质是用于分散颗粒的液体物质并且其实例包括生理盐水和注射用蒸馏 水。此外，对比剂可具有药理学上可接受的诸如食盐或葡萄糖之类的添加剂。所述对比剂可 以是如下对比剂：根据本实施方式的颗粒预先分散于分散介质，或者可如下描述的那样使 用。根据本实施方式的颗粒和分散介质包装在试剂盒中，并且所述颗粒在给药于活体（例 如，人体）之前分散于分散介质。
[0165] IV.本发_的试剂盒
[0166] 关于组合物的使用的说明总体上包括用于目标治疗的剂量、给药方案和给药途径 的信息。组合物的容器可以是单位剂量，批量包装（例如，多剂量包装）或子单位剂量。在 本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签上或包装插入物上（例如，包括在试剂盒中 的纸页）的书面说明，但是机器可读的说明书（例如，磁盘或光盘中载有的说明）也是可接 受的。
[0167] V.医药用涂
[0168] 大多数荧光医学成像（小于600nm-700nm)受到体内血液、组织和脂肪的光吸收和 光散射的限制。因为吲哚菁绿（ICG)在820nm发射荧光，其在血液、水、组织和脂质的光吸 收系数最低的700nm-900nm的范围的中间，因此该近红外（NIR)化合物克服了生物组织的 干扰。
[0169] 皮下注射之后，稳定地嵌入ICG-LNP中的ICG被优化为保留在淋巴系统中，而不会 如游离ICG那样从淋巴管中渗出进入周围组织（参见，例如，图8和图9)。
[0170] ICG-LNP可由临床医师使用，用于从手术至诊断和药物递送的一系列临床应用中。 具体而言，ICG-LNP可用于在手术中识别淋巴管和淋巴结（LN)(参见，例如，图9和图10)， 用于识别淋巴异常（参见，例如，图5-8)，使实体肿瘤中的前哨淋巴结显现，使带有淋巴血 管形成的肿瘤显现（参见，例如图4)，使带有三级淋巴器官的炎症位点显现（参见，例如，图 5-8)，将药物递送至淋巴管、淋巴结和病变位置。
[0171] 更加具体而言，ICG是唯一由美国食品和药品管理局（FDA)和欧洲药物管理局 (EMA)批准的用于人体的NIR荧光团。为了使淋巴脉管系统成像，目前临床上通过将纯ICG 溶质溶解于水溶液并进行皮下注射来使用ICG。ICG与白蛋白的高结合亲和力能够使其被 摄取至淋巴管中，然而，这种白蛋白结合不稳定并且是可逆的，ICG从白蛋白中解离并由于 浓度梯度驱动力从淋巴毛细管中渗漏出来，而暴露于使ICG降解的水性环境。通过将ICG 稳定地嵌入LNP的脂质中，这（1)通过不可逆的脂质结合稳定ICG，（2)提高其荧光产量和 高荧光强度的持续期，以及（3)避免ICG从颗粒中解离和由于脂质纳米颗粒的尺寸而从淋 巴脉管系统中漏出。
[0172] ICG-LNP保留在远离注射位点的下游的淋巴脉管系统中并且在淋巴结（LN)中累 积，这产生对淋巴系统具有特异性的且比临床使用的游离ICG组合物和其他ICG纳米颗粒 制剂（例如包裹在脂质体的水性核中的ICG(8-12,21) (US专利公开US2014/0341813A1)) 显著更强和更稳定的广泛的高分辨率NIR荧光成像。
[0173] 而且，本发明公开的简单且有效的制备步骤不涉及任何高成本和耗时的分离或纯 化步骤，并且使几乎100 %的ICG嵌入脂质，其对于大规模生产是有用的。
[0174] 因为由本发明的独特的且简单的3-步制备方法和组合物而产生颗粒稳定性，因 此，产生了淋巴结构和血管结构的一致的且广泛的高分辨率成像（参见，例如图5-10,16， 19和20)，所述成像可用于淋巴系统的疾病的诊断、评估和监控以及区分正常与异常淋巴 结构和功能。全身血液分布可使用这些颗粒维持，从而检测高度灌注的组织和器官（例如， 肝脏）中的组织异常（参见，例如图18)。
[0175] 一方面，本发明提供具有临床用于人体NIRF成像的产品（ICG)的促进剂/稳定剂 的纳米颗粒，这样，本发明的技术可用于提高ICG的稳定性和荧光强度，从而改善已有NIR 成像仪器的NIRF成像。
[0176] ICG-LNP用作改善NIRF成像能力的新型诊断成像工具以在受治者体内（例如人 类）识别/显现（1)手术过程中的淋巴管和血管以及结节，（2)淋巴和血管异常，（3)实体 肿瘤的前哨淋巴结，（4)带有淋巴血管形成或总血管形成的肿瘤，以及（5)带有三级淋巴器 官的炎症位点或组织中的炎症位点。
[0177] 本文中的"受治者"是指人类或非人类动物，包括但不限于：诸如狗、猫、马、牛、猪、 兔、豚鼠、绵羊、山羊、灵长类动物、大鼠和小鼠之类的哺乳动物。
[0178] 此外，ICG-LNP与其他诸如表6所列的分子之类的疏水分子的结合可用于提高它 们的稳定性和用于递送药物至淋巴管、淋巴结和病变位置。
[0179] 在治疗淋巴疾病中，NIRF成像是广受欢迎的指导诊断和治疗的工具。本发明公开 的ICG-LNP的使用通过在临床环境中使NIRF成像的强度和实用性多元化和得到改进而改 善了 NIRF成像能力。
[0180] 本文提供的ICG-LNP具有各种各样的比现有技术中已知的ICG制剂更加优异的有 利性质，例如（1)在皮下注射之后被快速摄取至淋巴中（参见，例如表5,图17)，（2)在整 个淋巴系统中快速流动和广泛分布（参见，例如图9和图10)，（3)在第一次流过淋巴系统 之后滞留于淋巴管和淋巴结中（参见，例如，图11)，（4)在淋巴系统中具有非常高的体内稳 定性（参见，例如，图9-11)，（5)在淋巴结组织中稳定，如在淋巴结组织切片的近红外显微 成像下看到的通过间断荧光所显示的（参见，例如，图11)，（6)分布于淋巴结组织中，如淋 巴结组织切片的近红外显微成像所显示的（参见，例如，图11)，（7)相对于游离ICG，使用 脂质-结合ICG的不同的/提高的淋巴管和淋巴结的高分辨率成像（参见，例如，表2和图 10)，（8)检测注射位点的下游淋巴结，这是游离ICG无法实现的（参见，例如，表2,表5,图 10,17,19)，（9)相对于游离ICG，使用脂质-结合的ICG使淋巴管和淋巴结成像的持续期延 长（图10、19)，（10)在淋巴结中累积和截留，尤其是在病变的淋巴结中累积和截留（图6， 8,11，19,20)，（11)检测带有淋巴血管形成的肿瘤（图4)，（12)检测由于淋巴管新生和三 级淋巴器官而产生的炎症位点（图5-8)，和（13)主要通过胆管从肝脏清除进入肠道（图 18) 〇
[0181] A.荧光成像方法
[0182] 本文提供的对比剂还可用于荧光成像方法。使用根据本实施方式的对比剂的荧光 成像方法包括至少下列步骤：将对比剂给药于受治者或获自受治者的样本，用光辐照受治 者或获自受治者的样本，以及测量来自于从受治者或获自受治者的样本中存在的颗粒中衍 生的物质的荧光。
[0183] 使用根据本实施方式的对比剂的荧光成像方法的实例在下文中描述。即，将根据 本实施方式的对比剂施加于标本，或加至诸如获自标本的器官之类的样本。应当注意的是， 所述标本是指所有活体，例如，实验动物和宠物，没有任何特定限制。标本或获自标本的样 本的实例可包括器官、组织、组织切片，细胞和细胞裂解物。在施加颗粒或添加颗粒之后，用 近红外波长范围内的光辐照所述标本或类似物。
[0184] 成像可通过商售荧光IVIS成像设备（例如，IVIS Lumina成像系统）和ICG滤波 器进行。
[0185] 如上所述，许多光成像设备被设计为使用波长范围并且IVIS也对应于ICG单体的 吸收波长，即，780nm (滤波器的激发通带设定为4:705至780nm)。
[0186] 一方面，本发明提供一种用于使受治者体内的组织或器官成像的方法，包括：将适 量的ICG-LNP给药于需要成像的受治者，用合适频率的光辐照所述受治者，以及通过检测 ICG发射的光获取所述受治者的组织或器官的图像。Nguyen, Q.T.，and Tsien，R.Y. (2013) Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation:A new cutting edge. Nat. Rev. 13, 653-662,该参考文献的全部内容通过引用并入本文。
[0187] 在一些实施方式中，所述方法包括：（1)通过皮下注射、皮内注射、静脉内注射，肌 肉内注射，肿瘤内注射，肿瘤周围注射的方式将包含本文提供的LNP的组合物给药于受治 者，例如人类，以及（2)使用内窥镜上的近红外光/照相机或手持式探针检测来自组织内的 ICG纳米颗粒的荧光，由此获取所述受治者的组织或器官的图像。
[0188] 本文提供的成像方法可用于各种不同的应用，例如，（1)淋巴流和引流的绘图，（2) 血管造影术，（3)检测淋巴组织，（4)前哨淋巴结绘图，（5)淋巴管结构异常检测，（6)通过 改变淋巴流型或靶向癌细胞的分子检测淋巴转移癌细胞，以及（7)可视化递送包含在ICG 纳米颗粒中的药物（宏观和微观/组织学）。
[0189] 本文提供的作为产品的ICG-LNP在仅~0. 05mg/kg ICG剂量或更低的条件下有效 (相对于FDA推荐的静脉内剂量：0. 5-2mg/kg)(其由于强度提高了五倍并且获得了药物动 力学稳定性而使剂量降低~10倍）。
[0190] 另一方面，本发明提供一种获取受治者的组织或器官的图像的方法，所述方 法包括按照单位体重计算在低于约〇? 5mg/kg, 0? 4mg/kg, 0? 3mg/kg, 0? 2mg/kg, 0? lmg/ kg, 0. 09mg/kg, 0. 08mg/kg, 0. 07mg/kg, 0. 06mg/kg, 0. 05mg/kg, 0. 04mg/kg, , 0. 03mg/ kg,0. 02mg/kg,或0.0 lmg/kg染料（例如，ICG)剂量的条件下将染料给药于所述受治者，所 述染料例如，NIR染料（例如，ICG)。
[0191] 在一些实施方式中，所述剂量按照单位体重计算为约0.0 lmg/kg至约0. 5mg/kg， 约 0? Olmg/kg 至约 0? 4mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 3mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 2mg/kg, 约 0? Olmg/kg至约 0? lmg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 09mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 08mg/kg, 约 0? Olmg/kg 至约 0? 07mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 06mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 05mg/ kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 04mg/kg,约 0? Olmg/kg 至约 0? 03mg/kg,或约 0? Olmg/kg 至约 0.02mg/kg染料（例如，ICG)剂量，包括端点值。
[0192] 在一些实施方式中，剂量按照单位体重计算是约0. 01mg/kg至0. 5mg/kg染料（例 如，ICG)剂量，包括端点值。
[0193] 在一些实施方式中，所述方法包括将如下量的ICG-LNP给药于受治者，所述量 按照单位体重计算小于约 〇? 5mg/kg, 0? 4mg/kg, 0? 3mg/kg, 0? 2mg/kg, 0? lmg/kg, 0? 09mg/ kg, 0? 08mg/kg, 0? 07mg/kg, 0? 06mg/kg, 0? 05mg/kg, 0? 04mg/kg, 0? 03mg/kg, 0? 02mg/kg,或 0?0lmg/kg ICG 剂量。
[0194] 在一些实施方式中，所述方法包括将如下量的ICG-LNP给药于受治者，所述量按 照单位体重计算为约〇? 0lmg/kg至约0? 5mg/kg，约0? 0lmg/kg至约0? 4mg/kg,约0? 0lmg/kg 至约 0. 3mg/kg,约 0. 01mg/kg 至约 0. 2mg/kg,约 0. 01mg/kg 至约 0. lmg/kg,约 0. 01mg/kg 至 约 0? 09mg/kg,约 0? 01mg/kg 至约 0? 08mg/kg,约 0? 01mg/kg 至约 0? 07mg/kg,约 0? 01mg/kg 至约 0? 06mg/kg,约 0? 01mg/kg 至约 0? 05mg/kg,约 0? 01mg/kg 至约 0? 04mg/kg,约 0? Olmg/ kg至约0? 03mg/kg,或约0? 01mg/kg至约0? 02mg/kg ICG剂量，包括端点值。
[0195] 在一些实施方式中，所述组合物的给药途径选自全身给药和局部给药，其中，所述 全身给药包括血管内注射，所述局部给药包括皮下注射、皮内注射、粘膜下注射、浆膜下注 射、肿瘤内注射、肌肉内注射、口服、经鼻给药和肿瘤内注射。在本发明优选的实施方式中， 在通过血管内注射的方式给药的情况下，所述组合物的量等于约0. 01mg/kg体重ICG剂量 至约0. 5mg/kg体重ICG剂量。在局部给药本发明的组合物的情况下，所述组合物的单点注 射量等于约〇? lng至约0? lmg ICG剂量。
[0196] 使用本文提供的教导，可制定不会产生很大的毒性且又完全有效治疗特定患者表 现出的临床症状的有效治疗方案。这种治疗方案的制定应当涉及考虑了诸如化合物效力、 相对生物利用度、患者体重、存在的副作用以及副作用的严重程度，优选的给药模式以及所 选择的药剂的毒性特性之类的因素谨慎选择活性化合物。
[0197] 虽然本文已经显示并描述了本发明的优选实施方式，但是，对于本领域技术人员 而言明显的是，这些实施方式仅仅是以举例说明的方式提供。在不背离本发明的条件下，本 领域技术人员可做出多种改变、变化和替代。应当理解的是，对本文所述的本发明的实施方 式的各种改变可在实施本发明时使用。后附的权利要求意在限定本发明的范围，其所限定 的方法和结构均在这些权利要求的范围内。
[0198] 实施例
[0199] 通过下文和举例说明本发明的化合物的制备的实施例进一步举例说明本发明，但 不限于此。
[0200] 实施例1
[0201 ]化学试剂：P引卩朵音绿(ICG ;C43H47N2Na06S2;2-[7-[3, 3-一甲基_1_(4-横丁基）苯并 [e]二氢吲哚-2-亚基]庚_1，3, 5-三烯-1-基]-3, 3-二甲基-1-(4-磺丁基）苯并钠盐） 购自 Sigma_Aldrich(St. Louis，M0)。1，2-二硬脂酰基 _sn_ 丙三基-3-磷酸胆碱（DSPC)， 1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二醇-2000 (DSPEmPEG2。。。） 以及L-a-磷脂酰胆碱（Egg PC)购自Avanti Polar脂质（Alabaster，AL)。其他试剂是分 析纯级别或更高级别。
[0202] LNP制备：对照或苧LNP和ICG-LNP通讨薄腊水合和声波降解法制备。简言之， 将溶于CHC13中的DSPC和溶于CHC1 3:CH30H(3: lv/v)中的DSPEmPEG2。。。在无菌试管中混合 (9: lmol/mol)。随后在N2气和减压条件下干燥该混合物以形成薄膜，薄膜在室温条件下过 夜真空干燥。用pH为7的0. 9% NaCl，20mM NaHCOgl冲液在60°C下重新水化所述薄膜持 续3小时（最终脂质浓度20mM)。LNP的直径通过55°C下的15分钟的超声波浴处理降低至 大约50nm至80nm。对于ICG-LNP而言，将溶于100% CH30H的ICG加至脂质混合物中，随 后干燥形成薄膜。ICG自淬灭（22)降低，并且对ICG在脂质膜中的密度进行优化（图3)。 LNP 和 ICG-LNP 的平均直径在 PSS-NICOMP 380ZLS 仪器（Particle Sizing Systems, Port Richey，FL)通过光子相关光谱（PCS)由粒度分析获得。G电位在相同的仪器上测量。ICG 嵌入效率通过平衡透析由脂质结合ICG和游离ICG的分离来估算。所有实验在黑暗条件下 进行，避免光线暴露。
[0203] 吸附至LNP的ICG的90°光散射：溶于100% CH30H的ICG与LNP以25:1至500:1 的脂质-ICG摩尔比在塑料micronic管中孵育20分钟，随后用pH为7的0. 9% NaCl，20mM NaHC03的缓冲液稀释25倍以最小化ICG-脂质相互作用。随后在HitachiF-4500荧光分光 光度计（作 〇7，1)上测量九十度光散射。设定参数：\；!/6|11= 660/66〇11111狭缝宽度6：!/6|11 = 2. 5/5nm。在观察过程中在室温避光条件下保存样品。
[0204] 劳光：使用100 U L平底未处理的96孔平板（Grenier Bio-one, Monroe, NC)中的 样品，在带有钨-卤素连续波灯（75W，光谱范围320nm-800nm)和激发（769±41nm)和发射 (832±37nm)滤波器（Semrock, Rochester, NY)的 Victor3V 1420-040 多标记微孔板酶标仪 (Perkin-Elmer, Waltham, MA)上进行焚光测量。
[0205] 光暴露和储存稳宙件：对于光暴露稳宙件而言(图13)，将ICG浓度为2. 0 y M的 游离ICG和ICG-LNP的样品暴露于顶部发光的荧光灯管持续12小时。在0小时、6小时和 12小时记录荧光测量值。对于储存稳定性而言（图12)，将样品放置于黑暗中在4°C下持 续多达313天。在五个不同的时间点记录游离ICG的荧光测量值，在10个不同的时间点 记录ICG-LNP的荧光测量值。ICG荧光的时间依赖性衰减基于GraphPad Prism version 6. 0(GraphPad Software, San Diego, CA)的指数衰减模型进行分析。数据表示为tl/2(半 衰期）和k (速度常数）。
[0206] 组织滲诱深度：伸用三个不同深度(0? 5cm，1. 0cm，1. 5cm)的方块鸡胸组织体模评 价ICG荧光穿过组织的检测（图2)。组织方块放置于填充有50 y L的30 y M游离ICG或 ICG-LNP 的毛细管[70 yL 容量，75mm 长度，1.2mm 内径（Fisher Scientific，Hampton，NH)] 上。白光和 NIR 图像使用 Hamamatsu Photonics K.K. (Hamamatsu, Japan)制造的定制 NIR 电荷耦合元件（CCD)照相机在毛细管和组织方块制备15分钟内捕获。在0-255的范围 (255为最大亮度）下，所选择的区域的焚光强度平均值通过Adobe Photoshop CS4(Adobe Systems Inc.，San Jose, CA)中的分析函数获得。
[0207] 小鼠体内NIR淋巴成像：小鼠在无菌条件下饲养，暴露于12小时光暗循环，并且在 成像之前自由采食。
[0208] 用1.5%的异氟烷麻醉小鼠，刮除皮毛并且以仰卧位放置于IVIS Lumina II NIR CCD照相机（Perkin Elmer, Waltham, MA)下方的37°C热盘上。获取注入造影剂前的图像 以确认不存在自发荧光。向两个后足的顶部皮下注射四十微升（相当于〇.5nmol ICG) ICG-LNP或游离ICG。在注射之后，立即将双足放置于轻微均匀压力下。获取图像持续长达 120分钟，随后在麻醉条件下通过颈脱位安乐死，小鼠安乐死之后，通过手术打开皮肤进行 淋巴结成像。
[0209] 实施例2
[0210] 脂质-ICG相互作用
[0211] 为了评价ICG和脂质之间的相互作用，将空（不含ICG)LNP与各种不同浓度的ICG 一同孵育。如果溶液中的ICG分子与膜中的脂质结合，那么这会导致LNP交联和聚集，从 而引起可由90度光散射变化检测的LNP表观尺寸增加以及粒度增加。在初步试验中，由 鸡蛋衍生的磷脂酰胆碱（Egg PC)构成的LNP (包含混合长度的脂肪酰基链）的光散射强度 随ICG浓度的增加而增加，这说明ICG诱导LNP聚集。接下来使用具有明确限定的磷脂组 合物一包含两个对称C18脂肪酰基链的DSPC和DSPEmPEG 2_ (9: lmol/mol) -的LNP进行系 统研究。使LNP中的浓度固定为10mM的脂质与不同浓度的ICG在25°C下进行相互作用持 续20分钟，用缓冲液稀释25倍停止反应。对混合物进行90°光散射分析和光子相关光谱 (PCS)分析以估算粒度。
[0212] 预见到，九十度光散射强度在颗粒处于单个，非聚集形式时较低，并且随着颗粒聚 集而增强。然而，当脂质聚集体过大时，聚集体可能离开光通路或者颗粒中的电子可能不一 同同相摆动并且导致颗粒内的破坏性干扰，这导致散射强度的明显下降。如图14A所示，空 LNP(只有脂质）具有低散射强度，游离ICG(仅ICG)具有接近零的一致的散射强度，不论 ICG的浓度是否发生改变。当将LNP和ICG(ICG-LNP)混合时，在ICG浓度较低（20-30nM) 的条件下，检测到类似于空LNP对照（只有脂质）的最小光散射强度。当ICG浓度从30nM 增加至70nM时，ICG-LNP的光散射强度增加大约1. 5倍（图14A)。在ICG浓度为40nM时， 散射强度发生较小的降低，然而，仍然显著高于ICG浓度为20-30nM的散射强度。在高浓度 (100-400nM ICG)条件下，散射强度随聚集体增大而下降。图14B显示了所设想的聚集体形 成的示意图，该聚集体形成导致光散射强度开始增加随后随粒度大大增加而降低。这些数 据使用PCS的聚集体尺寸分析确认。如图14C所示，在20nM ICG初始浓度下，颗粒直径类 似于空LNP的直径（~100nm)。表观ICG-LNP尺寸随ICG浓度从20nM增加至100nM而增 加约两倍。在ICG浓度为30nM至100nM条件下表观尺寸在直径为300nm左右波动，并且随 后在ICG浓度为400nM条件下增加至约400nm。在ICG浓度为30-400nM的范围内，检测到 恒定直径为60-90nm的较小但独特的ICG-LNP的小聚集群（数据未显示）。
[0213] 综上所述，这些数据表明ICG结合至空的预先形成的LNP中存在的脂质中并且导 致LNP聚集，检测为粒度明显增加，并且光散射强度不连续地增加。基于脂质浓度为10mM 且ICG浓度为20-50nM，这些数据使产生最大脂质聚集和粒度明显增加的脂质-ICG摩尔比 估算为200:1至500:1。
[0214] 脂质-ICG相互作用对ICG荧光的影响
[0215] 接下来，我们确定了由于ICG结合至脂质而对荧光强度产生的影响。使用脂 质-ICG摩尔比125:1至25, 000:1。由于ICG的自淬灭性质，用缓冲溶液稀释反应混合物20 倍至线性ICG浓度范围0. 01-2. OmM。如图15所示，混合物中脂质的存在使相同ICG浓度下 的ICG荧光强度增加。当ICG浓度从0.0 lmM增加至1. OmM时，相对于对照，含有脂质的混合 物的荧光强度逐渐增加。在ICG浓度为0. lmM，0. 5mM和1. OmM的条件下，荧光强度分别增加 了 10. 0 倍（65, 720vs. 6, 600)，4. 3 倍（261，640vs. 61，360)和 2. 8 倍（346, 610vs. 122, 530)。 在ICG浓度为2. OmM的条件下，脂质介导的ICG荧光强度的提高较小，仅仅观察到1. 4倍的 增加（275,820vs. 199,420)。在脂质浓度固定为250 yM且ICG浓度为0. 5^]\1，1.〇1^和 2.0 yM的条件下，这些值的等同脂质-ICG摩尔比分别为500:1，250:1和125:1(图15)。因 此，表现出最大荧光强度的最优脂质-ICG摩尔比估计为125:1至500:1。该估算值与90° 光散射和PCS尺寸分析收集到的数据一致。从ICG和预先形成的LNP的相互作用衍生得到 的这些值用作后续ICG-LNP制备和性质研究的目标范围。
[0216] 将ICG并入LNP以稳宙和最大化ICG荧光
[0217] 不同于将溶液中的ICG加至脂质中作为缓冲溶液中的混合物，我们首先将ICG和 脂质一同在有机溶剂中混合，随后除去溶剂并在缓冲液中再次水合形成插入或嵌入有ICG 的LNP。ICG在吸收和发射光谱中具有显著重合（数据未显示）并且因此表现出在高浓度条 件下的自淬灭可能性。因此，我们制备嵌入或并入有不同浓度（密度）的ICG的LNP，所述 ICG嵌入脂质中。如果ICG密度太大，ICG分子之间非常靠近可因浓度依赖性分子相互作用 而诱导自淬灭。而且，并入脂质而非暴露于水的ICG可提供比暴露于水的ICG分子更高的 荧光，暴露于水会淬灭ICG荧光。评估从100:1至500:1范围内八个脂质-ICG摩尔比。图 3A表示三个脂质-结合ICG样品（等于100:1，250:1和350:lmol/mol)和溶解的ICG对 照的典型ICG浓度下ICG斜率的每单位荧光强度。在ICG浓度为0.0 lmM至2. OmM条件下， 荧光强度表现出线性增加。需要注意的是，250:1线的斜率是最陡的，随后是350:1，然后是 100:1和仅ICG。为了确定最优脂质-ICG摩尔比，我们评估了每个制剂的线的斜率（清楚 起见，全部八条线中仅三条显示在图3A中）。
[0218] 斜率等于每yM ICG的荧光强度。如图3B所示，由于ICG密度的降低和自淬灭，每 ICG的荧光强度（斜率）随脂质-ICG摩尔比从100:1增加至250:1而增加，在脂质-ICG摩 尔比为250:1的点，每ICG的荧光强度达到最大。随后，在300:1和350:1的条件下，每ICG 的荧光强度降低，随后在500:1条件下显著降低。因此，我们在脂质-ICG摩尔比为250:1 的条件下观察到每ICG的荧光强度峰值。
[0219] 因为250:1的脂质-ICG摩尔比表现出每ICG的最大荧光强度，我们使用通过光子 相关光谱（PCS)的粒度分析和通过电泳光散射（ELS)的颗粒表面电荷电位）分析表 征250:1制剂。由直径为56. 8±4. 4nm且G电位为-33. 1±3. lmV的颗粒的单分散群构成 250:1制剂。平衡透析表明ICG合并效率为97. 8±0. 6%。由于ICG的并入的可重现性和 ICG的几乎完全并入，选择这种制剂无需进一步纯化而用于后续的体内和体外研究。
[0220] 脂质并入对提高ICG暴露于光的稳宙件和储存稳宙件的作用
[0221] 接下来，我们评估了 ICG-LNP在4°C下储存和暴露于光线下的稳定性，从而模拟 临床设置的环境。如图13所示，ICG-LNP的荧光强度在暴露于光线6小时之后降低至起 始值的87. 6±0. 5%，并且在12小时后没有发生进一步降低（t1/2= 67. 5±11.8h，k = 0. 011±0. 002h 4。相反，溶液中的游离ICG的荧光强度在暴露于光线6小时之后降低至其 起始值的 2. 5±0. 5% (t1/2= 0? 036±0. 005h，k = 19. 2±2. 7h 这表明水溶液中的 ICG 光不稳定性。
[0222] 为了评估长期储存稳定性，我们将ICG-LNP保存在4°C黑暗条件下并且在313 天中多次测量荧光强度。如图12和表1所示，在储存ICG-LNP八个月之后，记录起始荧 光强度的约78.2±2.8%(七 1/2= 394 天[95%(：1:360,434]，1^=1.76\103天1[95% Cl: 1. 60 X 10 3, 1. 93 X 10 3])。然而，对于缓冲液中的游离ICG而言，在储存八个月之后仅仅 观察到起始 ICG 荧光的 0.3±0.2% (t1/2= 1. 19 天[95% CI:1. 14, 1.25]，k = 582X10 3 天1[95%CI:554X 10 3,609X 10 3])。
[0223] 表1?储存稳定性动力学a
[0225] 3在4°(：黑暗条件下储存。b储存八个月的样品平均值土SD(每个样品N = 2)。 ctl/2(95% CI)和 k(95% CI)由 313 天中的多个时间点（N= 10)计算。dtl/2(95% CI)和 k(95% CI)由239天中的多个时间点（N = 5)计算。
[0226] 体外增强的ICG-LNP的NIR成像
[0227] 为了比较ICG-LNP(脂质-ICG摩尔比为250:1的制剂）和游离ICG之间的荧光 信号强度，我们制备了肌肉组织厚度增加的鸡胸方块，增加的肌肉组织厚度为〇. 5cm、1. 0cm 和1. 5cm (图2F)。我们用50mL 30mM的ICG(1. 5nmol ICG)填充所有毛细管（长度为75mm， 内径为1. 2mm)(图2B)。如图2A所示，填充有ICG-LNP的毛细管的荧光强度比填充有游离 ICG的毛细管的荧光强度高3. 2倍（强度平均值分别为111. 7vs. 34. 5)。当将毛细管放置 于三个组织方块下方时，随着深度从左至右增加，游离ICG荧光（顶部三个组织方块）仅仅 在穿过深度为0. 5cm的组织方块中检测到（左上方的组织方块，强度平均值为9. 0)，但不会 穿过更厚的深度，ICG-LNP荧光（底部三个组织方块）在穿过0. 5cm，1. 0cm和1. 5cm深度 的组织方块中检测到（强度平均值分别为112. 1，77. 3,10. 0)(图2C)。进一步的分析表明 穿过1. 5cm的肌肉组织仅可检测到毛细管中的ICG-LNP (0. 5cm，1. 0cm，1. 5cm深度的强度平 均值分别为100. 9,68. 0,15. 2)(图2E和图2F)。
[0228] ICG-LNP对小鼠体内NIR淋巴图像分辨率的影响
[0229] 使用稳定且最优的ICG-LNP制剂，我们在小鼠体内进行光成像实验原理的体 内证明。为了比较游离ICG和ICG-LNP，我们将40 y L游离形式或与LNP结合的形式 的ICG(0. 5nmol ICG)皮下给药于小鼠的左足或右足（图16A)。在第六分钟，只有接受 ICG-LNP(而不是游离ICG)的足部表现出穿过皮肤的可检测的膝后窝结节（图16A)。仅当 在皮肤下方收集到图像时，两个膝后窝淋巴结变得可检测。接受游离ICG的膝后窝淋巴结 的ICG强度平均值为37. 0,相对而言，用ICG-LNP处理的膝后窝淋巴结的ICG强度平均值为 208. 1 (数据未显示）。为了进一步比较游离ICG和ICG-LNP的淋巴图像分辨率，在另一组 小鼠中，我们将游离形式的ICG或LNP形式的ICG以相同的剂量给药于双足。如图16B所 示，在给药后和除去皮肤之后六分钟，接受游离ICG的动物表现出ICG扩散进入血液（隐静 脉）。在这种情况下，ICG在局部膝后窝结节中可清楚地检测（图16B)。相反，在用ICG-LNP 处理的小鼠中，不仅膝后窝淋巴结强度高得多，而且通至腹部骨盆和生殖器/局部结节的 淋巴通路也是易于看见的（图16C)。没有观察到游离ICG在该淋巴通路中的分布。
[0230] 淋巴绘图和前哨淋巴结节检测
[0231] 表2显示了在小鼠足部的皮下注射位点的下游淋巴结和血管中通过ICG-LNP和游 离ICG检测到的荧光强度（膝后窝输入血管〉膝后窝淋巴结〉膝后窝输出血管〉坐骨〉髂 骨肌〉胃〉腋窝）。在所有情况下，通过ICG-LNP检测到的强度大于通过游离ICG检测到的 强度。此外，因为用ICG-LNP检测到的淋巴结的数量大于游离ICG检测到的淋巴结的数量， 所以，由ICG-LNP获得更高的分辨率。这表明ICG-LNP相对于游离ICG具有提高的强度和 更高的分辨率。
[0232] 表2.在皮下注射游离ICG和ICG-LNP之后小鼠体内所选择的淋巴结和血管中的 体内荧光强度
[0234] a在各个淋巴结或血管中检测到的最大近红外荧光（NIRF)强度（任意单位， a.u.)。平均值土 SEM(N = 3-4)。NA，不可用。
[0235] *P 值〈0.05。
[0236] 表3表示ICG-LNP形式中ICG剂量为皮下给药游离ICG使用的通常剂量的8%。 由于本发明的脂质颗粒产生独特的ICG稳定性并使得荧光强度增强，所以脂质纳米颗粒中 的ICG剂量〈游离ICG所需的剂量的10%。
[0237] 表3.使用ICG-LNP和游离ICG的体内淋巴成像中典型的吲哚菁绿（ICG)皮下剂 量。
[0238]
[0239] 表4表示基于ICG是游离形式或脂质纳米颗粒形式，相等剂量的ICG表现出不同 的体内药物动力学行为。ICG-LNP允许1. 4倍至几乎2倍的更高的荧光强度暴露，最大强度 和更快的消除速率。这些性质支持了使用ICG-LNP在体内实现荧光强度增强。
[0240] 表4.小鼠足部皮下给药之后通过皮肤检测到的第一引流淋巴结（膝后窝淋巴结） 中的游离ICG和ICG-LNP的荧光强度的体内药物动力学。
[0242] *荧光强度=任意单位（a. u.)
[0243] 表5表示通过小鼠足部的皮下注射位点随时间推移达到的第一和第二引流淋巴 节（分别为膝后窝和坐骨）中的荧光强度。两小时后，第一引流淋巴节中的信号降低了几乎 一半。第二引流淋巴节中的信号（其为第一淋巴节中的信号的约70%)降低了大约25%。 这说明使用ICG-LNP在体内评估起始和下游引流淋巴结的淋巴结功能的能力。
[0244] 表5.皮下注射ICG-LNP之后来自小鼠淋巴结的体内透皮焚光强度
[0245]
[0246] *焚光强度=任意单位（a. u.)
[0247] 实施例3
[0248] 肿瘤前哨淋巴结检测/绘图。实施一至十次肿瘤周闱深度沣射并目.实施一至十 次肿瘤周围皮下注射。对于每次注射而言，给药〇.〇l-l〇mL的ICG浓度为0. l-100yM的 ICG-LNP。按摩注射位点持续大约5分钟。使用手持式、头戴式或以其他方式设置的近红外 成像系统进行淋巴绘图。
[0249] 在健康个体或糖尿病、癌症或其他疾病患者体内表征淋巴功能和淋巴系统。在 健康或疾病个体中，在体内的任何位置实施一至十次皮下注射。对于每次注射而言，给药 0. 01-10mL ICG浓度为0. 1-100 y M的ICG-LNP。按摩注射位点大约5分钟。使用手持式、 头戴式或以其他方式设置的近红外成像系统实施淋巴绘图/成像/记录。在其他功能性 特征、表型特征或描述性特征中，评价淋巴管（LV)结构，淋巴管渗透性或渗漏性，淋巴管直 径，淋巴管密度，淋巴流和其他淋巴动力学参数，淋巴结（LN)形态或尺寸，淋巴结渗透性或 渗漏性，淋巴结定位的变化。在使用通过淋巴检测到的荧光信号的患者体内，采用"疾病信 号"："正常信号"的比例计算表征患病和健康个体之间的淋巴差异的指数。
[0250] 肠道,血管和淋巴管中的淋巴管和淋巴结的内窥镜检测。伸用带有皮下沣射针和 近红外成像能力的内窥镜，将〇.〇l-l〇mL的ICG浓度为0. l-100yM的ICG-LNP注射进入肠 上皮或血管内皮或淋巴管内皮。使用内窥镜近红外成像系统实施淋巴绘图。
[0251] 异常肝脏功能检测。实施0? 01-100mL的ICG浓度为0? 1-100 yM的ICG-LNP的静 脉内推注或输注。使用手持式、头戴式或以其他方式设置的近红外成像系统使来自肝脏的 荧光信号成像。测量来自肝脏的荧光信号的终末半衰期。与正常健康对照比较终末半衰期 以评估任何肝脏机能障碍。
[0252] 转務件癌症扩散路径的检测。实施一至十次皮下、肿瘤内或肿瘤周闱沣射。对于 每次注射而言，给药0.0 l-lOrnL的ICG浓度为0. 1-100 y M的ICG-LNP。如果注射位点可感 知的话，按摩注射位点大约5分钟。使用手持式、头戴式内窥镜、腹腔镜或其他方式设置的 近红外成像系统实施淋巴绘图。评估淋巴管和淋巴结的扩大，管堵塞或渗漏或其他与癌细 胞的转移性扩散有关的特征。
[0253] 血管和心血管病变检测。实施0. 01-100mL ICG浓度为0. 1-lOOuM的ICG-LNP的 静脉内推注或输注。使用内窥镜，手持式，头戴式或以其他方式设置的近红外成像系统使来 自血管或病理学改变的荧光信号成像以评估正常血管和心血管病变之间的差异。
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【主权项】
1. 一种组合物，其包含： (i) 含有脂质膜和水性核的脂质纳米颗粒，和 (ii) 多个吲哚菁绿ICG， 其中，所述多个ICG中的一个或多个嵌入所述脂质膜中。2. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质分子包括1，2-二硬脂酰基-sn-丙三 基-3-磷酸胆碱DSPC和1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙 二醇-2000DSPEmPEG2000。3. 如权利要求1所述的组合物，其中，至少约95%的ICG嵌入所述脂质膜。4. 如权利要求1所述的组合物，其中，至少约99%的ICG嵌入所述脂质膜。5. 如权利要求1所述的组合物，其中，基本约100%的ICG嵌入所述脂质膜。6. 如权利要求1所述的组合物，其中，少于5%的ICG包裹在所述水性核中。7. 如权利要求1所述的组合物，其中，少于1 %的ICG包裹在所述水性核中。8. 如权利要求1所述的组合物，其中，没有可检测量的ICG包裹在所述水性核中。9. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述脂质纳米颗粒悬浮于pH为5-8且渗透压为 约303m0SM的生物相容性缓冲液中。10. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述纳米颗粒的平均尺寸为50nm至100nm。11. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述纳米颗粒表面具有负电荷。12. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述纳米颗粒在血清中稳定，在25°C下热灭活 的血清中6小时后保留其初始荧光的约90%至约100%。13. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述纳米颗粒的荧光强度是水溶液中游离ICG 的荧光强度的4倍至5倍。14. 如权利要求1所述的组合物，其中，在储存于4°C下0至约300天之后，所述纳米颗 粒的荧光强度是水溶液中游离ICG的荧光强度的4倍至100, 000倍。15. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物在低于约0. 5mg/kg体重的ICG剂量 条件下有效。16. 如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物在约0. 01mg/kg体重的ICG剂量条 件下有效。17. -种使受治者体内的组织或器官成像的方法，所述方法包括：将适量的权利要求1 所述的组合物给药于需要成像的受治者；获取所述受治者的组织或器官的图像。18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述组合物的给药途径选自全身给药和局部给 药。19. 如权利要求18所述的方法，其中，所述全身给药包括血管内注射。20. 如权利要求18所述的方法，其中，所述局部给药包括皮下注射、皮内注射、粘膜下 注射、浆膜下注射、肿瘤内注射、肌肉内注射、口服、经鼻给药和肿瘤内注射。21. 如权利要求19所述的方法，其中，所述组合物的量等于约0. 01mg/kg体重至约 0· 5mg/kg体重的ICG剂量。22. 如权利要求20所述的方法，其中，所述组合物的单点注射量等于约0. lng至约 0. lmgICG 剂量。23. 如权利要求17所述的方法，其中，所述组织或器官选自：淋巴管、二级淋巴组织、血 管、诸如动脉粥样硬化之类的内皮病变、肿瘤、诸如在炎症位点之类的三级淋巴组织、肝脏、 胆管、胆囊、肠、胃、脑、肾、乳腺、肺、心脏、眼、卵巢和前列腺。24. -种制备纳米颗粒的方法，其包括： (a) 在有机溶剂中混合吲哚菁绿ICG和脂质分子； (b) 蒸发所述有机溶剂以形成包含所述脂质分子和ICG的薄膜；以及 (c) 用缓冲盐水水合所述薄膜并减小粒度。25. 如权利要求24所述的方法，其中，所述脂质分子包括：1，2-二硬脂酰基-sn-丙三 基-3-磷酸胆碱DSPC和1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙 二醇-2000DSPEmPEG2000。26. 如权利要求24所述的方法，其中，所述有机溶剂包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或 二甲基亚砜DMSO。27. 如权利要求24所述的方法，其中，所述缓冲盐水包括约0. 9 %的NaCl和约20mM的 NaHC03〇28. 如权利要求24所述的方法，其中，所述方法不包括过滤步骤、纯化步骤或分离步骤 或者它们的组合。
【文档编号】B82Y5/00GK105854030SQ201510404534
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年7月10日
【发明人】何仁扬, 约翰·C·克拉夫特, 钱明心
【申请人】苏州同力生物医药有限公司