结直肠癌的模型的制作方法
【专利说明】结直肠癌的模型 发明领域
[0001] 一般而言，本发明涉及结直肠癌（CRC)的一种临床相关模型和使用该模型来筛选 抑制瘤发生的化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 结直肠癌（CRC)是全世界第三位最常见的癌和第四位最常见的死因。CRC占所有 癌发病率的超过9%。在2013年，估计美国会诊断142, 820例新CRC病例且50, 830人会死 于该病（AmericanCancerSociety:CancerFactsandFigures2013.Atlanta,GA, 2013) 〇 CRC较差的存活对发病比至少部分由于高百分比的病例是在晚期诊断的。具有晚期转移性 CRC的患者的总体五年相对存活处于12. 5%(Howladeretal.SEERCancerStatistics Review, 1975-2010.NCI.Bethesda，MD，2013)。
[0004] 虽然已经开发了CRC的异种移植物模型，化学诱导模型，和遗传改造模型（例如小 鼠模型）来研究CRC，但是这些模型的瘤未能可再现地转移至区域性肠淋巴结和肝，即与人 CRC有关的靶器官。如此，开发能够重演人疾病发病机制的CRC模型的领域存在未满足的需 要。这样的CRC模型会是用于测试治疗剂和开发新型治疗策略的有价值的工具。
[0005] 发明概述
[0006] 本发明提供了一种重演人疾病发病机制的结直肠癌（CRC)模型，以及用于生成和 使用该模型的方法。
[0007] 在第一个方面，本发明特征在于一种非人哺乳动物，其在结肠粘膜表面上包括捐 献者瘤发生性细胞植入物，其中植入不导致结肠壁破裂（例如开口，撕裂，破裂，或刺穿） (即较深的结肠壁层的完整性得到维持）。在一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植 入物能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长（例如导致穿透穿过外肌层的 富含胶原IV的基底膜到达浆膜表面的生长）。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性 细胞植入物的侵入性生长特征在于CRC(例如人CRC)的常见靶器官（即靶转移器官或转 移组织），诸如肠淋巴结，肝，或肺中的转移。在另一个实施方案中，所述非人哺乳动物在植 入后不展现腹膜腔中可检测到的瘤形成（例如腹膜癌病）。在另一个实施方案中，所述捐 献者瘤发生性细胞植入物包括癌细胞系的细胞。在一个实施方案中，所述癌细胞系为CRC 细胞系（例如HCT116)。在另一个实施方案中，所述癌细胞系为非CRC细胞系（例如肺癌 细胞系，肝癌细胞系，脑癌细胞系，淋巴结癌细胞系，肾癌细胞系，胃癌细胞系，卵巢癌细胞 系，皮肤癌细胞系，胰腺癌细胞系，甲状腺癌细胞系，前列腺癌细胞系，或乳腺癌细胞系，例 如MDA-231)。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物为完整瘤，或其碎片。 在一个实施方案中，所述完整瘤，或其碎片可以是恶性的（例如转移性的，区域侵入性，和/ 或远程侵入性）。在另一个实施方案中，所述完整瘤，或其碎片可以是良性的（例如非转移 和/或局部侵入性）。在一些实施方案中，所述完整瘤，或其碎片为完整CRC瘤，或其碎片。 在其它实施方案中，所述完整瘤，或其碎片为完整非CRC瘤，或其碎片（例如乳腺癌瘤，肺 癌瘤，肝癌瘤，脑癌瘤，淋巴结癌瘤，肾癌瘤，胃癌瘤，卵巢癌瘤，皮肤癌瘤，胰腺癌瘤，甲状腺 癌瘤，或前列腺癌瘤，或其碎片）。在另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物 的细胞的子集（例如 5%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%， 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或 99%或更多的）能够进 行侵入性生长。在其它实施方案中，所述捐献者瘤发生性细胞植入物的每一个（即100% ) 细胞的生长可以特征在于侵入性生长。在另一个实施方案中，所述非人哺乳动物为啮齿动 物，诸如小鼠或大鼠。在一些实施方案中，所述啮齿动物（例如小鼠或大鼠）可以是免疫缺 陷型的或免疫受损型的。在某些实施方案中，免疫缺陷型小鼠可以为NOD/SCID小鼠或NOD/ SCID白介素-2受体伽马链缺无（NSG)型小鼠。在其它实施方案中，所述非人哺乳动物是野 生型的和/或免疫胜任型的（例如野生型或免疫胜任型啮齿动物，例如野生型或免疫胜任 型小鼠或大鼠）。
[0008] 在第二个方面，本发明特征在于一种用于生成第一个方面（即CRC的非人哺乳动 物（例如啮齿动物）模型）的非人哺乳动物（例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠）的方法，该 方法包括：外置宿主非人哺乳动物的结肠粘膜表面，将一个或多个瘤发生性细胞植入到所 述结肠粘膜表面上，并将包含一个或多个植入的瘤发生性细胞的外置的结肠重插入到所述 宿主非人哺乳动物中。
[0009] 在第三个方面，本发明特征在于一种筛选抑制瘤发生性细胞生长（例如将瘤发生 性细胞的生长抑制至少 20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%或更多，例如与未处理或对照处理组 相比）的化合物的方法，该方法包括：使本发明的非人哺乳动物的捐献者瘤发生性细胞植 入物与候选化合物接触，并测定所述候选化合物是否抑制所述瘤发生性细胞生长，由此将 所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的化合物。
[0010] 在第四个方面，本发明特征在于一种筛选抑制瘤发生性细胞生长（例如将瘤发生 性细胞的生长抑制至少 20 %，25 %，30 %，35 %，40 %，45 %，50 %，55 %，60 %，65 %，70 %， 75 %，80 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，或99 %或更多，例如与未处理或对照处理 组相比）的辅药的方法，该方法包括：自第一个方面的非人哺乳动物的结肠粘膜表面取出 捐献者瘤发生性细胞植入物，对所述非人哺乳动物施用候选化合物，并测定所述候选化合 物是否抑制瘤发生性细胞生长，由此将所述候选化合物鉴定为抑制瘤发生性细胞生长的辅 药。
[0011] 在本发明的第三个或第四个方面的一个实施方案中，测定所述候选化合物是否抑 制瘤发生性细胞生长的步骤包括评估所述候选化合物引发选自下组的至少一种响应（例 如1，2, 3,4,或5种响应）的能力：瘤发生性细胞数目的减少或稳定；瘤尺寸的缩小或稳定； 瘤载荷的缩小或稳定；瘤发生性细胞侵入性的降低或稳定；和瘤转移的减少或稳定。在第 三个或第四个方面的另一个实施方案中，所述候选化合物可以为小分子，肽，多肽，抗体，抗 体片段，或免疫缀合物。在第三个或第四个方面的另一个实施方案中，所述捐献者瘤发生性 细胞植入物可以能够进行穿过结肠壁到达结肠浆膜表面的侵入性生长（例如导致穿透穿 过外肌层的富含胶原IV的基底膜到达浆膜表面的生长）。在第三个或第四个方面的其它实 施方案中，所述瘤发生性细胞的侵入性生长可以特征在于CRC(例如人CRC)的一个或多个 (例如1，2,或3或更多个）常见靶器官（即靶转移器官或转移组织），诸如肠淋巴结，肝，或 肺中的转移。在第三个或第四个方面的其它实施方案中，所述非人哺乳动物在植入后不展 现腹膜腔中可检测到的瘤形成（例如腹膜癌病）。在第三个或第四个方面的另一个实施方 案中，所述非人哺乳动物为啮齿动物，诸如小鼠或大鼠。
[0012] 附图简述
[0013] 申请文件含有至少一幅彩色绘制的图。专利局会在提交请求并支付必要费用后提 供本专利或专利申请带彩图的拷贝。
[0014] 图1A显示来自9周龄的捐献者ApcMin/+;Villin-Cre对照小鼠的结肠（顶部和中 部小图）和肝（底部小图）的图像。纵向打开结肠，并对粘膜（顶部）和浆膜（中部）景 象成像，其中肛门位于左边。箭指示结肠息肉。肝的标框区域有放大。
[0015] 图1B描绘来自9周龄的捐献者ApcMin/+;Kras^^'Villin-Cre小鼠的结肠（顶 部和中部小图）和肝（底部小图）图像。纵向打开结肠，并对粘膜（顶部）和浆膜（中部） 景象成像，其中肛门位于左边。箭指示结肠息肉。肝的标框区域有放大。
[0016] 图 1C是显示 6 周龄的ApcMin/+;Villin-Cre(n= 5)和ApcMin/+;KrasLSLG12D/+; Villin-Cre(n= 4)小鼠中的内源结肠瘤负荷的一幅图。每个点代表来自小鼠个体的数据。 还显示了 均值土s.e.m.。*Ρ〈0· 05〇
[0017]图ID是显不ApcMin/+;Villin_Cre(η= 49)和ApeMin/+;KrasLSLG12D/+;Villin_Cre(η =14)小鼠的Kaplan-Meier存活曲线的一幅图。HR=危害比。
[0018] 图1E是来自已经接受内腔植入物的宿主野生型C57BL/6小鼠的一组大体（gross) 结肠图像（顶部小图：粘膜景象；底部小图：浆膜景象），所述内腔植入物是来自捐献者皮 下同种异基因移植物，在植入后9周收获的一个完整ApCMin/+;KraS _12D/+;Villin-Cre结肠 瘤碎片。结肠的标框区域在相应图像的右边有放大。比例尺代表3_。
[0019] 图1F和1G是来自已经接受内腔植入物的两只宿主野生型C57BL/6小鼠的结肠 (顶部和中部小图）和肝（底部小图）的图像，所述内腔植入物是在植入后63周（F;宿 主小鼠#359 ;良性）或植入后79周（G;宿主小鼠#590 ;恶性）收获的一个完整ApcMin/+; KraS^sl2D/+;Villin-Cre捐献者瘤。对结肠粘膜和/或浆膜景象成像，其中肛门位于左边。 箭指示植入的捐献者瘤。肝的标框区域有放大。在图1G中，结肠的标框区域有放大以突显 淋巴结转移。
[0020] 图1H是显示将一个完整ApCMin/+;KraSLSLG12D/+;Villin-Cre捐献者瘤内腔植入野生 型C57BL/6宿主小鼠结肠后良性对恶性行进的发生率的一张表。
[0021] 图2是一幅示意图，有内腔植入技术的代表性图像。植入前：通过异氟烷吸入来麻 醉小鼠，以仰卧位放置，并用胶带将四肢绑定至纱布覆盖的平台。止血钳插入：将钝止血钳 插入肛门，并温和夹起粘膜。直肠脱垂诱导：自肛门收回止血钳，使得粘膜外置。瘤植入：将 大约10mm3的捐献者瘤缝合到外置的结肠的粘膜表面上。瘤缝合：剪断缝线末端，留下捐献 者瘤稳固地附着至粘膜。直肠脱垂倒转：使用钝灌胃针将外置的结肠与缝合的捐献者瘤一 起重插入，如此倒转直肠脱垂。
[0022] 图 3A是将一个来自捐献者小鼠 #4700-260 的ApcMin/+;KrasLSLG12D/+;Villin-Cre结 肠息肉内腔植入野生型C57BL/6宿主小鼠#344的结肠后的一系列内窥镜检查术图像，显示 了内腔植入的ApCMin/+;KraS ^12D/+;Villin-Cre结肠息肉保持良性。系列图像是在所示时 间自宿主捕捉的。
[0023]图 3B是将来自捐献者小鼠 #4700-260 的一个ApcMin/+;KrasLSLG12D/+;Villin-Cre结 肠息肉内腔植入野生型C57BL/6宿主小鼠#346的结肠后的一系列内窥镜检查术图像，显示 了内腔植入的ApCMin/+;KraS ^12D/+;Villin-Cre结肠息肉保持良性。系列图像是在所示时 间自宿主捕捉的。
[0024] 图4A是显示内腔植入后大体结直肠瘤形成的时间过程的一系列图像。植入后0 至7周以每周间隔自携带HCT116-DsRed内腔瘤的N0D/SCID小鼠收获结肠，纵向打开，并成 像。顶部和底部小图分别显示结肠的粘膜和浆膜景象，其中肛门位于每幅小图的左边。
[0025] 图4B是HCT116_DsRed内腔植入后的一系列内窥镜检查术图像。系列图像是在植 入后0至4周自相同宿主捕捉的。植入后2周时的点线指示植入的瘤的周长。
[0026] 图4C是显示内腔植入后的原发性瘤体积的一幅图。每个时间点的小鼠的数目：植 入后0周（η= 3)，植入后1周（η= 3)，植入后2周（η= 6)，植入后3周（η= 6)，植入后 4周（n= 11)，植入后5周（η= 15)，植入后6周（n= 11)，植入后7周（η= 18)。数据以 均值和s.e.m代表。
[0027] 图4D是植入有HCT116_DsRed捐献者瘤的宿主结肠在植入后1周时的一幅组织学 图像，显示了苏木精和曙红（H&E)染色。
[0028] 图4E是是植入有HCT116_DsRed捐献者瘤的宿主结肠在植入后1周时的一幅组织 学图像，显示了胶原1￥((：〇11￥;绿色），〇81^(1(红色），和4,6-二脒基-2-苯基吲哚（04?1 ; 蓝色）染色。
[0029] 图4F是植入有HCT116_DsRed捐献者瘤的宿主结肠在植入后3周时的一幅组织学 图像，显示了H&E染色。
[0030] 图4G-4I是图4F中所示位置的放大组织学图像，每幅显示ColIV(绿色）， DsRed(红色）和DAPI(蓝色）染色。
[0031] 图5A是内腔植入HCT116-DsRed瘤碎片后立即用苏木精和曙红（H&E)染色的来自 N0D/SCID小鼠的结肠的一幅组织学图像。
[0032] 图5B和5C是图5A中所示位置的放大组织学图像，每幅显示H&E染色。
[0033] 图?是内腔植入HCT116_DsRed瘤碎片后立即用ColIV(绿色），DsRed(红色） 和DAPI(蓝色）小鼠染色的来自N0D/SCID小鼠的结肠的一幅组织学图像。
[0034] 图5E和5F是图?中所示位置的放大组织学图像，每幅显示ColIV(绿色）， DsRed(红色），和DAPI(蓝色）染色。
[0035]图5G是显示在移植后第1天检测不到的瘤细胞播散的一组图像和图。第0天，将 HCT116-DsRed捐献者瘤碎片植入到宿主小鼠结肠的粘膜表面上（η= 2)。移植后第1天， 实施内窥镜检查术，并捕捉移植的瘤的图像（顶部）。然后处死小鼠，收获肝，肺，肠血管 束，和血，并通过流式细胞术评估DsRed+细胞。阴性对照由自野生型小鼠收获的组织样品 组成。阳性对照由含有HCT116-DsRed+瘤细胞的组织样品组成。通过流式细胞术评估平均 5xl06个可存活细胞。建立门，使得相应阴性对照样品检测不到DsRed+细胞。门内的数目 表示DsRed+细胞的百分比。
[0036] 图6是来自携带HCT116-DsRed内腔瘤的N0D/SCID小鼠的结肠的一系列图像，显 示了内腔植入后结直肠瘤形成的时间过程。植入后0至7周以每周间隔收获结肠，纵向打 开，固定并切片，并通过H&E(左栏）或对ColIV(绿色），DsRed(红色），和DAPI(蓝色） (右栏）染色。在所有小图中，肛门位于左边，其中结肠的内腔朝向顶部。
[0037] 图7A是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的N0D/SCID小鼠的大体结肠的 一组图像，其中箭指示区域性淋巴结转移；底部左边小图显示通过苏木精和曙红（H&E)进 行的组织学染色；而蓝色和红色标框区域分别在底部中部和右边小图中放大显示，并对Col IV(绿色），DsRed(红色），和DAPI(蓝色）染色。
[0038] 图7B是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的N0D/SCID小鼠的肝的一组图 像，其中箭指示转移；中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，点线指示转移性节结的周 长；而标框区域在右边小图中放大显示，并对ColIV(绿色），DsRed(红色），和DAPI(蓝 色）染色。
[0039] 图7C是植入后7周时携带HCT116-DsRed内腔瘤的N0D/SCID小鼠的肺的一组图 像，其中箭指示转移；中部小图显示通过H&E进行的组织学染色，箭指示转移性节结；而标 框区域在右边小图中放大显示，并对ColIV(绿色），DsRed(红色），和DAPI(蓝色）染色。
[0040] 图7D是显示在N0D/SCID小鼠中内腔植入HCT116-DsRed瘤后肠淋巴结，肝，和肺 内