用于核酸检测的荧光定量pcr方法及其试剂盒的制作方法

专利名称：用于核酸检测的荧光定量pcr方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于核酸检测的PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)以及用于该方法的试剂盒。具体地说，本发明涉及用于核酸检测的荧光定量PCR方法及其试剂盒。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是基于DNA体外扩增技术来检测痕量、微量核酸的方法，已被广泛用于核酸的检测分析和遗传学测试[参见Bevan et.al,PCR methods andApplications,1:222-228,(1992)]。通过PCR过程，可以准确检出临床样本中与疾病相关的痕量DNA/RNA的存在，明确检查出致病原因，从而指导临床诊断和治疗。进一步的定量PCR结果，则可以更详细的监测临床样本中与疾病相关的痕量DNA/RNA的数量及其变化，对于临床治疗方案的选择、疗效考核有极大的指导意义，尤其适合许多源于DNA/RNA数量变化的疾病的检测和治疗。
PCR方法采用一对人工合成的寡聚核苷酸引物及dNTPs为原料，在体外模拟DNA的体外复制过程，用耐高温的DNA聚合酶经多次循环，扩增模板DNA。可以将目的DNA的量扩增106～107倍，再将产物在琼脂糖凝胶上电泳，以溴乙锭(EB)染色体而显示结果。此方法具有灵敏、迅速、准确、方便等特点。但它也有相应的不足，主要可归结为3点(1)只有定性结果，无法给出临床需要的定量结果；(2)由于采用电泳检测，易引起PCR产物的交叉污染，增加了假阳性结果的可能性；(3)采用的染色剂溴乙锭是强烈致癌物，可能危害操作人员及污染环境。
经过研究和改进常规PCR方法，又产生了实时定量荧光PCR方法(参见Kenneth J.Lival et al,U.S patent 5,538,848)。该技术在常规PCR基础上，添加了一条荧光标记的探针。探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变，当有特异性PCR扩增发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧光信号的增长(见图1)。荧光信号伴随着PCR的过程的进行，PCR产物的增长而增长。实时定量荧光PCR方法就是利用此原理，在PCR过程中，连续不断地检测反应体系中的荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(Ct值)就被记录下来，该循环参数和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系[参见Higuchi etal,Biotechkology,11:1026-1030(1993)]，根据循环参数Ct值就可以准确定出起始DNA的数量。实际使用时，是将含有荧光探针和从标本中提取的核酸样品的PCR反应管放入PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，启动PCR循环过程和荧光检测功能，后者在仪器中透过样品管盖(Eppendoff管盖)直接实现闭管检测。反应结束后，仪器将自动分析检出样品的Ct值；同时平行测定阳性梯度标准品的Ct值，用这些值制成标准曲线，再由样品的Ct值，可在标准曲线上查出相应的起始DNA量。本方法由于采用荧光技术和闭管检测，完全克服了前述常规PCR方法的3个主要缺点。但出于实时连续检测的需要，技术中必须采用昂贵的PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，如美国Perkin Elmer公司的7700型Sequence Detector，价格高达10万美元。这种情况限制了实时定量荧光PCR方法在临床诊断中的大规模应用。
本发明的目的是为了克服上述已有荧光PCR检测方法实施费用高，使用仪器昂贵的缺点，提供一种简便、价廉、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。
本发明的荧光PCR方法包括如下步骤a、根据待检测靶基因的特异性核酸序列合成一对引物。引物相互之间最好至少相距30个碱基；b、根据待检测靶基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列设计、合成一个荧光探针；c、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系，其中镁离子的浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应；d、从待测标本中提取DNA，或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入步骤c中的反应体系中，经离心混合后测定反应前荧光值；e、将反应管放入PCR仪进行20～50次循环的PCR反应；反应结束后再测定一次反应管中的荧光值；前后两次测值的差值即代表了本管反应的荧光增值；f、同时用系列阳性和阴性模板也进行步骤d的核酸提取和PCR反应，测得各自相应的荧光增值，将荧光增值相对于阳性模板的初始核酸量的自然对数值作图，制成标准曲线；g、用上述e步骤中获得的各样品的荧光增值，可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。
在本发明的方法中，靶基因的特异性核酸序列是指仅存在于该靶基因中的核酸序列。该核酸序列的存在与所述靶基因的存在之间是具有一一对应的关系。
本发明方法的PCR反应体系与常规PCR反应体系类似，包括高温聚合酶，核酸提取试剂，荧光PCR反应液，阳性模板系列，阴性模板和覆盖剂等。参见Bevan等的上述文献。
高温聚合酶是指具有3’→5’DNA聚合酶活性、5’→3’DNA外切核酸活性和可耐受高温的聚合酶。所述的高温聚合酶最好是95℃半衰期＞45分钟的高温聚合酶。
荧光PCR反应液是含dNTPs，缓冲体系，PCR扩增引物和荧光探针的体系。
所述的PCR扩增引物是经过设计，特异性针对某一待测核酸序列的特征序列的引物，长度15～40碱基(bases)，最好是18～25碱基(bases)。
所述的荧光探针是标记了两个荧光基团的DNA探针，其中一个标记在探针的5’端，另一个荧光基因和它的相距7bases或以上，两者可构成能量传递结构，即5’端荧光基因所发出的荧光可被另一荧光基因吸收或抑制。探针的3’端羟基(-OH)已被去除或封闭，不具有延伸能力；长度为15～50bases；最好是18～35bases。
所述的缓冲液体系是由pH=5.0～10.0之间的稳定缓冲对，Mg离子和其它促进反应的离子组成，pH值最适选择是PH=7.0～9.0。
阳性模板系列，是指予先经过数量标定的阳性质控标准品。阳性模板的最好是含有已知数量目的基因的临床标本；阳性模板的另一选择是经过提取、纯化，预先测定好数量的核酸标本；阳性模板的再一选择是经过基因工程克隆、纯化和定量的目的基因。
阴性模板是指阴性质控制标准品。阴性模板的较好选择是经过确证为阴性的临床标本；阴性模板的另一选择是经过提取、纯化、并经确证为阴性的核酸标本；阴性模板的再一选择是纯净H2O。
在反应体系上最好用覆盖剂覆盖。覆盖剂是指用于覆盖于反应体系液面，防止蒸发，与水不相溶的油性覆盖剂。较好选择是固体或液体石蜡。
本发明中，PCR反应最好是二步法PCR，包括变性和退火/延伸两步。变性的温度是85℃～99℃，时间10秒～300秒；退火/延伸的温度是37℃～75℃，时间是10秒～600秒，循环次数是15～60次。最好是变性温度89℃～95℃，时间20秒～120秒；退火延伸的温度50℃～70℃，时间30秒～200秒，循环次数30～50次。
本发明中，荧光激光光是采用单色光，波长λ=300～700nm，检测波长λ=350～800nm。荧光激发光较好的波长λ=450～600nm，检测波长λ=480～650nm。
本发明中，可定量的核酸起始拷贝数范围为1～1011拷贝/ml。可定量的核酸起始拷贝数较好的范围为103～109拷贝/ml。
本发明还提供了一种用于荧光定量PCR方法的试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测核酸的特异性序列设计的PCR引物和荧光引物，其中该荧光PCR反应液中镁离子的浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应。
本发明的试剂盒的另一使用方法，是用核酸提取试剂从临床标本中提取核酸(如果是RNA标本，须经过逆转录，转成cDNA)，加入一管荧光PCR反应液中，再加入高温聚合酶，覆盖剂等，经离心混合后，放入PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，开始PCR过程并进行实时荧光检测，测定信号达到检测设定阀值时的循环参数Ct；同时用系列阳性和阴性模板Ct测值为纵坐标，阳性模板的初始核酸量的自然对数值为横坐标，制成标准曲线，即可从标准曲线上查得样品的起始拷贝数。
本试剂盒是针对临床疾病进行的特异性设计，是根据已知的疾病特异性基因系列，经过基因库检索、分析和设计，选择了特异、高效的目的基因片段作为扩增、检测对象，并在其中选择了一对PCR引物和一条荧光探针，探针位于一对PCR引物之间。
本发明提供了一种用于淋球菌检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 GCTACGCATA CCCGCGTTGC TTTGCTGTTC TCGACTGGGC AATTTTCCAG51 TGTCAAACCT TTGGTCTTGG TTTCCAACAG GTCTAGGGTG CGCTCTGCTT101 CGGCTCTCTG CTGTTTCAAG TCGTCCAGCT CGTTCTTGAC GCTCCATATC151 GCTATGAACA GCCCTGCTAT GACTATCAAC CCTGCCGCCG ATATACCTAG201 CAAGCTCCAC AGATAGGGCT TGAATACTGC CTTGCTCATG CGTAACTGCC251 GGGCGTTTAT ATCGGCGGTT ATTTTCTGCT CGCTTTGCTT CAATGCCTCG301 TTGATATTTT TCCGTAACGT CTCTAAGTCT GCTTTCGTTT GTTGCTCTAT351 GCTGGCGGCT TCGGTGCGTG ATGTCTGCTC GAAGGTCTTC G其中，引物序列最好为PNG1:5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3’20bpsPNG2:5’CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3’20bps荧光探针序列最好为FPNG:5’CAA GTC GTC CAG CTC GTT CTT GAC 3’24bps本发明提供了一种用于乙肝病毒检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 ATCCTGCTGC TATGCCTCAT CTTCTTGTTG GTTCTTCTGG ACTATCAAGG51 TATGTTGCCC GTTTGTCCTC TAATTCCAGG TACTTCAACA ACCAGCACGG101 GACCATGCAG AACCTGCACG ACTCCTGCTC AAGGAACCTC TATGTATCCC151 TCCTGTTGCT GTACCAAACC TTCGGACGGA AATTGCACCT GTATTCCCAT201 CCCATCATCT TGGGCTTTCG GAAAATTCCT ATGGCAGTGG GCCTCAGCCC251 GTTTCTCCTG GCTCAGTTTA CTAGTGCCAT TTGTTCAGTG GTTCGTAGGG301 CTTTCCCCCA CTGT其中，引物序列最好为PHBV1:5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3’,23bpsPHBV2:5’ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3’,23bps荧光探针序列最好为FPHBV:5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3’,25bps本发明提供了一种用于丙肝病毒检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 CTTCACGCAG AAAGCGTCTA GCCATGGCGT TAGTATGAGT GTCGTGCAGC51 CTCCAGGACC CCCCCTCCCG GGAGAGCCAT AGTGGTCTGC GGAACCGGTG101 AGTACACCGG AATTGCCAGG ACGACCGGGT CCTTTCTTGG ATCAACCCGC151 TCAATGCCTG GAGATTTGGG CGTGCCCCCG CGAGACTGCT AGCCGAGTAG201 TGTTGGGTCG CGAAAGGCCT TGTGGTACTG CCTGATAGGG TGCTTGCGAG251 TGCCCCGGGA GGTCTCGTAG A其中，引物序列最好为PHCV1:5’CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGC,22bpsPHCV2:5’TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC,22bps荧光探针序列最好为FPHCV:5’GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAAC,24bps本发明提供了一种用于沙眼衣原体检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 CGATGATTTG AGCGTGTGTA GCGCTGAAGA AAATTTGAGC AATTTCATTT51 TCCGCTCGTT TAATGAGTAC AATGAAAATC CATTGCGTAG ATCTCCGTTT101 CTATTGCTTG AGCGTATAAA GGGAAGGCTT GATAGTGCTA TAGCAAAGAC151 TTTTTCTATT CGCAGCGCTA GAGGCCGGTC TATTTATGAT ATATTCTCAC201 AGTCAGAAAT TGGAGTGCTG GCTCGTAT其中，引物序列最好为PCT1:5’CGA TGA TTT GAG CGT GTG TAG CG 3’23bpsPCT2:5’ATA CGA GCC AGC ACT CCA ATT TC 3’23bps荧光探针序列最好为FPCT:5’TGA GCA ATT TCA TTT TCC GCT CG 3’23bps本发明提供了一种用于解脲支原体检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 TTTATAAGGA GATAATGATT ATATGTCAGG ATCATCAAAT CAATTCACTC51 CAGGTAAATT AGTACCAGGA GCAATTAACT TCGCTGAAGG CGAAAATGTG101 ATGAACGAAG GTAGAGAAGC AAAAGTAATC AGCATTAAAA ATACTGGTGA151 CCGTCCTATC CAAGTTGGAT CACATTTGCA CTTATTTGAA ACAAATAGTG201 CATTAGTATT CTTTGATGAA AAAGGAAACG AAGACAAAGA ACGTAAAGTT251 GCTTATGGAC GTCGTTTCGA TATTCTC其中，引物序列最好为PUU1:5’TTATAAGGAGATAATGATTATGTG,25bpsPUU2:5’GAGAATATCGAAACGACGTCCAT,24bps荧光探针序列最好为FPUU:5’GGTAGAGAAGCAAAAGTAATCAGCA,25bps本发明提供了一种用于结核杆菌检测的试剂盒，其PCR引物和荧光引物是根据下述特异性序列设计的1 TCGCCCGTCT ACTTGGTGTT GCTGCGCGGA GACGGTGCGT AAGTGGGTGC51 GCCAGGCGCA GGTCGATGCC GGCGCACGGC CCGGGACCAC GACCGAAGAA101 TCCGCTGAGA TAAAGCGCTT GCGGCGGGAC AACGCCGAAT TGCGAAGGGC151 GAACGCGATT TTAAAGACCG CGTCGGCTTT CTTCGCGGCC GAGCTCGACC201 GGCCAGCACG CTAATTACCC GGTTCATCGC CGATCATCAG GGCCACCGCG251 AGGGCCCCGA TGGTTTGCGG TGGGGTGTCG AGTCGATCTG CACACAGCTG301 ACCGAGCTGG GTGTGCCGAT CGCCCCATCG ACCTACTACG ACCACATCA其中，引物序列最好为PTB1:5’TCGCCCGTCTACTTGGTGTT 3’20个碱基PTB2:5’TGATGTGGTCGTAGTAGGTC 3’20个碱基荧光探针序列最好为FPTB:5’ACA ACG CCG AAT TGC GAA GGG C 3’22bps本发明是使用一套经过优化改进的试剂，组成PCR试剂盒。经改进的试剂配方，具有更强的PCR扩增能力和更高的扩增效率。在较宽的起始模板浓度范围内(拷贝数0-109/毫升)起始模板和产物的量可以保持良好的相关性，有利于实现准确的PCR定量。该试剂盒可以对目的核酸序列进行特异性的体外扩增(PCR)，放大目的核酸，直至可以被检出。同时又具有可检测的荧光信号，可以用于核酸定量和定性检测；此外，本试剂盒可以使用常规的荧光检测仪，在PCR反应开始前和PCR反应结束之后各测定一次荧光，即可经计算，得出定量或定性的结果；本试剂盒也可以使用自动化的PCR-荧光检测-电脑分析一体化仪器，经过连续实时检测而得到定量结果；再者，本试剂盒系针对临床疾病诊断而设计，具有特异、灵敏、准确、抗污染、快速等特点。
使用本试剂盒的有益效果是，可以准确、快速、特异、方便地检测出临床疾病相关的特异性核酸序列。准确定量范围为0-109拷贝/毫升，误差＜300％。抗污染性强，对仪器设备的要求低，适用于在各级医疗、科研机构推广应用。


图1是显示荧光PCR的原理的图，R荧光报告基团；Q荧光淬灭基团。其中(1)5′→3′外切核酸酶活性用于荧光定量PCR的Taq酶不仅有延伸DNA引物的活性(DNA聚合酶活性)，还有5′→3′外切核酸酶活性，可以在链延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。(2)荧光标记引物这条探针的5′端和3′端分别标记了一个特殊基团，5′端的基团称为荧光指示基团(R),3′端的基团称为荧光抑制基团(Q)。当这条探针保持完整时，Q基团将抑制R基团的荧光信号，一旦探针被切断，抑制作用消失，R基团的荧光信号就可以被检测到。(3)荧光PCR反应的实现上述荧光标记探针根据碱基配对原理与扩增产物核酸序列结合。PCR反应开始后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥它的5′→3′外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出R基团的荧光信号。被释放的游离R基团的数目和PCR产物的数量是一对一的关系，因此R基团的荧光信号强弱就与PCR产物数量成正比关系，测量出前者就可以推算出后者。这就是荧光定量PCR的原理。图2是实施例1中的荧光PCR定量标准曲线，1g(起始拷贝)。实施例实施例1-乙型肝炎病毒(HBV)荧光定量PCR检测及其试剂盒1、乙肝病毒荧光定量PCR诊断试剂盒的组成选用的引物和荧光探针设计在乙肝病毒基因中的保守区，只对乙肝病毒特异，和其它物种无交叉反应。荧光探针位于一对引物之间的区域。引物序列为PHBV1:5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3’,23bpsPHBV2:5’ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3’,23bps荧光探针序列为FPHBV:5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3’,25bpsPCR扩增区的DNA序列位于HBV基因S区，为一段编码区。在EMBL的HBV DNA序列的第412-725位，全长314bps，为单拷贝基因序列。
试剂盒的配制过程如下配制5XPCR反应液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM MgCl2、250mM KCl、1mg/ml明胶)，再配成HBV-PCR反应液每人份反应液引物PHBV1,PHBV2(25pmol/μl) 各0.4μl荧光探针FPHBV(20pmol/μl)0.5μldNTPs(2mM) 5μlTaq酶(10单位)5μl5×PCR反应缓冲液 10μlddH2029.1μl总量 50μl配制DNA裂解液(50mM NaOH、10mM Tris-HC1(pH8.0)、1％Triton X-100、1％NP-40,0.5mM EDTA(pH8.0))阴性质控标准品的制备取HBV阴性献血员的血清，经乙肝两对半免疫测定，各项指标均为阴性；用PHBV1和PHBV2做HBV PCR检查也为阴性。
阳性质控标准品的制备采用HBV病人强阳性血清，经定值血清标准品(100pg/ml)(中国药品生物制品检定所)标定和系列稀释而获得阳性质控标准品。2、使用乙肝病毒荧光定量PCR诊断试剂盒进行检测用无菌注射器抽取受检者静脉血1毫升，注入无菌1.5ml Eppendoff管，于室温静置2小时，转入4℃静置1小时。8,000rpm离心5分钟，吸取200μl血清(注意勿带入红细胞)转入另一无菌1.5ml Eppendoff管，即为血清标本。标本和质控标准品的处理取血清标本40μl，加等量DNA提取液打匀。沸水浴10分钟，转至4℃静置24小时以保证病毒颗粒充分裂解。10,000rpm离心5分钟，取上清液2μl做PCR反应。另取阳性定量质控标准品和阴阳性定量质控标准品各10μl，同上处理。PCR反应前荧光检测取Taq酶一管，加入PCR反应液45μl，处理后样品或定量质控标准品2μl，混匀，加30μl石蜡油(如所使用的PCR仪有热盖装置，可不加)，离心数秒。将该管放入荧光检测仪，读取并记录读数A0。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。PCR扩增将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增93℃→2分钟预变性，然后按93℃45秒→55℃120秒，共做40个循环。PCR反应后荧光检测检测待各PCR管充分冷却至室温后，将扩增后的反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A1。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。计算AX=A1-A0定性结果判定样品Ax＞N*1.3，判为阳性，否则为阴性。定量计算以定量阳性质控管的DNA数量(fg)的对数值加1为横坐标(例4fg/μ1的对数为lg4=0.602，该管横坐标即为1+lg4=1.602；阴性质控管的横坐标定为0)，相应的Ax为纵坐标，用直线联接各定量阳性质控管的数据点，构成标准曲线(图2)。样品的Ax若＜N*1.3，则判为阴性；否则以它的Ax值在标准曲线上查出相应横坐标值C，样品的HBV DNA含量(fg/ml)=1000*10(C-1)标本由确诊或怀疑乙肝的病人中采取。包括急诊病人172例，长期携带者83例，治疗恢复期患者102例，注射过疫苗获免疫者31例，肝癌患者37例，无症状体检者61例和健康献血员21例，其它25例。总病例数达到532例。
定量结果采用求算对数平均值的方法来计算平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。
乙肝病毒荧光定量PCR检测试剂盒临床应用总结如下(1)ELISA法共检出HBsAg阳性标本317例，阳性率为59.6％；PCR共检出310例阳性，阳性率为58.3％。(2)在158例乙肝免疫指标大三阳(HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+)的标本中，PCR全部阳性，表明试剂盒用于大三阳诊断的假阴性率为0；在107例乙肝免疫指标全阴性的标本中，PCR全部阴性，表明试剂盒的假阳性率为0。(3)在98例乙肝免疫指标小三阳(HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+)的标本中，PCR阳性71例，阳性率73％。与国内外报道的肝组织活检阳性率(70％～80％)一致，大大高于普通PCR的30％的阳性率。证明本试剂盒的灵敏度相当高。(4)乙肝免疫指标大三阳(HBsAg+/HBeAg+/HBcAb+)(标志感染期)的标本中，PCR定量的平均拷贝数为1.1×108；(HBsAg+/HBeAg+/HBeAb+/HBcAb+)(标志感染后期)的标本，平均为2.8×107；(HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+)(标志长期携带)的标本，平均为8.6×105；(HBsAb+/HBeAb+/HBcAb+)(标志恢复期)的标本，平均为2.3×105。各组之间差异显著，表明定量PCR可以清楚反映乙肝患者的病程变化情况。进而可以用于临床诊断，治疗方案选择和疗效监控。具有很高的临床应用价值。实施例2-人类结核杆菌(TB)荧光PCR检测试剂盒试剂盒的制备引物序列为PTB1:5’TCGCCCGTCTACTTGGTGTT 3’20个碱基PTB2:5’TGATGTGGTCGTAGTAGGTC 3’20个碱基荧光探针序列为FPTB:5’ACA ACG CCG AAT TGC GAA GGG C 3’22bpsPCR扩增区的DNA序列位于TB的IS986基因区。在EMBL的MITS986序列的第176-524位，全长349bps，为多拷贝基因序列。试剂盒的其它成分如实施例1。
标本来自临床确诊或拟诊结核病患者的标本，总病例数达到755例，其中127例为非结核对照标本。
对照诊断标准采用改良罗氏培养法和金胺荧光染液涂片检查法。
结核杆菌荧光PCR检测试剂盒临床应用总结如下荧光PCR法的阳性率为72.3％(454/628)，明显高于培养法31.4％(126/401)和涂片法19.9％(125/628)，统计学处理有显著差异(P(0.01)。
在126例培养阳性的标本中，PCR全部阳性，二者符合率为100％；在127例非结核对照标本中，PCR和培养及涂片全部阴性，表明试剂盒假阳性/假阴性率为0。实施例3-淋球菌(NG)荧光PCR检测试剂盒试剂盒的制备引物序列为PNG1:5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3’ 20bpsPNG2:5’CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3’20bps荧光探针序列为FPNG:5’CAA GTC GTC CAG CTC GTT CTT GAC 3’24bpsPCR扩增区的DNA序列位于NG的cppB基因区。在EMBL的序列的第3141-3531位，全长391bps，为多拷贝基因序列。试剂盒的其它成分如实施例1。
标本来自临床确诊或拟诊淋病患者的标本，总病例数达到543例，其中20例淋病确诊患者标本。
对照诊断标准为培养法用血液琼脂培养基培养、分离、鉴定，并做氧化酶试验。
淋球菌荧光PCR检测试剂盒临床应用总结如下(1)荧光PCR法的阳性率为65.6％(343/523)，明显高于培养法40.7％(213/523))，统计学处理有显著差异(P(0.01)。(2)在20例确诊淋病患者中，荧光PCR全部阳性，二者符合率为100％，而培养法阳性率为70％(14/20)，符合率为70％。实施例4-沙眼衣原体(CT)荧光PCR检测试剂盒试剂盒的制备引物序列为PCT1:5’CGA TGA TTT GAG CGT GTG TAG CG 3’23bpsPCT2:5’ATA CGA GCC AGC ACT CCA ATT TC 3’23bps荧光探针序列最好为FPCT:5’TGA GCA ATT TCA TTT TCC GCT CG 3’23bpsPCR扩增区的DNA序列位于沙眼衣原体质粒pCTT1基因序列(EMBLCTORF)1900-2127位，荧光探针FPCT位于1935-1957位。全长228bps，为多拷贝基因序列。其它如实施例1。
应用中山医科大学达安基因诊断中心研制的沙眼衣原体荧光PCR诊断试剂盒，对132例沙眼衣原体病人的临床标本进行荧光PCR检测，并同时进行沙眼衣原体培养检查，结果显示荧光PCR检测法的阳性率为51.5％(68/132)，培养法的阳性率为24.2％(32/132)。
表临床标本沙眼衣原体检测结果例数 阳性例数阳性率PCR法检测13268 51.5％CT培养 13232 24.2％荧光PCR法与培养结果比较在132例培养标本中，荧光PCR阳性为68例，阳性率为51.5％，其中32例培养阳性的标本，荧光PCR全部为阳性，二者的符合率为100％。在100例CT培养阴性的标本中，荧光PCR法阳性34例。
我们对10份阳性样本和10份阴性样本重复进行PCR检测2次，结果重复性达100％，标明试剂盒的重复性和稳定性较好。
以上结果说明，荧光PCR检测临床标本中沙眼衣原体，阳性检出率明显高于培养法，与临床符合率高，且具有简便快速的优点。实施例5-解脲支原体(UU)荧光PCR检测试剂盒试剂盒的制备引物序列为PUU1:5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3’20bpsPUU2:5’CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3’20bps荧光探针序列为FPUU:5’CAA GTC GTC CAG CTC GTT CTT GAC 3’24bpsPCR扩增区的DNA序列位于解脲支原体基因序列(EMBL UULOCAB)1-277位，荧光探针FPUU位于135-159位。全长277bps，为多拷贝基因序列。其它如实施例1。
应用中山医科大学达安基因诊断中心研制的解脲支原体(UU)荧光PCR诊断试剂盒，对128例我院妇产科门诊患者进行解脲支原体检测，同时用细胞进行培养，结果如下128例女性生殖道UU检测报告总例数 阳性数阳性率荧光PCR检测128 51 39.9％UU培养 128 21 16.4％解脲支原体是女性生殖道常见的病原体。对UU的检测，WHO推荐为细胞培养，但由于对UU的培养需要一定的条件和耗时长，不能满足对性传播疾病的早期快速诊断。我们采用中山医科大学达安基因诊断中心研制的解脲支原体荧光PCR诊断试剂盒，对128例高危人群检测结果提示，解脲支原体荧光PCR诊断试剂的特异性和敏感性均高于培养法。实施例6-丙型肝炎病毒(HCV)荧光PCR检测试剂盒丙肝病毒荧光PCR诊断试剂盒的组成选用的引物和荧光探针设计在丙肝病毒基因中的保守区，只对丙肝病毒特异，和其它物种无交叉反应。荧光探针位于一对引物之间的区域。引物序列为PHCV1:5’CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGC,22bpsPHCV2:5’TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC,22bps荧光探针序列最好为FPHCV:5’GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAAC,24bpsPCR扩增区的DNA序列位于HBV基因5’非翻译区。在EMBL的HCV DNA序列(EMBL S38204)的第62-332位，全长271bps，为单拷贝基因序列。
应用中山医科大学达安基因诊断中心研制的HCV荧光PCR诊断试剂盒，对188例我院门诊患者和住院病人进行HCV检测，同时用ELISA检测抗HCV抗体作为对照观察，PCR法阳性率为25％,ELISA法阳性率为22％。结果如下荧光PCR合计+ -ELISA+ 383 41ELISA- 9 138147合计 47141188
权利要求
1.一种荧光定量PCR方法，包括以下步骤a、根据待检测靶基因的特异性核酸序列合成一对引物；b、根据待检测靶基因的特异性核酸序列中位于两个引物之间的序列设计、合成一个荧光探针；c、使用步骤a中的引物和步骤b中的荧光探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系，其中镁离子的浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应；d、从待测标本中提取DNA，或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入步骤c中的反应体系中，经离心混合后测定反应前荧光值；e、将反应管放入PCR仪进行20～50次循环的PCR反应；反应结束后再测定一次反应管中的荧光值；前后两次测值的差值即代表了本管反应的荧光增值；f、同时用系列阳性和阴性模板也进行步骤d的核酸提取和PCR反应，测得各自相应的荧光增值，将荧光增值相对于阳性模板的初始核酸量的自然对数值作图，制成标准曲线；g、用上述e步骤中获得的各样品的荧光增值，可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的两个引物之间相距50～500个碱基。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中所述的PCR反应进行30～50个循环。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中所述的PCR反应进行40个循环。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物的长度是16～25个碱基。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的荧光探针的长度是18～35个碱基。
7.一种用于荧光定量PCR方法的试剂盒，它包括DNA聚合酶，荧光PCR反应液，阳性模板，阴性模板，以及根据待测核酸的特异性核酸序列设计的PCR引物和荧光引物，其特征在于，该荧光PCR反应液中镁离子的终浓度为15-20mM,Taq酶用量为8-10单位/反应。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为淋球菌DNA，所述的特异性核酸序列为1 GCTACGCATA CCCGCGTTGC TTTGCTGTTC TCGACTGGGC AATTTTCCAG51 TGTCAAACCT TTGGTCTTGG TTTCCAACAG GTCTAGGGTG CGCTCTGCTT101 CGGCTCTCTG CTGTTTCAAG TCGTCCAGCT CGTTCTTGAC GCTCCATATC151 GCTATGAACA GCCCTGCTAT GACTATCAAC CCTGCCGCCG ATATACCTAG201 CAAGCTCCAC AGATAGGGCT TGAATACTGC CTTGCTCATG CGTAACTGCC251 GGGCGTTTAT ATCGGCGGTT ATTTTCTGCT CGCTTTGCTT CAATGCCTCG301 TTGATATTTT TCCGTAACGT CTCTAAGTCT GCTTTCGTTT GTTGCTCTAT351 GCTGGCGGCT TCGGTGCGTG ATGTCTGCTC GAAGGTCTTC G
9.按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3’引物2:5’CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3’
10.按照权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’CAA GTC GTC CAG CTC GTT CTT GAC 3’。
11.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为乙肝病毒DNA，所述的特异性核酸序列为1 ATCCTGCTGC TATGCCTCAT CTTCTTGTTG GTTCTTCTGG ACTATCAAGG51 TATGTTGCCC GTTTGTCCTC TAATTCCAGG TACTTCAACA ACCAGCACGG101 GACCATGCAG AACCTGCACG ACTCCTGCTC AAGGAACCTC TATGTATCCC151 TCCTGTTGCT GTACCAAACC TTCGGACGGA AATTGCACCT GTATTCCCAT201 CCCATCATCT TGGGCTTTCG GAAAATTCCT ATGGCAGTGG GCCTCAGCCC251 GTTTCTCCTG GCTCAGTTTA CTAGTGCCAT TTGTTCAGTG GTTCGTAGGG301 CTTTCCCCCA CTGT
12.按照权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3’，引物2:5’ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA 3’。
13.按照权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG 3’。
14.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为丙肝病毒DNA，所述的特异性核酸序列为1 CTTCACGCAG AAAGCGTCTA GCCATGGCGT TAGTATGAGT GTCGTGCAGC51 CTCCAGGACC CCCCCTCCCG GGAGAGCCAT AGTGGTCTGC GGAACCGGTG101 AGTACACCGG AATTGCCAGG ACGACCGGGT CCTTTCTTGG ATCAACCCGC151 TCAATGCCTG GAGATTTGGG CGTGCCCCCG CGAGACTGCT AGCCGAGTAG201 TGTTGGGTCG CGAAAGGCCT TGTGGTACTG CCTGATAGGG TGCTTGCGAG251 TGCCCCGGGA GGTCTCGTAG A
15.按照权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’CTTCACGCAGAAAGCGTCTAGC，引物2:5’TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC。
16.按照权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’GAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAAC。
17.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为沙眼衣原体DNA，所述的特异性核酸序列为1 CGATGATTTG AGCGTGTGTA GCGCTGAAGA AAATTTGAGC AATTTCATTT51 TCCGCTCGTT TAATGAGTAC AATGAAAATC CATTGCGTAG ATCTCCGTTT101 CTATTGCTTG AGCGTATAAA GGGAAGGCTT GATAGTGCTA TAGCAAAGAC151 TTTTTCTATT CGCAGCGCTA GAGGCCGGTC TATTTATGATAT ATATTCTCAC201 AGTCAGAAAT TGGAGTGCTG GCTCGTAT
18.按照权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’CGA TGA TTT GAG CGT GTG TAG CG 3’，引物2:5’ATA CGA GCC AGC ACT CCA ATT TC 3’。
19.按照权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’TGA GCA ATT TCA TTT TCC GCT CG 3’。
20.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为解脲支原体DNA，所述的特异性核酸序列为1 TTTATAAGGA GATAATGATT ATATGTCAGG ATCATCAAAT CAATTCACTC51 CAGGTAAATT AGTACCAGGA GCAATTAACT TCGCTGAAGG CGAAAATGTG101 ATGAACGAAG GTAGAGAAGC AAAAGTAATC AGCATTAAAA ATACTGGTGA151 CCGTCCTATC CAAGTTGGAT CACATTTGCA CTTATTTGAA ACAAATAGTG201 CATTAGTATT CTTTGATGAA AAAGGAAACG AAGACAAAGA ACGTAAAGTT251 GCTTATGGAC GTCGTTTCGA TATTCTC 。
21.按照权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’TTATAAGGAGATAATGATTATGTG，引物2:5’GAGAATATCGAAACGACGTCCAT。
22.按照权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’GGTAGAGAAGCAAAAGTAATCAGCA。
23.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测核酸为结核杆菌DNA，所述的特异性核酸序列为1 TCGCCCGTCT ACTTGGTGTT GCTGCGCGGA GACGGTGCGT AAGTGGGTGC51 GCCAGGCGCA GGTCGATGCC GGCGCACGGC CCGGGACCAC GACCGAAGAA101 TCCGCTGAGA TAAAGCGCTT GCGGCGGGAC AACGCCGAAT TGCGAAGGGC151 GAACGCGATT TTAAAGACCG CGTCGGCTTT CTTCGCGGCC GAGCTCGACC201 GGCCAGCACG CTAATTACCC GGTTCATCGC CGATCATCAG GGCCACCGCG251 AGGGCCCCGA TGGTTTGCGG TGGGGTGTCG AGTCGATCTG CACACAGCTG301 ACCGAGCTGG GTGTGCCGAT CGCCCCATCG ACCTACTACG ACCACATCA
24.按照权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物序列为引物1:5’TCGCCCGTCTACTTGGTGTT 3’，引物2:5’TGATGTGGTCGTAGTAGGTC 3’。
25.按照权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光探针的序列为5’ACA ACG CCG AAT TGC GAA GGG C 3’。
全文摘要
本发明提供了一种荧光定量PCR方法。该方法的荧光PCR反应体系中镁离子的浓度为15—20mM,Taq酶用量为8—10单位/反应；在PCR反应前测定反应前荧光值；在PCR反应后测得反应后荧光值；计算出差值。同时用系列阳性和阴性模板也进行同样的步骤，制成标准曲线；用各样品的荧光增值即可在标准曲线上查出相应的样品中的核酸起始拷贝数。本发明还提供了一种用于该方法的试剂盒。
文档编号G01N33/53GK1238456SQ99100669
公开日1999年12月15日 申请日期1999年2月12日 优先权日1999年2月12日
发明者程钢 申请人:中山医科大学科技开发公司