一种基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测人Septin 9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌（colorectal cancer,CRC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，其女 性结直肠癌的发病率12.7% (居女性肿瘤的第二位），男性结直肠癌的发病率为13.2% (居 男性肿瘤的第S位）（Ferlay)J.,et al;2013,European journal of cancer 49,1374-1403)。2012世界卫生组织(WHO)发表报告指出：2012年CRC新增病例为136万，死亡病例为 69400;并且着重指出近年来中国和东欧国家CRC的发病率迅速增加（GL0B0CAN 2012: Estimated Cancer Incidence ,Mortality and Prevalence Worldwide in 2012)。在我 国，近年来在宫颈癌、食管癌、鼻咽癌、胃癌死亡率明显下降的同时，CRC的发病率和死亡率 明显上升，总体增加36.7% (陈竺.全国第=次死因回顾抽样调查报告）。截止至2009年，我 国CRC为发病率为29.4/10万，约占当年确诊肿瘤患者的10 %左右(Wang，et曰1; 2013，China (Mincer 22,515-520)。
[0003] CRC发展过程大部分均有明确的癌前病变，经息肉、腺瘤或扁平腺瘤过渡并癌变发 展为进展性癌甚至远处扩散，从腺瘤发展到早期癌需5~10年时间，从早期癌发展到进展期 癌约2~5年时间，总病程可达20余年（Jones,S.,et al;2008,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American 105,4283-4288)。 CRC的发生是一个多因素、多步骤的过程，是遗传学与表观遗传学共同作用的结果，其机制 尚不清楚。目前研究证实主要与癌基因/抑癌基因突变及表观遗传学改变有关(Coppede, F.，et al;2014，Cancer letters 342,238-247)。遗传学调控是指核巧酸序列的变化，包括 基因的突变、缺失、插入、重组等；而表观遗传学调控主要通过DNA甲基化和组蛋白修饰等 方式来影响基因转录活性，但DNA序列不发生改变。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用 下，S-腺巧甲硫氨酸的甲基(-C册)共价结合至化NA分子的胞喀晚(C)碱基的5位碳原子上，形 成5-甲基胞喀晚(5mC)，而并不改变DNA的序列。在人类基因组DNA中，大约有70%CpG会发生 甲基化修饰，可被甲基化修饰的CpG二核巧酸通常处于基因的启动子区域或者5'端非翻译 区和第一个外显子区。越来越多的研究表明人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有 关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。
[0004] 研究表明：在结肠癌活检组织、激光显微切割的上皮细胞和间质中，随着疾病从腺 瘤进展到不典型增生再到癌，组织中S邱tin 9基因 mRNA的表达进行性减少，而且CRC组织中 的S邱tin 9表达量显著低于健康对照组，运个研究表明S邱tin 9基因启动子的甲基化造成 的Septin 9基因表达的减少，可能是结肠组织中良性病变进展为恶性病变的原因。
[0005] 近年来，国外已开发出基于实时定量PCR技术（quantitative real-time PCR， qPCR)的外周血人S邱tin 9基因甲基化检测方法和相应的试剂盒。同FOTB和CEA肿瘤标志物 相比，基于qPCR方法的外周血Septin 9基因甲基化检测不仅有较高的灵敏度和特异性，而 且对于左侧病变和右侧病变没有任何灵敏度方面的差异(Toth,K.，et al;2011 ,Pathology oncology research:POR 17,503-509)。
[0006] 但qPCR技术也有其局限性，具体表现在：灵敏度不高、精准度不高、重复性不好 (化urch，T.R.，et al;2014,Gut 63,317-325)。运些局限性是由qPCR技术本身的瓶颈所造 成的。在qPCR技术中，需要通过S个参数(巧光信号-Cq值-DNA模板起始浓度）间的关系，确 定祀标基因相对于外部参照(标准曲线或对照样本）的含量。然而，许多因素如设备、操作 者、模板的起始浓度、标准物质等都会影响Cq值和PCR的扩增效率，继而影响qPCR的定量结 果。更重要的是，当样本中祀标的拷贝数少或丰度低时，qPCR检测的灵敏度和精密度受到限 审Ij(怖ale et al. ,2012,Nucleic acids research 40,e82)。同时，对一些样品如miRNA，由 于标准曲线难W制备，很难对其进行定量(Ma et al.,2013, Biomarker insi曲ts 8,127-136)。国内外不同研究者用同样的已商业化的基于qPCR技术的人S邱tin 9基因甲基化检测 试剂盒开展的CRC回顾性检测研究中，其检测结果差异性比较大，灵敏度从68%变化到 95.6%(Potter,N.T.,et al；2014,Clinical chemistry 60,1183-1191&Toth,K.,et al； 2011,Pathology oncology resea;rch:P0R 17,503-509)。因此，本领域迫切需要建立新的 具有高灵敏度、高特异性、高稳定性、依从性好的人Septin 9基因甲基化的检测技术。
[0007] 数字式PCR(digital PCR，dPCR)是新近发展起来的第S代PCR技术，主要包括大规 模集成微流控忍片数字PCR(chamber based digital PCR，cdPCR)和微滴数字PCRWroplet digital PCR，ddPCR)，运两种方法都是在PCR扩增前将待测DNA样本随机分配形成微反应液 滴，每个微反应液滴中或者不含待测的核酸祀分子，或者至少含有一个待测的核酸祀分子， 且每个微反应液滴都是一个独立的PCR反应器。经过PCR扩增后，检测器对每个微反应液滴 进行检测，有巧光信号的就判定为"r，没有巧光信号的就判定为"0"，最终根据泊松分布原 理和阳性微滴的比例，直接计算出待测样本中祀序列的拷贝数或浓度。
[0008] 目前，已有研究报道采用数字PCR技术用于病原微生物、儿童遗传性疾病、肿瘤突 变和拷贝数变异的检测，但还没有应用数字PCR技术检测人类基因甲基化水平的相关文献。
【发明内容】
[0009] 为了解决基于qPCR技术的人S邱tin 9基因甲基化检测方法中所存在的CRC检测灵 敏度不高、重复性和精密度不好、不能绝对定量的技术瓶颈，本发明提供了一种基于数字 PCR技术的人Septin 9基因甲基化检测的方法及其试剂盒，本发明另外还提供了用于基于 数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的化qMan探针和PCR引物及其应用。
[0010] 本发明提供的基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的方法，包括W下步 骤：（1)将待测的DNA模板、PCR引物、可检测标记物W及PCR预混液混合，制备数字PCR混合 液；（2)利用所制备的数字PCR混合液，通过微滴发生器或微流体制备系统制备可独自进行 PCR扩增反应的PCR微反应液滴；（3)对所制备的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应；（4)对经 PCR扩增反应的产物进行信号收集，根据巧光信号的有无判断待测样品中是否含甲基化的 人S邱tin 9基因及其数量和含量;其中，所述可检测标记物为化qMan探针或EvaGreen巧光 染料，所述化qMan探针为连接报告巧光基团和泽灭基团的核巧酸，其核巧酸序列如SEQ ID No:l、SEQ ID No:2或SEQ ID No:3所示;并且所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述 正向引物的核巧酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述反向引物的核巧酸序列如 沈Q ID No:5或沈Q ID No:7所示。
[0011] 上述TaqMan探针连接的报告巧光基团可W是FAM、皿X、VIC、TAMRA、TexasRed、 R0X、切5中的一种或多种，所述泽灭基团可W是肌91、8朋2、]?68^411?4、048(：化中的一种或 多种。
[001^ 上述PCR预混液由ImM dNTPs、0.1UAU DNA聚合酶(热启动酶）、5mM氯化儀、IOmM的 TriS ? Cl组成，步骤(3)中PCR扩增反应的反应体系的终浓度组成为:PCR预混液、0.1~IiiM PCR引物、0.001~1 Ong/山待测的DNA模板、0.1~IiiM可检测标记物，上述中PCR扩增反应的 扩增条件为:95°C~97°C预变性5~30分钟，95°C~97°C变性10~50秒，50°C~65°C退火10 ~30秒，共进行35~60个循环。
[0013] 在本发明的通过非入侵检测人Septin 9基因甲基化的方法中，通过提取待测者血