一种新型聚合酶链反应微流体芯片控制系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微加工技术应用领域，具体涉及一种新型聚合酶链反应(PCR)微流体芯片控制系统及其制备方法。该系统在聚合酶链反应(PCR)过程前，利用微流体控制系统产生量级为纳升甚至皮升的微液滴，从而实现诸如RNA、DNA的基因扩增。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(polymerase chain react1n, PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增。PCR技术有特异性高、灵敏度强、快速、简便等诸多优点，在过去的几十年里，PCR技术已经被广泛地应用在不同的领域，比如食品工业、医学、病毒检测、生物学研究等基础领域。PCR技术自从1985年由Millus创立后，经历20多年的飞速发展，已成为不可或缺的一项重要微生物应用技术，主要包括:反转录PCR技术、定量PCR技术、实时荧光定量PCR技术、重组PCR技术、反向PCR技术和多重PCR技术等。
[0003]但是，传统的PCR技术需要大量昂贵的生物样品，使得测试成本很高，并且无法实现单个细胞的基因测试，进而不能有效识别单细胞之间的差异，使得其应用受到一定限制。近年来，随着微流体技术(Micro-fluid Technology)的快速发展,微流体生物芯片被视为是后基因时代用来解读基因序列之重要工具，受到极大的重视。微流体芯片，又被称为“芯片实验室”(Lab-on-a-chip)，它是利用微机电技术将一般实验室所使用的分离纯化混合，以及酵素反应等装置微小化到芯片上，以进行生化反应、过程控制或分析，其构造远较微数组芯片复杂得多，可对微量流体(包括液体和气体)进行复杂、精确的操作，如:混合和分离微量流体、化学反应、微量分析等等。微流体芯片还可以在稀有细胞的筛选、信息核糖核酸的提取和纯化、基因测序、单细胞分析、蛋白质结晶等方面发挥独特的作用。因为其具有体积轻巧、使用样品/试剂量少、反应速度快、大量平行处理及可抛弃式等优点，因此在生物技术研究上的应用范围非常广泛。
[0004]在过去10年中，微流体芯片技术的快速发展使得PCR过程可以在微型化的系统中完成成为可能，与传统PCR系统相比，其优势是不仅大大缩短了反应时间，而且极大地降低了所需的样本量。采用微流体芯片技术可以很容易获得量级在纳升甚至皮升、且尺度上非常均匀的液滴。这些分散的液滴有效地避免了彼此间的相互干扰，保证了在PCR过程中个体的独立性。该项技术使得单细胞基因测试逐步成为现实。
[0005]传统的微流控芯片的制作通常采用玻璃、硅片或者是近几年非常流行的PDMS材料。玻璃和硅片的制作工艺复杂、成本极高，而PDMS由于其多孔性使得其在PCR过程中易造成容易的大量挥发，因此不适合制作应用于PCR过程的芯片系统。
[0006]为了解决上述传统PCR过程中遇到的问题，本发明将一种新型微流体芯片技术应用到PCR过程中，提出了一种新型聚合酶链反应(PCR)微流体芯片控制系统。
【发明内容】
[0007]本发明针对传统PCR技术不能实现单细胞基因表达测试的问题，并应用一种新型微流体芯片技术，提出了一种新型聚合酶链反应(PCR)微流体芯片控制系统及其制备方法。
[0008]本发明提出的一种新型聚合酶链反应(PCR)微流体芯片控制系统，由多条实验通道I和一条参照通道II组成，所述实验通道I和参照通道II采用折流式布置，所述实验通道I入口端设有实验组油相入口 3、实验组溶液入口 4和实验组阀门6，所述实验组油相入口 3与实验组溶液入口 4相互垂直，且实验组油相入口 3通道为水平通道，实验组溶液入口4通道为竖直通道，所述实验通道I出口端设有第三出口 12和第四出口 13，实验通道I中部由若干条第二矩形通道8按照首尾相接的形式折流布置而成，第二矩形通道8的平直段上设有圆柱形空腔9，相邻圆柱形空腔9边缘距离为200 μ m ;所述参照通道II入口端设有参照组溶液入口 1、参照组油相入口 2和参照组阀门5，所述参照组油相入口 2与参照组溶液入口 I相互垂直，且参照组油相入口 2通道为水平通道，参照组溶液入口 I通道为竖直通道，所述参照通道II出口端设有第一出口 10和第二出口 11，参照通道II中部由若干条第一矩形通道7按照首尾相接的形式折流布置而成，第一矩形通道7的平直段上设有圆柱形空腔9，相邻圆柱形空腔9边缘距离为200 μ m。
[0009]本发明中，所述第一矩形通道7和第二矩形通道8的矩形截面尺寸为200μπι X100 μ m,圆柱形空腔9直径为400 μ m、300 μ m或200 μ m中任一种，高为180 μ m,圆柱形空腔底部厚度为50 μ m。
[0010]本发明中，所述第一出口 10、第二出口 11、第三出口 12和第四出口 13的出口通道可以任意夹角，参照组阀门5通道与参照通道可以任意夹角，实验组阀门6通道与实验通道可以任意夹角。
[0011]本发明提出的一种新型PCR微流体芯片控制系统的制备方法，包括(I)制备初始模板a, (2)制备PDMS模板b，(3)制备PDMS模板C，(4)制备NOA树脂通道d，(5)制备NOA树脂盖板e，(6)制备微流体芯片控制系统f，具体步骤如下:
(1)，制备初始模板a:在洁净室内，将硅片置于氢氟酸里进行清洗，去除天然氧化硅表层；接着将硅片置于95°C温度下加热5分钟，去除残留的氢氟酸；采用高速旋转涂胶机在硅片上涂一层厚度为100 ym的SU-8光刻胶，将所得硅片置于65°C的烘胶平台上进行烘烤5分钟，然后再在95°C的烘胶平台上烘烤25分钟，之后采用光刻机进行软光刻；将软光刻后的硅片分别置于65°C烘胶平台上烘烤5分钟，95°C平台上烘烤10分钟，待冷却后采用SU-8显影剂进行显影以除去多余的光刻胶，显影过程为10分钟，之后采用高速氮气清洁硅片表面，即得到图1所需通道形状的母版，也就是图5中所需的初始模板a ；
(2)，制备PDMS模板b:将步骤(I)得到的初始模板a放在锡纸折成的圆腔内，将按10:1质量比例混合的PDMS-RTV聚合物浇注在初始模板a的正面，并将其置于真空皿内脱气30分钟；脱气后，将其置于70°C的炉内烘烤至少I小时固化，形成初始模板a的负面模板，即PDMS模板b ；
(3)，制备PDMS模板c:将步骤(2)得到的PDMS模板b从初始模板a上脱离，并采用等离子机对其通道面进行活化I分钟；接着将其置于装有三氯硅烷的封闭容器中2小时，待其在通道表面上形成一层氧化硅表层后；将所得PDMS模板b再次放在锡纸折成的圆腔内，通道面朝上，浇注按10:1质量比例混合的PDMS-RTV聚合物，再次放入真空皿内脱气30分钟，后在70°C下烘烤I小时，形成与初始模板a相同形状的PDMS模板C，并将其从PDMS模板b上剥罔,备用；
(4)，制备NOA树脂通道d:将一载玻片放在一平板PDMS支撑面上，在载玻片顶部轻轻地施加压力消除存在于载玻片和平板PDMS之间的空气；在载玻片上面涂一层平均厚度约120 μ m的NOA合成树脂，将步骤(3)得到的PDMS模板c置于N0A81合成树脂上面与之对其，从顶部施加压力以排除大气泡，而小气泡则被吸收到PDMS模板c内，使得N0A81合成树脂完全将PDMS模板c的突出包住，之后将其置于强度为30%的紫外灯下照射6.5秒使N0A81合成树脂固化，最后轻轻将PDMS模板c取下，得到NOA树脂通道d ；
(5)，制备NOA树脂盖板e:用喷砂机在一载玻片相应位置打十个孔，孔径均为I mm，作为整个控制系统的进出口和阀门口，后将该载玻片清洗干净；用胶带封住载玻片的一面，确保所有的孔都被封住，之后将其放在PDMS平板上，让带有胶带的一面朝下，在其上面滴上几滴N0A81合成树脂，在毛细管力作用下，树脂将分布在整个载玻片上；后将其置于强度为30%的紫外光下照射8.5秒固化树脂；固化后取下载玻片除去胶带，清洗边缘，检查载玻片上的孔以确保它们是可穿透的，即得到NOA树脂盖板e ；