述n扩增物中 扩增产量最小的扩增产物的扩增量之比为2-20:1，较佳地3-10 ;1，更佳地为4-6 ;1(如约 5:1)。
[0089] 在另一优选例中，所述扩增产物包括分别对应于所述引物对的n种扩增产物， 且任意两个扩增产物的长度相差一定长度，例如长度之差> 3化P，较佳地>5化P (如 50-200bp，较佳地 50-lOObp)。
[0090] 在另一优选例中，所述各扩增产物的长度为50-20(K)bp，较佳地为100-1500bp，更 佳地为lOO-lOOObp，最佳地为200-500bp。
[0091] 试剂盒及其应用
[0092] 本发明还提供了一种用于多重聚合酶链式反应试剂盒，所述试剂盒包含：
[0093] 一容器A W及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多 种祀序列的3-20引物对；W及
[0094] -容器B W及位于所述容器内的氧化石墨帰；和
[0095] 使用说明书。
[0096] 在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。
[0097] 在另一优选例中，所述的容器B包括多个反应管，并且每个反应管中放置了用于 一次多重聚合酶链式反应所需用量的氧化石墨帰。
[0098] 在另一优选例中，所述的容器B的体积为50、100、150、200、250、500或1000微升， 而所需用量的氧化石墨帰为100-500微克。
[0099] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：
[0100] 一容器C W及位于所述容器内的测定所述多种祀序列的试剂或芯片。
[0101] 在另一优选例中，所述的祀序列包括DNA序列和RNA序列。
[0102] 在另一优选例中，所述的容器C中的试剂包括特异性与扩增产物结合的探针。
[0103] 在另一优选例中，所述试剂盒还含有用于检测扩增产物的试剂，所述的试剂包括 探针、和/或核酸芯片。
[0104] 用所述试剂盒进行多重聚合酶链式反应，不需要个引物对进行特殊的设计，也无 需进行容易导致污染的二次扩增，可W大大简化实验流程和降低交叉污染的风险。从而，建 立一种操作简单、廉价且具有广泛适用性的多重PCR。所述试剂盒还可进行多重聚合酶链式 反应检测针对某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好 发部位。
[0105] 本发明的主要优点在于：
[0106] (1)首次在多重PCR反应中提供氧化石墨帰作为优化剂和增强特性剂应用。
[0107] (2)在多重PCR反应中对于复杂模板只需低浓度即可扩增特异性产物。
[010引 （3)在多重PCR反应中引物对不需特殊设计。
[0109] (4)在多重PCR中只需优化一个条件就能同时得到特异性扩增产物。
[0110] (5)不需要特殊仪器、显著降低了成本。
[0111] (6)显著节省时间并提高产量。
[0112] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York = Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
[0113] 材料和方法
[0114] 下列实施例中试剂来源为；人类基因组模板购自Promega公司；Lambda DNA购自 大连宝生物公司；DNA聚合酶巧XTaq化tstart DNA聚合酶和Probest高保真DNA聚合酶） 购自大连宝生物公司；引物在Invetrogen公司合成；凝胶电泳图中的DNA marker值L 2000 和DNA ladder 5化P)购自大连宝生物公司；氧化氧化石墨帰购自南京先丰纳米材料科技 有限公司。
[0115] 实施例1 ;不同浓度的氧化石墨帰对人类基因组癌症基因多重扩增的影响 [011引 1.实验目的
[0117] W人类基因组为模板，对8个与癌症相关的基因（Shuichi化sWka，化i Chen, Nicole A. Leal, et al. Artificial Genetic Systems: Self-Avoiding DNA in PCR and Multiplexd PCR[J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 5554 - 5557)在一个 PCR 反应中进 行多重扩增。比较添加不同浓度的氧化石墨帰对多重PCR的影响。
[0118] 2.实验材料和方法
[0119] 待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度
[0120]
[0122] PCR溶液体系组成（25 y L):
[0124] PCR步骤和条件；（1) 95°C预变性5分钟；似95°C预变性1分钟，6(TC退火1分钟， 72 °C延伸1分钟30砂；重复40个循环；（3)68 °C延伸10分钟。
[0125] 电泳分析条件：琼脂糖凝胶电泳（3% )，电压；80V，电泳时间3-地。
[0126] 3.实验结果
[0127] 对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。M表示DNA marker, N表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照，C表示不加氧化石墨帰、加入模板的 阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨帰30、60、90、120、150、180、210、240和270ng 的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为；52bp、74bp、90bp、13Ap、152bp、17m3p、 336bp和55化P。从图1可见，在不添加氧化石墨帰的情况下，只有4个特异的目标条带可 W被检测到，同时存在其它非特异条带；随着氧化石墨帰的加入，多重PCR的特异性产物被 逐渐增强，且非特异产物逐渐被抑制，最终在加入240-27化g的石墨帰时结果最佳，得到8 条单一明亮的特异条带。
[0128] 送一结果说明，在多重PCR反应体系中添加适量的氧化石墨帰，有助于提高目标 产物的特异性和产量，同时有助于抑制非特异性的扩增。
[0129] 实施例2 ;氧化石墨帰对多重PCR灵敏度的提高
[0130] 1.实验目的
[013。 W人类基因组为模板，对8个与癌症相关的基因在一个PCR反应中进行多重扩增。 分别用不同浓度的模板进行扩增，比较未添加 GO和添加了适量的（250ng)氧化石墨帰的多 重PCR灵敏度。
[0132] 2.实验材料和方法
[0133] 待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度，同实施例1.
[0134] PCR溶液体系组成（25 y L):
[0135]
[0136] PCR步骤和条件；同实施例1 ;
[0137] 电泳分析条件：同实施例1。
[013引 3.实验结果
[0139] 对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。M表示DNA marker, Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照；A组表示不加氧化石墨帰的多重扩 增结果，其中A1-A4分别表示加入模板175ng、25ng、5ng和Ing的扩增结果；N2表示加入 氧化石墨帰、不加模板的阴性对照；B组表示加人25化g的多重扩增结果，其中B1-B4分别 表示加入模板175ng、25ng、5ng和Ing的扩增结果。图中从下向上产物长度依次为；5化P、 746口、9069、13化9、15269、17669、33669和55269。当不加入氧化石墨帰时，仅在模板量为 175ng时可W同时检测到8个目标条带，随着模板浓度的降低，多重PCR的特异性显著降低。 而在添加了 250ng的氧化石墨帰的多重反应体系中，当模板量仅为5ng时，各特异产物的条 带依然单一、明亮；甚至在模板量为Ing时，各目标产物的条带也可W在电泳中检测到，说 明在此例中多重PCR的灵敏度至少被提高了 25倍。此外，从图2可见，添加了氧化石墨帰 后，多重PCR的特异性和产量都有了明显的提高。
[0140] 实施例3 ;氧化石墨帰对多重PCR中非特异扩增的抑制W及多重PCR在不同退火 温度下的特异性
[0141] 1实验目的
[0142] W Lambda DNA为模板，W Lambda DNA为模板，用8个引物对同时对Lambda DNA 上8个不同的区域进行扩增。比较氧化石墨帰在各退火温度下对多重PCR特异性的增强效 果。
[0143] 2实验材料和方法
[0144] 用于扩增的引物序列、产物长度及被扩增区域
[0145]
[0147] PCR溶液体系组成（25 y L):
[0149] PCR步骤和条件；（1) 95°C预变性5分钟；似95°C预变性30砂分钟，在不同温度下 巧2、60、68、72 °C )退火1分钟30砂，72 °C延伸1分钟30砂；重复40个循环；（3)68 °C延伸 10分钟。
[0150] 3.实验结果
[0151] 对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中A、B两 组分别表示不加入氧化石墨帰和加入氧化石墨帰的多重PCR结果。当不加入氧化石墨帰的 多重PCR结果中（A组），各退火温度条件下均存在严重的非特异产物；当加入适量巧化g) 氧化石墨帰后，在各退火温度下多重PCR的非特异产物都被明显抑制，在退火温度为68度 时，8个目标产物都能成功扩增出来，且无任何非特异产物。此外，值得注意的是，两组阴性 对照（不加入模板DNA)的结果也有明显差别。当不加氧化石墨帰时（NI),阴性对照的结果 中有明显的引物二聚体和一系列非特异产物的条带；当加入氧化石墨帰后（N2)，引物二聚 体和非特异产物被明显抑制。说明氧化石墨帰能很好的抑制非特异扩增的进行。
[015引实施例4 ;氧化石墨帰对多重PCR扩增均一性的提高
[0153] 1.实验目的
[0154] W人类基因组为模板，对3个与癌症相关的基因在一个PCR反应中进行多重扩增。 分别用不同浓度的模板进行扩增，比较未添加 GO和添加了 50ng氧化石墨帰的多重PCR灵 敏度。
[01巧]2.实验材料和方法
[0156] 待扩增的癌症基因名称、引物序列及产物长度
[0157]
[0158] PCR溶液体系组成（25 y L):
[0159]
[0160]
[OW] PCR步骤和条件；（1)95°C预变性5分钟；似95°C预变性1分钟，6(TC退火1分钟， 72 °C延伸1分钟30砂；重复40个循环；