法在本发明中未详细阐述的，可W参考相关文献和手册(分子克隆实验指南，第 =版J.萨姆布鲁克等编著，科学出版社）。
[0050] 通过本发明提供的DNA提取和制备方法，可W提高DNA模板的回收率，比目前广泛 采用的商品化的DNA制备试剂盒如QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit和QIAamp DNA Stool Kit等提高10~20%。同时，DNA模板的纯度为0〇26日/0化8日〉1.8,整个提取周期简捷快 速，比上述试剂盒缩短了近30 %时间。
[0化1] 实施例3:结肠癌患者和正常人S邱tin 9基因甲基化的检测
[0052] 1.人S邱tin 9基因甲基化检测试剂盒中的数字PCR探针和引物
[0053] 用于人Septin 9基因甲基化检测的探针可选用本发明提供的探针I、探针n和探 针m中的一种河选用本发明提供的正向引物1/反向引物I，或正向引物n/反向引物n，特 别优选正向引物1/反向引物I。
[0054] 2.外周血中样本DNA的提取
[0055] 取80例经临床确诊的结直肠癌患者和50例健康人外周血各5ml，离屯、收集血浆，-80°C胆存待用。将3ml血浆中加入30化1蛋白酶K裂解缓冲液，60°C消化IOmin后转移至高密 度二氧化娃离屯、柱中，冰上解育5分钟(min)后3000转/分钟(rpm)离屯、Imin,弃收离屯、管中 的滤液;在高密度二氧化娃离屯、柱中加入1ml高盐洗杂缓冲液，800化pm离屯、Imin，弃滤液； 重复洗杂步骤1次;甩干离屯、柱中残留液体（12000rpm离屯、2min);向高密度二氧化娃离屯、柱 内的膜中央加入I(K)山高PH值的DNA洗脱液，室溫放置Imin后，12000巧m离屯、2min，所得样本 即为DNA样本。通过紫外分光光度法对模板DNA浓度进行测定。
[0056] 3.粪便中样本DNA的提取
[0化7] 取50例经临床确诊的结直肠癌患者和15例健康人粪便各100~300mg，-80°C胆存 待用。将粪便中加入1ml蛋白酶K裂解缓冲液，70°C消化15min，1200化pm离屯、2min，上清转移 至高密度的二氧化娃离屯、柱中，冰上解育5min，50(K)巧m离屯、Imin，弃收离屯、管中的滤液;加 入Iml洗杂高盐缓冲液，80(K)rpm离屯、Imin,弃滤液;重复洗杂步骤1次;甩干离屯、柱中残留液 体（12000rpm离屯、2分）；向高密度离屯、柱内的膜中央加入10化1高PH值的DNA洗脱液，室溫放 置Imin后，12000rpm离屯、2min，所得样本即为DNA样本。通过紫外分光光度法对模板DNA浓度 进行测定。
[0化引 4.样本DNA的亚硫酸氨盐修饰(Bisulfite Conversion)
[0化9] 取提取的10化1待测样本DNA转移至PCR反应管中，加入19化1的亚硫酸氨盐反应 液，再加入30iU转化保护液;盖紧管盖后，振荡混匀，反应液短时离屯、，将反应液收集至管 底;将反应管置于PCR仪中，按照下列程序进行重亚硫酸盐转化反应:99°C5分钟，50°C25分 钟;99°C5分钟，50°C1小时25分钟;99°C5分钟，50°C4小时55分钟，保持20°C过夜，W保证转 化的完全反应。转化反应后，对修饰后的DNA模板进行纯化，纯化程序如下：取出32化1经转 化的模板DNA溶液移至1.5ml的离屯、管，加入1ml结合缓冲液和化1 poly A。将反应管中的溶 液转入纯化柱中，800化pm离屯、Imin，弃废液。加 SOOiil洗涂液(第1次)至纯化柱中，800化pm 离屯、Imin，弃废液。加500山脱硫液至纯化柱中，室溫放置15min，8000巧m离屯、Imin，弃废液， 重复上述洗杂步骤2次;将纯化柱转入新的收集管中，13000rpm离屯、Imin,去除残留溶液。将 纯化柱转入1.5ml离屯、管中，加3化1 DNA洗脱液至膜的中央，室溫放置3min，800化pm离屯、 Imin，所得溶液用于后续数字PCR扩增。
[0060] 5.人S邱tin 9基因甲基化数字PCR检测体系
[0061] 为了评价本发明提供的探针和引物可用于数字化PCR检测样本中人Septin 9基因 甲基化，将来源于同一样本的DNA模板分成6份，在Tl~T6不同的数字PCR检测体系和扩增条 件下完成其数字PCR的检测，数字PCR检测体系和条件如下表1所示：
[0062] 表1数字PCR检测体系及条件
[0063]
[0065] (I)数字PCR反应体系：在20山PCR反应体系中，包含正向引物和反向引物各化I，2 X数字PCR Supermix 1化1，探针0.化1，化1模板DNA，补足d地2〇至20山。
[0066] (2)微滴PCR反应体系的制备与扩增:将上述每个20山的PCR反应液加入已含有70y 1微滴发生油的微滴发生卡上（Bio-Rad)并置于微滴发生器（Bio-Rad)上生成微滴，在 2.5min生成2万个微滴，每个微滴可W独立进行PCR扩增。将生成的微滴转移至96孔板上进 行PCR反应。
[0067] (3)信号检测和数据分析:PCR扩增结束后，将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每 个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器（Bio-Rad)，通过QuantaSoft analysis (version 1.3.2.0)软件分析计算出待测样本中甲基化的人Septin 9基因的拷贝数和相应 的浓度。
[0068] 6.检测结果及分析
[0069] (1)外周血中人Septin 9基因甲基化检测结果：
[0070] 分别在Tl~T6数字PCR检测体系中完成了 80例结直肠癌确诊患者和50例健康人外 周血中人S邱tin 9基因甲基化检测（见表2-1~表2-6)。结果表明：在80例结直肠癌确诊患 者中，所有的I~IV期患者中共检出人Septin 9基因甲基化阳性样本70~74例，检出率为 88%~93% (所有检测条件下检测的总体灵敏度大于88%)，其中I期灵敏度为83~87%，n 期灵敏度为84%~89%，远高于目前临床上使用的基于qPCR的人S邱tin 9基因甲基化检测 (35 %~64 % )，可W用于CRC分期的早期阶段的筛查。在50例健康人对照样本中，在Tl、T3、 T5和T6检测体系中只有1例高于设定的阔值(但其结果值显著低于阳性结肠癌的结果），检 测方法的特异性为98% ;在T2和T4检测体系中，没有1例高于设定的阔值，检测方法的特异 性为100%。上述结果表明：本发明提供的数字PCR检测方法的灵敏度高于基于qPCR的人 Septin 9基因甲基化检测方法，尤其是CRC分期的早期阶段（I期和n期）的检出率显著高 于qPCR;两种检测方法的特异性相当。
[0071] 表2-1外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(Tl)
[0073] 表2-2外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(T2)
[00巧]表2-3外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(T3)
[0077]表2-4外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(T4)
[0080] 表2-5外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(T5)
[0082] 表2-6外周血中人S邱tin 9基因甲基化检测结果(T6)
[0084] 为了保证检测的准确性，本研究所有纳入人群入组前均证实无放射、化学疗法治 疗史，无其他部位恶性肿瘤，女性为非妊娠期，有效排除了甲基化的Septin 9基因在进行去 甲基治疗后呈可逆阴性结果。
[0085] 为了评价本发明方法的精密度和重复性，任意挑选一份阳性标本按相同条件分别 进行8次检测。本方法提供的检测方法及其试剂盒的批内差(CV)为5.2%，批间差8.6%，均 在10 % W内，表明本发明提供检测方法准确、可靠。
[0086] (2)粪便中人S邱tin 9基因甲基化检测结果：
[0087] 为了验证本发明提供的检测方法和试剂盒可W检测CRC患者粪便中的人S邱tin 9 基因甲基化水平，采用外周血检测中检测灵敏度最高的T2检测体系开展粪便中人S邱tin 9 基因甲基化检测（见表3)。结果表明：在50例结直肠癌确诊患者中，共检出Septin 9基因甲 基化阳性47例，检出率为94% (即检测的总体灵敏度为94% )，其中I期灵敏度为85%，II期 灵敏度为88%，远高于目前临床上使用的FOBT检测的水平，可W用于CRC的早期检测和筛 查。在15例健康人对照样本中，没有1例检测结果高于设定的阔值，检测方法的特异性为 100%，本发明方法的特异性远高于目前临床上使用的FOBT检测方法。
[0088] 表3粪便中人Septin 9基因甲基化检测结果
[0090] 为了保证检测的准确性，本研究所有纳入人群入组前均证实无放射、化学疗法治 疗史，无其他部位恶性肿瘤，女性为非妊娠期，有效排除了甲基化的Septin 9基因在进行去 甲基治疗后呈可逆阴性结果。
[0091] 为了评价本发明方法的精密度和重复性，任意挑选一份阳性标本