按相同条件分别 进行8次检测。本方法提供的检测方法及其试剂盒的批内差(CV)为7.8%，批间差11.2%，均 在15 % W内，表明本发明提供的检测方法准确、可靠。
[0092] (3)CRC患者转移和复发的检测：
[0093] 为了进一步验证本发明提供的检测方法和试剂盒可W通过检测人Septin 9基因 甲基化水平来监控CRC患者治疗后的复发和转移状况，本发明采用外周血检测中检测灵敏 度最高的T2检测体系对CRC1、CRC22、CRC73S名治疗后发生转移和复发患者和治疗后1年内 没有发生转移和复发的患者CR巧6进行回顾性验证检测（即检测治疗后1个月~12个月的外 周血中Septin 9基因的甲基化水平），检测结果如图1所示。
[0094] 结果表明CRC1、CRC22、CRC73患者的外周血中Septin 9基因的甲基化水平分别在 治疗后第5月、第6个月和第4个月降到最低，随后又开始上升到第12个月达到最高；而CR巧6 患者的外周血中Septin 9基因的甲基化水平一直进缓慢下降，在观察期没有发生上升。
[00巧]实施例4:结直肠癌S邱tin 9基因甲基化检测试剂盒
[0096] 采用本发明提供的人Septin 9基因 V2启动子甲基化引物和探针，结合数字PCR检 测法，开发出针对结直肠癌Septin 9基因甲基化状态检测的试剂盒，可W快速、灵敏、特异 地检测样本中人S邱tin 9基因甲基化状态，可W对直肠癌患者S邱tin 9基因甲基化进行定 量和定性检测，从而对肿瘤患者的早期诊断、疾病进程的评估、微转移或复发等全方位监 控，可W作为肿瘤，尤其是结直肠癌的辅助诊断、监测和治疗。
[0097] 用于结直肠癌Septin 9基因甲基化状态检测的试剂盒的探针可选用本发明提供 的探针I、探针n和探针m中的一种;还可选用本发明提供的正向引物1/反向引物I，或正向 引物n/反向引物n，特别优选正向引物1/反向引物I。
[0098] 另外，在试剂盒中还可W加入阳性和阴性对照试剂（阳性和阴性质控品），用于试 剂盒的质量控制，使检测结果更加准确、可靠。所述阳性质控品可W是亚硫酸氨盐修饰的全 甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品可W是修饰的非甲基化人类基因组DNA。
[0099] 利用已知核巧酸序列的探针和引物制备检测试剂盒的技术已为本领域的技术人 员所公知，因此对于本发明提供的结直肠癌Septin 9基因甲基化状态检测的试剂盒的具体 步骤在此不作寶述。
[0100] 上述实施例表明：本发明提供的人Septin 9基因甲基化检测方法和试剂盒具有灵 敏度高、特异性强、稳定性好、依从性高等优点。本发明提供的检测方法和试剂盒的灵敏度、 重复性要显著高于基于qPCR方法，不仅可用于检测外周血样本也可W用于检测粪便标本， 是一种依从性高、安全的非入侵式检测方法;本发明提供的检测方法和试剂盒可W提供绝 对定量结果;本发明提供的检测方法和试剂盒可W为CRC治疗后的预后、复发和转移提供可 靠的检测方法。
[0101] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 将待测的DNA模板、PCR引物、可检测标记物以及PCR预混液混合，制备数字PCR混合 液； (2) 利用步骤（1)所制备的数字PCR混合液，通过微滴发生器或微流体制备系统制备可 独自进行PCR扩增反应的PCR微反应液滴； (3) 对步骤(2)所制备的PCR微反应液滴进行PCR扩增反应； (4) 对经步骤(3)PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号的有无判断待测 样品中是否含甲基化的人Septin 9基因及其数量和含量； 其中，所述可检测标记物为TaqMan探针或EvaGreen焚光染料，所述TaqMan探针为连接 报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID N〇:l、SEQ ID N〇:2或SEQ ID No: 3所示； 并且，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:7所示。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接的报告荧光基团为FAM、HEX、VIC、 TAMRA、Texas Red、R0X、Cy5中的一种或多种，所述淬灭基团为fflQl、BHQ2、MGB、TAMRA、 DABCYL中的一种或多种。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR预混液由ImM dNTPs、0. lU/μΙ DNA 聚合酶(热启动酶）、5mM氯化镁、1 OmM的Tr is · Cl组成，步骤(3)中PCR扩增反应的反应体系 的终浓度组成为:PCR预混液、0.1~ΙμΜ PCR引物、0.001~lOng/μΙ待测的DNA模板、0.1~1μ Μ可检测标记物，并且步骤(3)中PCR扩增反应的扩增条件为:95°C~97°C预变性5~30分钟， 95°C~97°C变性10~50秒，50°C~65°C退火10~30秒，共进行35~60个循环。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测的DNA模板来源于人 类基因组DNA、肿瘤细胞和组织的基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血游离DNA、体液DNA或排 泄物细胞DNA，优选的是外周血循环游离DNA(cfDNA)、外周血中循环肿瘤DNA(ctDNA)、外周 血循环肿瘤细胞(CTCs)DNA和排泄物中肿瘤细胞或其DNA。5. -种用于基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的TaqMan探针，其特征在于， 所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1、 SEQ ID No :2或SEQ ID No :3所示。6. -种用于基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的PCR引物，其特征在于，所 述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:7所示。7. -种TaqMan探针在制备用于基于数字PCR技术检测人Septin9基因甲基化的试剂盒 中的应用，其特征在于，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷 酸序列如SEQIDNo :l、SEQIDNo:2或SEQIDNo:3所示。8. -种PCR引物在制备用于基于数字PCR技术检测人Septin 9基因甲基化的试剂盒中 的应用，其特征在于，所述PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列 如SEQIDNo :4或SEQIDNo:6所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo:5或SEQID No: 7所示。9. 一种用于基于数字PCR技术检测结直肠癌Septin 9基因甲基化状态的试剂盒，其特 征在于，包括:可检测标记物、PCR扩增引物以及阴性质控品和阳性质控品，所述阳性质控品 为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲 基化人类基因组DNA。10. 根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记物为TaqMan探针或 EvaGreen荧光染料，所述TaqMan探针为连接报告荧光基团和淬灭基团的核苷酸，其核苷酸 序列如SEQIDNo:l、SEQIDNo :2或SEQIDNo:3所示。11. 根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR引物包括正向引物和反向引 物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述反向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No:5或SEQ ID No:7所示。
【专利摘要】一种基于数字PCR技术检测人Septin？9基因甲基化的方法及所用探针与引物及其试剂盒，方法包括：将待测DNA模板、PCR引物、可检测标记物及PCR预混液混合，制备数字PCR混合液；制备PCR微反应液滴；对PCR微反应液滴进行PCR扩增；对扩增后产物进行信号收集，判断是否含甲基化人Septin？9基因及其数量和含量，其中可检测标记物为SEQ？ID？No：1、SEQ？ID？No：2或SEQ？ID？No：3所示的TaqMan探针或EvaGreen荧光染料，所述PCR引物包括SEQ？ID？No：4或SEQID？No：6所示的正向引物和SEQ？ID？No：5或SEQ？ID？No：7所示的反向引物。本发明的方法和试剂盒灵敏度高、特异性强、稳定性好、依从性高。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105603061
【申请号】CN201510918120
【发明人】宁云山
【申请人】宁云山
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月11日