荧光固体脂质纳米颗粒组合物及其制备
【专利说明】荧光固体脂质纳米颗粒组合物及其制备
[0001] 本发明涉及药学和诊断组合物领域，特别涉及包含荧光探针的组合物，更特别涉 及包含所述探针的固体脂质纳米颗粒。
[0002] 本发明还涉及仪器诊断学，特别是实时成像引导手术的领域。
[0003] 发明背景
[0004] 吲哚菁绿（本文中也称为ICG)是经FDA批准的荧光探针，但是遭受快的代谢清 除，因为其通过肝脏快速排除。已知的是在静脉内注射之后，ICG结合至白蛋白并且随后 几乎仅被肝实质细胞摄取。当以〇. 5mg/kg的人推荐剂量施用ICG时，正常的血液半衰期 为大约 3.0 分钟（RosenthalE，ZinnKR编辑，OpticalImagingofCancer:Clinical Applications.NewYork,NY,USA:Springer;2009 年，第 72 页）。该有效的肝胆排泄防止了 ICG在特定病理部位的选择性积累，限制了其可能的临床应用，所述应用实际上主要被局限 于在眼部血管造影术，肝功能表征，或心输出量的测量方面的应用的血流的光学检查。
[0005] 吲哚菁绿被认为是在临床上荧光成像应用方面高灵敏度肿瘤检测和淋巴结的显 像的有希望的候选物。尤其希望的是在手术切除病灶或内窥镜手术治疗期间用于癌的病灶 和前哨淋巴结检测的实时可视化的ICG的制剂。
[0006] 然而，如以上所述，由于其在人血液中的非常低的停留时间，当以0. 5mg/kg的临 床推荐剂量使用时，ICG在静脉内施用之后不具有在肿瘤组织处的任何明显靶向性质。
[0007] 此外，ICG在水溶液中不稳定（已经在μΜ浓度），并且由于其聚集倾向而必 须在6小时内使用。染料-染料相互作用随着消光系数的降低和染料激发后的荧光 自猝灭效应而对ICG的光学性质有不良影响（Landsman，M.L. ;Kwant，G. ;Mook，G.Α.; Zijlstra,ff.G.Lightabsorbingproperties,stability,andspectralstabilization ofindocyaninegreen.J.Appl.Physiol. 1976, 40, 575 - 83).
[0008]SaxenaV.等人（JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB:Biology 74 (2004) 29-39)公开了用于改进ICG的水稳定性、光稳定性和热稳定性的聚（DL-乳酸共乙 醇酸）和聚乙烯醇聚合物型纳米颗粒。在该工作中，即使负载ICG的纳米颗粒的稳定性由 于将ICG包埋于聚合物包囊中而得以改进（在水溶液中显示2. 5-3天的半衰期），但是呈纳 米颗粒的ICG就游离的ICG溶液而言仍显示出在其峰值荧光强度方面的降低。该发现连同 高粒度分布（平均直径约350nm)可能导致在肿瘤靶向的体内成像方面的低效率。
[0009] W02010/018216公开了ICG吲哚菁绿的荧光纳米乳液，其在油相ICG中包含至少一 种两亲性脂质和至少一种在25°C为固体的增溶性脂质。根据该文献，纳米乳液中的液滴应 当具有无定型核芯，因为结晶性被认为对有利于将经包封的分子排出至液滴或它们的聚集 体外部的纳米乳液稳定性不利。
[0010] 尽管通过上述纳米颗粒和纳米乳液提供了明显的进步，但将ICG用于近红外成像 仍遇到问题。Altino含III和Adair(WIREsNanomedicineandNanobiotechnology，第二卷， 2010年九月/十月，461-477)证实了量子点（QD)在NIR成像中优异的光学和稳定性性质。 然而，毒性问题阻碍了它们的使用并且仍建议NIR染料。回顾了ICG在由磷酸钙合成的纳 米颗粒中的包封，并且尽管相对于QD的性能较低，但仍建议其临床应用。
[0011]Zheng等人（Mol.Pharmaceutics2011，8, 447-456)，为 了克服ICG的差的水稳 定性、其非特异性结合至蛋白质和缺乏靶向特异性的问题，公开了利用磷脂-聚乙二醇 (PL-PEG)与ICG之间的非共价自组装化学的含ICG的纳米结构。建议了该纳米结构用于靶 向光学成像和光热治疗的双重功能。最近已描述了它们在体内光热治疗中的用途（Zheng 等人，Mol.Pharm, 2012, 9 (3) : 514-522) ·
[0012] Navarro等人（JournalofBiomedicalNanotechnology，第 8 卷，594-604 和 730-741,2012)公开了有利于术中荧光的ICG的脂质纳米颗粒向量化（LNP)。在所述工作 中，在至多两天量化了ICG-LNP与游离染料注射相比的体内肿瘤/皮肤和体外肿瘤/肌肉 荧光比例的改进（在24和48h之间为2倍）。
[0013]US2006/0083781公开了固体脂质纳米颗粒，其考虑到它们在肿瘤靶向治疗系统， 温敏净荷递送系统，磁驱动靶向系统，治疗诊断系统，稳定化的油墨组合物和化妆品制剂中 的应用而被官能化。此外，可修改所开发的方法以包封脂质环境中的量子点，减少它们对氧 化性物质的可接近性和与Cd相关的毒性。
[0014]Sawant和Dodiya(RecentPatentsonDrugDelivery&Formulati on2008, 2, 120-135)中提供了对待用于脂质纳米颗粒制备的所有方法的现有技术的 回顾。为了使纳米颗粒的递送性质最优化，优选需要低于l〇〇nm的粒度。相反地，文 献中所开发的许多方法为SLN提供了微米范围（Cortesi等人，Biomaterials2002; 23:2283-2294)或不低于 200nm(Garcia-Fuentes等人，ColloidsandSurfaces B:Biointerfaces, 2003, 27:159-168;Morel等人，EuropeanJournalofPharmaceutics andBiopharmaceutics45(1998) 157 - 163)的平均粒度，即远高于优选的纳米尺度范围。
[0015] 有利地，在本发明中，纳米悬浮液的制剂显示出低于100nm的粒度且显示出延长 的血液循环半衰期和改进的光稳定性和荧光信号。
[0016] 这些不可预料的结果通过最优化两亲性组分和制备方法而得以实现。
[0017] 发明简述
[0018] 现已不可预料地发现，将ICG以及ICG的其它荧光染料类似物连同其它化学结构 引入固体脂质纳米颗粒，解决了现有技术的上述问题，还提供了另外的有利之处，其将由本 发明的以下公开而明白可见。
[0019] 本发明的一个目的是固体脂质纳米颗粒（下文也称为SLN或简称为纳米颗粒），其 包括：
[0020] a.固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；
[0021] b.两亲性组分的混合物；
[0022] c.以具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物存在的两亲性组分：
[0023]
[0024] 其中，基团将在以下说明书中定义。
[0025]d.菁家族的焚光染料和/或多杂环化合物（polyetherocycliccompound)，包括 香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可 接受的盐。
[0026] 本发明的另一目的是用于制备所述纳米颗粒的方法。
[0027] 本发明的另一目的是药物组合物，其包含上述纳米颗粒，尤其是用于诊断。
[0028] 本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其用作诊断剂。
[0029] 本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其中分子靶向结构部分存在于纳米颗粒表面 上，实现了对所选择的靶器官、组织或细胞的相关结合亲和力。
[0030] 本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其作为诊断剂用于仪器诊断学中，尤其是实 时图像引导手术中。
[0031] 本发明的另一目的是上述纳米颗粒，其作为诊断剂用于临床荧光成像应用中的肿 瘤检测和淋巴结的显像，尤其是在手术切除病灶或内窥镜/腹腔镜手术治疗期间用于癌的 病灶和前哨淋巴结检测的实时可视化。
[0032]当用荧光染料负载时，本发明的SLN随着在感兴趣的病理性组织中随后的聚集由 于增强的渗透和保留（EPR)效应而允许延长的血液循环半衰期。
[0033] 根据本发明的SLN由于关于荧光团的游离形式的脂质基质保护效应和改进的荧 光信号而显示出增强的光稳定性。
[0034] 此外，脂质组分可以防止染料受取决于与猝灭剂分子的相互作用的降解因素或受 由于临界生物条件（即酸性pH)的化学降解或受光暴露（光致褪色过程）的损害。
[0035] 最后，将荧光染料配制到根据本发明的SLN中由于由周围组分的空间约束产生的 非辐射驰豫速率的降低而改进了染料的荧光量子产率（Φ)。
[0036] 这些和其它目的以及有利之处将在以下说明书中还借助附图和实施例详细公开。
【附图说明】
[0037] 图1展现了本发明的负载ICG的SLN的典型粒度分布。
[0038] 图2展现了ICG和负载ICG的SLN的光致褪色试验结果。
[0039] 图3展现了负载ICG的SLN的长期稳定性。
[0040] 在图4中，画面A展现了负载ICG的SLN在水溶液中于时间点为零（虚线）和在 配制120天之后（黑线）的UV-Vis光谱；画面B显示了ICG在水溶液中在不同时间点（时 间点为零：虚线；9天：灰色线；15天：黑线）的UV-Vis光谱。
[0041] 图5展现了用于评价对负载FA-ICG的SLN(靶向的ICG-SLN)的和非靶向 SLN(ICG-SLN)的抗叶酸IgG的结合亲和力的激光干涉法试验。
[0042] 图6展现了在带有IGR0V-1异种移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用负载 ICG的SLN和负载FA-ICG的SLN之后24h的小鼠（η= 6)的体外分析。
[0043] 图7展现了在带有IGR0V-1异种移植卵巢癌的Balb/Cnu/nu小鼠中在施用 ICG-SLN(画面A)和FA-ICG-SLN(画面B)之后24h的两代表性小鼠的体外分析。
[0044] 图8展现了靶向的负载ICG的SLN的光密度（750nm)。
[0045] 图9展现了实施例1的负载ICG的SLN的DSC。
[0046] 图10显示了实施例2的负载ICG的SLN的DSC曲线。
[0047] 发明详述
[0048] 根据本发明的纳米颗粒包括以下作为基本组分：
[0049]a)固体脂质核芯，其包括至少一种甘油酯和/或至少一种脂肪酸；
[0050]b)形成围绕所述核芯a)的壳的两亲性组分的混合物；
[0051] c)以具有式I和/或II的化合物的碱土金属配合物存在的两亲性组分：
[0052]
[0053] 其中基团如下文所定义，或其药学上可接受的盐；
[0054]d)菁家族和/或多杂环化合物的荧光染料，包括香豆素、吡喃并、喹啉、吡喃并喹 啉、吲哚和吡喃并吲哚衍生物，其呈酸形式，或其药学上可接受的盐。
[0055] 在本发明的另一实施方案中，所述纳米颗粒还包括：
[0056]e)具有掩蔽剂（stealthagent)功能的共价连接至所述壳b)的亲水性聚合物。
[0057] 在本发明的另一实施方案中，所述纳米颗粒还包括：
[0058]f)分子靶向结构部分，用于特异性结合至一个病理学相关的生物学标记物，所述 结构部分连接至所述壳b)或所述亲水性聚合物e)。
[0059] 以下百分比组成涉及用于制备SLN的组分a)至f)的量而不考虑最终悬浮液基本 上不含的离子型表面活性剂和低分子量醇的贡献。
[0060] 在下文，组分a)至f)的每一个表示为相对于SLN干组分总重的量的重量/重 量％。
[0061] 固体脂质核芯a)包括至少一种甘油酯，优选甘油三酯和/或至少一种脂肪酸或 其酯，或其混合物，其至少在室温（即约20-25Γ)至体温（37°C)的温度范围内为固体形 式。在本发明的第一实施方案中，所述固体脂质核芯a)包括至少一种甘油酯，其选自甘油 单酯、甘油二酯或甘油三酯，具有饱和或不饱和的直链或支链C12-C24酰基链。在甘油二酯和 甘油三酯的情况下，所述酰基链可以相同或不同。所述脂肪酸或其酯具有饱和或不饱和的 直链或支链C12-C24碳链。出于本发明的目的还提供所述脂肪酸的酯，优选提供具有C 12-C24 脂肪醇的酯。
[0062] 出于本发明的目的，"固体脂质核芯"意指在室温（即约20-25Γ)至体温（即，约 37°C)的温度为固体的脂质核芯。
[0063] 可以占约30-50% (重量/重量），优选35-45%的所述固体核芯（本文中也称 为"脂质组分"）包括至少一种甘油酯（选自甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，具有长度为 12-24个碳原子的饱和或不饱和的直链或支链烃链，具有大于37°C的熔化温度）或其混合 物和/或至少一种饱和或不饱和的直链或支链C12-C24脂肪酸或其酯，条件是所选择的比例 在上述条件下提供固体组合物。
[0064] 所述脂质组分还可以为甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的混合物，例如以名称 SOFTISAN?和Witepsol?，优选Witepsol?W35、H42、E76、E85 或SOFTISAN? 138、142、154已知的市售混合物。
[0065] 优选地，所述脂质组分由甘油三酯如三棕榈酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、三硬脂酸 甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三花生酸甘油酯或其混合物组成。根据特别 优选的实施方案，所述固体核芯包括三棕榈酸甘油酯（三棕榈精，tripalmitin)。
[0066] 所述脂质组分优选包括至少一种C12_C24脂肪酸，其烃链可以是饱和或不饱和的、 直链或支链的。优选地，所述脂肪酸选自：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸或其混合物。 所述核芯任选地包括(：12-(：24脂肪酸与c12-c24脂肪醇的单酯或二酯。脂肪酸酯组分可以进 一步例如通过鲸蜡基棕榈酸酯代表。
[0067] 优选的脂质组合是三棕榈精和硬脂酸。
[0068] 根据可选的实施方案，a)中的脂质组分可以包括在水中不溶但是在有机溶剂中可 溶的其它脂质。例如，所述脂质可以为酯化的聚（丙烯酸）或酯化的聚（乙烯醇）。尤其 是所述脂质可以为被一种或多种醇全部或部分酯化的聚（丙烯酸）。在一个方面，使少于 全部的丙烯酸残基酯化。在另一方面，将基本上全部丙烯酸残基酯化。所述聚合物可以为 均聚物或共聚物。在一个方面，所述脂质可以包含至少一种(： 4_(：24醇。在一个方面，所述醇 可以是饱和或不饱和的，可以是直链或支链的，且可以是未取代或取代的。每个丙烯酸残基 处的醇可以相同或可以不同。在另一实施方案中，所述脂质可以为用一种或多种羧酸全部 或部分酯化的聚（乙烯醇）。在一个方面，使少于全部的或基本上全部的乙烯醇残基酯化。 所述聚合物可以是均聚物或共聚物。在各乙烯醇残基处的羧酸可以相同或不同。
[0069] 在SLN中，所述脂质组分为固体和呈无定形或晶体形式。
[0070] 根据特别优选的实施方案，所述固体核芯包括三棕榈精和硬脂酸且为晶体。
[0071] 关于组分b)，本发明包括使用两亲性化合物作为