多重聚合酶链式反应方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多重聚合酶链式反应方法，具体地涉及该多重聚合酶链式反应方 法在低拷贝数量、高度复杂模板中高效及精准扩增目的核酸序列的应用。
【背景技术】
[000引聚合酶链式反应（PCR)能够W少量DNA为模板，并将目标DNA片段在短时间（几 小时）内W指数扩增的方式大量富集。多重PCR可W在一个反应中对多个基因同时进行扩 增，与常规PCR技术相比具有高效、省时、省样本等优势，因此该技术已成为临床和基础研 究中一种快捷简便的基因检测方法。然而，由于在多重PCR反应体系中，高浓度的多种引物 间会发生相互作用，严重影响了扩增的特异性和均一性，并导致扩增灵敏度和产量的降低。 送些问题大大限制了多重PCR的应用。
[0003] 目前，解决送个问题的传统方法有；使用特殊的软件来设计多重PCR的引物 (如 MPprimer 等）、优化反应组分和热循环条件（Markoulatos, P. , Siafakas, N. , Monc any, M. Multiplex polymerase chain reaction:A practical approach. [J]. Journal of Clinical Laboratory Analysis. , 2002, 16:47-51 ;Henegariu, 0. , Heerema, N. A.，Dlouhy, S.民.，et al. Multiplex PC民：Critical parameters and step-by-step protocol [J]. Biotechniques，1997, 23:504-511)。传统方法主要依赖大量的条件摸索和经 验的积累。除了基于经验的传统方法外，已有几种巧妙的策略来提高多重PCR的特异性。例 女口；利用复合引物（compositied primers)与巢式PCR相结合的策略也能较好的改善多重 PCR的特异性和产量的问题扣S2009/0253183 AUUS 2010/0291668 Al)。送一策略在引物 设计时，将一段序列完全相同的引物加入到每一个特异性引物的5'端（通用序列），从而组 成复合引物。送一序列完全相同的引物称为通用引物（common primer)，它的序列与待扩增 的模板不具有同源性。每一个复合引物由两部分组成：靠近5'端的通用引物和靠近3'的 特异引物。在第一轮扩增中，复合引物中只有特异性序列的能与模板配对并扩增，因此第一 轮扩增能将各DNA目标片段扩增出来；此外，由于每个特异引物的末端都附加有一段通用 引物的序列，因此在每一个扩增的产物的两端都具有相同的序列。在第二轮扩增中，只需加 入一种序列（通用引物）即可完成所有目标产物的扩增。此外，在引物合成是加入非天然 的人工碱基也能明显改善多重PCR的特异性。也有人报道称在多重PCR中引入一种单链结 合蛋白RecA也能改善多重PCR的特异性。
[0004] 然而，上述对多重PCR的改进方法都有一定缺点。传统的优化方法依赖大量的实 验来优化反应条件，且在不同的扩增体系下最佳的优化条件需要重新优化，需要耗费大量 的时间和试剂。利用通用引物和巢式PCR的策略的实验较简单且效果较好，但送一策略需 要保证通用引物的序列与DNA模板无同源性，送增加了实验设计的难度；巢式PCR需要将 第一轮产物进行第二轮扩增，送增大了实验室交叉污染的风险。此外，在第一轮扩增中引物 仍然可能因相互作用而产生非特异扩增，特异性的降低和扩增非均一性的问题仍然难W避 免。综上所述，上述多重PCR的优化策略会有优化过程复杂、需要特殊仪器、费用昂贵等问 题。
[000引本质上，多重PCR的问题主要是因大量不同序列的引物之间的相互干扰和竞争引 起。送些相互作用会导致引物二聚体、引物与模板错配等，进而导致非特异产物。由于在PCR 过程中，送些非特异扩增与特异性扩增竞争PCR反应底物，减少了特异性产物的产量，导致 灵敏度低的问题。送些问题极大的降低了基于多重PCR的检测方法的特异性和灵敏度。因 此，从引物的相互作用角度出发对PCR体系进行改进，使得PCR具有一种能选择性抑巧排特 异扩增、增强特异性扩增的能力就可W有效提高多重PCR的特异性和灵敏度；此外，从实际 应用的角度出发，建立一种操作简单、廉价且具有广泛适用性的多重PCR改进方法是十分 重要的。
[0006] 近年来，随着纳米技术的发展，许多纳米材料已被用于PCR的优化，如纳米金、纳 米银、量子点、纳米多聚物和纳米碳材料等。送些材料可不能程度的改善PCR中出现的各种 问题，但各类材料优化效果各有不同，且只是对常规PCR(单重PCR)的优化。氧化的石墨帰 材料是种新型的二维碳材料，具有比表面积大、导热性良好等性质。目前，人们已发现氧化 石墨帰能吸附DNA (单链DNA和双链）；此外，氧化石墨帰能有效降低含有错配的单链DNA的 配对效率。因此氧化石墨帰的特异性能很好的选择性抑制非特异配对和扩增，从而提高多 重PCR的特异性和灵敏度。送种方法不需要对各个引物对进行特殊的设计，也无需进行容 易导致污染的二次扩增，可W大大简化实验流程和降低交叉污染的风险。此外，大规模生产 分散均匀的氧化石墨帰水溶液的制备方法成熟，成本低廉。因此，利用氧化石墨帰作为添加 剂优化多重PCR可建立一种操作简单、低成本且具有广泛适用性的多重PCR优化策略。目 前，未见报道将氧化石墨帰用于多重PCR技术。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种氧化石墨帰在多聚合酶链式反应中作为优化剂和增 强特性剂的应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种多重聚合酶链式反应方法，包括步骤：
[0009] (A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引 物对、聚合酶、氧化石墨帰和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；
[0010] 度）对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产 物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和
[0011] (C)任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测，
[0012] 其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。
[0013] 在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨帰的含量为100 -50化g/25微升；较佳地150 - 40化g/25微升；较佳地200 - 30化g/25微升。
[0014] 在另一优选例中，各引物对中上游引物与下游引物之比为约0. 8-1. 2 ;0. 8-1. 2， 较佳地为约1:1。
[0015] 在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，氧化石墨帰的含量与所述代扩增 模板的含量之比为；100-500ng ;5-25ng ;较佳地 150-400ng ;5-25ng ;更佳地 200-300ng ; 5-25ng。
[0016] 在另一优选例中，所述聚合酶链式反应体系中，所述模板的浓度为0.1 -Wng/微 升，较佳地为0. 5-5ng/微升，更佳地为0. 8-化g/微升（如约lng/微升）。
[0017] 在另一优选例中，所述的模板为哺乳动物的总DNA。
[0018] 在另一优选例中，步骤度）中，聚合酶链式反应的退火温度为Tf±5°C，较佳地为 T平均±3。其中T平均为所有引物的Tm的算术平均值。
[0019] 在另一优选例中，步骤度）中，聚合酶链式反应的退火温度为45-7(TC，较佳地为 约 50〇C。
[0020] 在另一优选例中，在适量氧化石墨帰存在下，所述的多重聚合酶链式反应中W同 样的退火温度或氧化石墨帰浓度在低拷贝模板的条件下能扩增出全部特异性扩增产物。
[0021] 在另一优选例中，所述的"低拷贝模板"指反应体系中模板的总含量《5ng，较佳 地《化g，更佳地《Ing。
[0022] 在另一优选例中，所述的模板包括抽提的基因组DNA模板、抽提的RNA模板、或 CDNA模板。更佳地，所述的模板包括抽提的全基因组DNA模板。
[0023] 在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中引物对不需要特殊设计。
[0024] 在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中不含氧化石墨帰时（作为对照）， 在任意退火温度下，W人类基因组为模板不能扩增出全部特异性产物。
[00巧]在另一优选例中，所述的模板为人基因组DNA，且引物对包括7或8个引物对，并且 在一定的退火温度下，所述方法扩增出全部（即7或8个）特异性产物。
[0026] 在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应中用于扩增的引物对包括3-15个 引物对，较佳地5-10对，更佳地6-9个引物对。
[0027] 在另一优选例中，所述的多重聚合酶链式反应不仅扩增出全部特异性产物并且抑 制了引物二聚体和其它非特异性产物的形成。
[0028] 在另一优选例中，在扩增后的反应混合物中，所述的引物二聚体的数量少于总扩 增产物量的5% -10%
[0029] 在另一优选例中，所述的氧化石墨帰能抑制引物对中只含有一个错配碱基的非特 异扩增产物。
[0030] 在另一优选例中，在所述反应体系中，待扩增的模板的总量为0. 5-l(K)ng，较佳地 l-50ng。
[0031] 在另一优选例中，待扩增的模板的总量为l-5ng或20-4化g。
[0032] 在另一优选例中，所述模板的总量为Ing或5ng时，且所述引物对为8个引物对。
[0033] 在另一优选例中，所述的氧化石墨帰选自下组；通过Hummer法制备的水溶性氧化 石墨帰，其表面带有駿基、居基、氨基等基团。
[0034] 在本发明的第二方面，提供一种用于多重聚合酶链式反应试剂盒，所述试剂盒包 含：
[0035] -容器A W及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多 种祀序列的3-20引物对；W及
[0036] -容器B W及位于所述容器内的氧化石墨帰；和
[0037] 使用说明书。
[0038] 在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。
[0039] 在另一优选例中，所述的容器B包括多个反应管，并且每个反应管中放置了用于 一次多重聚合酶链式反应所需用量的氧化石墨帰。
[0040] 在另一优选例中，所述的容器B的体积为50、100、150、200、250、500或1000微升， 而所需用量的氧化石墨帰为100-500微克。
[0041] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
[0042] 一容器C W及位于所述容器内的测定所述多种祀序列的试剂或芯片。
[0043] 在另一优选例中，所述的祀序列包括DNA序列和RNA序列。
[0044] 在另一优选例中，所述的容器C