（3)68 °C延伸10分钟；
[0162] 电泳分析条件：同实施例1。
[0163] 3.实验结果
[0164] 对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。
[0165] M表示DNA marker, A组表示不加氧化石墨帰的多重扩增结果，B组表示加氧化石 墨帰巧化g)的多重扩增结果。Nl表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照；其中A1、A2 表示不加入GO的3重扩增结果；N2表示加入GO巧化g)但不加模板的阴性对照；BK B2组 表示加入50ng氧化石墨帰的3重扩增结果。图中从下向上产物长度依次为；176bp、203bp 和258bp。由图4A可见，在不加入氧化石墨帰的条件下进行多重PCR，引物间相互作用会抑 制特异产物的扩增，同时会产生非特异产物，导致扩增特异性降低、产量低；当加入氧化石 墨帰材料时（图4B)，特异性显著提高，3个特异产物在电泳图中均清晰可见，同时非特异扩 增被抑制。说明氧化石墨帰材料的加入有助于提高多重PCR的均衡性。
[0166] 实施例5 ;不同浓度的氧化石墨帰（GO)对Lambda DNA多重扩增的影响
[0167] 1.实验目的
[0168] W Lambda DNA为模板，对8个DNA片段在一个PCR反应中进行多重扩增。比较未 添加氧化石墨帰W及添加不同量氧化石墨帰的多重PCR效果。
[0169] 2.实验材料和方法
[0170] 用于扩增的引物序列及产物长度
[0173] PCR溶液体系组成（25 y L):
[0174]
[017引 PCR步骤和条件；（I) 95°c预变性5分钟；似95°C预变性I分钟，6(TC退火I分钟， 72C延伸1分钟30砂；重复40个循环；（3) 68C延伸10分钟；
[0176] 电泳分析条件：同实施例1。
[0177] 3.实验结果
[0178] 对多重PCR后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。M表示 DNA marker, N表示不加模板、不加氧化石墨帰的阴性对照，C表示不加氧化石墨帰、加入模 板的阳性对照。泳道1-9分别表示加入氧化石墨帰50、100、150、200、250、300、350、400和 450ng的多重PCR结果。图中从下向上产物长度依次为；ICUbp、162bp、202bp、323bp、524bp、 630bp、754bp和1046bp。从图5可见，在不添加氧化石墨帰的情况下，只有少数特异的目标 条带可W被检测到，同时存在其它非特异条带；随着氧化石墨帰的加入，多重PCR的特异性 逐渐增强，且非特异产物被逐渐抑制，最终在加入250-3(K)ng的氧化石墨帰时达到最佳结 果。得到8条单一明亮的特异条带。
[0179] 实施例6 ;氧化石墨帰对含有错配的引物的扩增优化
[0180] 实验目的：利用含有错配碱基的引物进行PCR，利用氧化石墨帰提高PCR的特异 性，说明氧化石墨帰对PCR特异性的增强作用。
[0181] 实验材料与方法：
[0182] 引物序列；正向引物分别含有0、1个错配，反向引物无错配
[0184] 实验材料
[0185] PCR溶液体系组成（25 ii L):
[018引 PCR步骤和条件；（1)95°C预变性5分钟；似95°C预变性30砂，55 °C退火30砂， 72 °C延伸30砂；重复40个循环；（3) 72 °C延伸5分钟；
[0189] 图6A为不含错配的引物的扩增结果，图6B为正向引物中含有一个错配碱基（红 色G)的扩增结果。每组1-4分别表示加入0、50、100、150ng氧化石墨帰（GO)。对于与模板 完全互补的引物的情况（图6A)，可W扩增出单一明亮的336bp条带；对于正向引物含有一 个错配的情况下（图6B)，在扩增产物中有明显的非特异条带（化b-2化处），随着氧化石墨 帰浓度的增加，非特异产物逐渐被抑制，当加入100-15化g的氧化石墨帰后，非特异产物被 完全抑制，同时目标产物（336bp)的扩增不受影响。
[0190] 实施例7 ;氧化石墨帰对短引物的扩增的优化
[01川实验目的；用于PCR的引物长度通常为18-25个碱基。理论上，引物的碱基数越 少，引物与模板DNA之间发生非特异配对的几率越高，PCR的特异性越差。当待扩增模板较 复杂时（如人类基因组DNA)，送种错配导致的非特异扩增更加明显。根据已有的实验结果 W文献报道，氧化石墨帰（GO)和还原的氧化石墨帰（RGO)可W提高PCR的特异性，但使用 短引物（15个碱基）的进行扩增依然是个难题。本实验的思路是，利用较短的引物（15个 碱基）进行单重PCR，并利用氧化石墨帰增强送种PCR的特异性，W说明氧化石墨帰能抑制 非特异扩增，增强特异性扩增和产量。
[0192] 实验材料和方法：
[0193] 引物序列：
[0194]
[0196] PCR步骤和条件；（I) 95°C预变性5分钟；似95°C预变性30砂，30~55°C退火30 砂，72 C延伸30砂；重复40个循环；（3) 72 C延伸5分钟；
[0197] PCR步骤和条件；（1)95°C预变性5分钟；似95°C预变性30砂，5(TC退火30砂， 72 °C延伸30砂；重复40个循环；（3) 72 °C延伸5分钟；
[019引 实验结果：
[0199] 从图7中AU BUCl可W看出，在不加入氧化石墨帰的条件下，使用短引物（15个 碱基）的PCR在各退火温度下的扩增结果中均出现多个非特异条带，而特异性条带几乎不 可见。送是因为引物缩短会导致引物与模板DNA发生非特异配对的几率增大，产生多个非 目标产物，导致PCR表现出极低的特异性。此外，图AUBUCl表明，仅通过调节退火温度均 不能有效提高PCR的特异性。为说明氧化石墨帰对PCR的特异性有显著增强的作用，我们 选择在退火温度为5(TC条件下进行氧化石墨帰优化的PCR实验（图A2、B2、C2)。从图中可 W看出氧化石墨帰浓度的增加对PCR特异性增强的明显趋势；随着PCR反应中氧化石墨帰 浓度的增加，非特异产物被逐渐抑制，同时目标产物亮度逐渐增强（图中白色箭头所示）。 送说明氧化石墨帰可W有效抑制引物与模板DNA之间的非特异配对、抑制非特异扩增，同 时增强对目标产物扩增的特异性和产量。
[0200] 实施例8 ;氧化石墨帰优化的多重PCR产物测序
[0201] 1.实验目的
[020引利用氧化石墨帰优化多重PCR，并将多重PCR的产物分别回收并测序，W检验被扩 增的条带为目标产物。
[0203] 2.实验材料和方法
[0204] 多重PCR实验条件同实施例1 ;
[020引 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Ki t Ver. 4. 0
[0206] TaKaRa ExTaq HotStart DNA 聚合酶
[0207] 3.实验结果
[020引将氧化石墨帰作为优化剂添加到多重PCR体系中，扩增产物在琼脂糖凝胶电泳下 分别切胶回收。切胶回收后的产物分别用其特异性的引物对进行二次扩增。二次扩增产物 在2%的琼脂糖凝胶电泳下检测（图8)。
[0209] 图8.切胶回收产物的二次扩增电泳检测图。从图8中可W看到，W切胶回收的各 产物为模板，使用特异的引物对都能扩增出单一的条带，送些条带的位置与W人类基因组 DNA为模板的阳性对照产物的位置抑制，说明二次扩增都得到了目标产物。此外，各组阴性 对照中都没有观察到污染条带，说明由二次扩增的产物来自于对回收产物的扩增。
[0210] 表 1
[0212] 从表1中可W进一步证明，将多重PCR产物分别切胶回收并二次扩增后的PCR产 物的序列与目标区域的序列一致。说明利用氧化石墨帰优化的多重PCR得到的产物均为目 标产物。
[0213] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括步骤： (A) 提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物 对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂； (B) 对上一步骤的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的 反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和 (C) 任选地，对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测， 其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。2. 如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，在适量氧化石墨烯存 在下，所述的多重聚合酶链式反应中以同样的退火温度或氧化石墨烯浓度在低拷贝模板的 条件下能扩增出全部特异性扩增产物。3. 如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，用于扩增的引物对包 括3-15个引物对，较佳地5-10对，更佳地6-9个引物对。4. 如权利要求1所述的多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，在所述反应体系中，待 扩增的模板的总量为〇. 5-100ng，较佳地l-50ng。5. -种用于多重聚合酶链式反应试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含： 一容器A以及位于所述容器内的用于在多重聚合酶链式反应进行特异性扩增多种靶 序列的3-20引物对；以及 一容器B以及位于所述容器内的氧化石墨烯；和 使用说明书。6. -种氧化石墨烯的用途，其特征在于，用于制备或用作提高多重聚合酶链式反应的 灵敏度和特异性的增强剂。
【专利摘要】本发明提供了一种多重聚合酶链式反应方法。该方法包括步骤：(A)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系含有待扩增的模板、用于扩增的引物对、聚合酶、氧化石墨烯和用于进行聚合酶链式反应所需的试剂；(B)进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和(C)对上一步骤中的反应混合物进行电泳和/或测序检测。本发明方法可在含低拷贝量复杂模板的、极易产生非特异性扩增的多重PCR反应体系中，非常高效而准确地扩增出全部特异性扩增产物。本发明方法可广泛用于各种不同的检测领域。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105603055
【申请号】CN201410664724
【发明人】张琛, 张东华, 张益 , 胡钧
【申请人】中国科学院上海应用物理研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2014年11月19日