一种循环肿瘤细胞的富集方法
【专利摘要】本发明提供了一种循环肿瘤细胞(CTCs)的富集方法及其试剂盒。应用于从血液中快速高效富集CTCs。包括步骤：通过把抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体偶联到磁性纳米球上，制备得到免疫磁珠。将免疫磁珠投入到血液样本中孵育5min，再通过磁分选和洗涤等步骤即实现了对CTCs的分离富集和纯化，该法捕获效率高，富集时间短，特异性好，非常可靠。所捕获的细胞的活性率保持在(90.5±1.2)%，可以直接用于培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、以及免疫细胞化学分析。这将为CTCs的检测和研究提供有力的手段，具有极其重要的医学意义。
【专利说明】一种循环肿瘤细胞的富集方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种循环肿瘤细胞的富集方法，属于纳米材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002]癌症是当今世界人类健康和生命的最大威胁，以至于人人“谈癌色变”。而上皮来源的恶性肿瘤是最常见的一种癌症，乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食道癌等都属于这类癌症，这类癌症带来的死亡主要是由于癌症的复发和转移造成的。近年来的研究表明，癌细胞可以从原发肿瘤组织脱落进入血液系统，成为循环肿瘤细胞(CTCs)，是癌症转移的重要中间事件，CTCs的数目与癌症病人的生存率关系极大，因此检测CTCs在医学上具有重要的意义。但是CTCs以极低浓度存在于血液中，所以检测CTCs面临的最大的困难就是浓度低环境复杂。
[0003]随着科学技术的发展，人们建立了很多种检测CTCs的方法。由于CTCs浓度低，所以一般要先对CTCs进行有效的分离和纯化。其中，磁富集是应用最为广泛的一种分离技术，其操作容易，捕获效率高，应用前景好。但目前大多用微米级磁球捕获CTCs，捕获肿瘤细胞后需要经过磁球释放过程才能进行分析，这无疑使CTCs的检测和分析变得比较繁琐。只有Veridex公司开发的CellSearch系统以及MiltenyiBiotec公司开发的MACS系统是使用纳米级磁球捕获肿瘤细胞。CellSearch系统使用的是120-200 nm磁性纳米球,其在捕获细胞过程中增加了额外的步骤来增强纳米球的磁性:首先在磁性纳米球上偶联上抗上皮细胞粘附分子抗体和生物素类似物，用这种免疫磁球去捕获CTCs ;然后加入链酶亲和素与生物素类似物结合；再加入过量的磁球与SA结合，这样增大了磁球的体积，使磁响应变快从而使磁分选容易进行；经过分离和洗涤等步骤后，加入生物素，由于其与链酶亲和素的结合能力强于生物素类似物，可以把链酶亲和素竞争的结合下来，从而释放多余的磁球。这种方法为CTCs的捕获引入了很多步骤，操作比较繁琐。而MACS系统使用的是50 nm的磁性纳米球，磁响应较慢，需要强磁性的磁分离工具——磁分离柱(MACS Columns和MACSSeparator)才能完成分选,这不方便普通用户。所以开发一种磁响应迅速，用普通磁铁就可以完成磁分选，且处于纳米尺寸，用其捕获CTCs后不用经过磁球释放可直接用于后续分析和检测的磁球，将为CTCs的研究提供更有力的手段。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的问题在于制备一种处于纳米尺寸且响应迅速的磁球并提供一种快速、高效捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的方法及其试剂盒，为CTCs的检测、分析、研究提供有力的手段。
[0005]具体的技术方案是:
利用层层组装法制备380 nm磁性纳米球，并将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，制备得到免疫磁球；
将免疫磁球加入到待检样品中，37° C孵育5 min,磁分选并用I XPBS缓冲溶液洗涤，即实现了对循环肿瘤细胞的分离和富集。
[0006]所述免疫磁球是按照下面方法制备的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，在其表面层层组装油溶性的磁性纳米粒子nano- y -Fe2O3,组装五层后，再在其表面包被SiO2，之后经过丁二酸酐化在纳米球表面引入羧基，再通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化磁球表面的羧基，然后与抗体上的氨基共价偶联。
[0007]免疫磁球粒径约为380 nm,处于纳米尺寸,饱和磁化强度大于30 emu/g,磁响应迅速，置于磁力架上吸附I min，绝大部分磁球即可被捕获。
[0008]所述待检样品为患有上皮组织来源恶性肿瘤的病人的外周血样品。
[0009]本发明方法捕获的细胞，无需进行磁球释放，即可以采用免疫细胞化学进行鉴定，也可以直接用于培养、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
[0010]对捕获的细胞进行免疫细胞染色鉴定过程如下:①向捕获的细胞中，加入4%多聚甲醛溶液重悬细胞并在37° C下孵育10 min，固定细胞；②磁分选后加入0.1%曲通X-100 (Triton-X 100)溶液重悬细胞并在37° C下孵育10 min，通透细胞。③磁分选后加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液重悬细胞并在37° C下孵育30 min，封闭细胞。④磁分选加入30 yg/mL DAPI核染料溶液重悬细胞。再加入FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体、别藻蓝素(APC)标记的抗白细胞共同抗原(⑶45)抗体，在37° C下孵育30 min，进行免疫细胞染色。⑤磁分选并用I XPBS缓冲溶液洗涤三次，重悬于50 μ LlXPBS缓冲溶液中。并将细胞悬液置于聚二甲基硅氧烷(PDMS)小室中，用磁铁将其吸至小室底部，然后利用共聚焦荧光显微镜对细胞进行观察和鉴定。PDMS小室是这样制作的，首先在PDMS上打约6 mm的孔，然后将其键合到盖玻片上。
[0011]本发明方法捕获的细胞，也可以直接用于培养。培养捕获的细胞过程如下:将捕获的细胞用DMEM培养基(其中含有10%胎牛血清、60 μ g/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素溶液)，于37° C 5% CO2的细胞培养箱中培养。
[0012]本发明方法捕获的细胞也可以直接用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，对捕获的细胞进行RT-PCR分析。具体可为对人的角蛋白(CK19)和表皮生长因子受体(EGFR)基因进行RT-PCR分析，但不应理解为只局限于这两种基因的分析。
[0013]本发明还提供一种循环肿瘤细胞的富集试剂盒。所述试剂盒包括免疫磁球、I XPBS缓冲溶液、离心管和EDTA抗凝真空采血管。所述试剂盒的使用方法是:利用EDTA抗凝真空采血管收集血样，将免疫磁球与血样在37° C下孵育5 min，然后用磁力架进行磁分选并用IXPBS缓冲溶液洗涤，则循环肿瘤细胞得以富集和纯化。
[0014]本发明方法制备了处于纳米尺寸且磁响应迅速的纳米球，并在其上偶联上抗上皮细胞粘附分子的抗体。制得的免疫磁球可以直接用于患上皮来源肿瘤的病人的血液样本，由于其尺寸小，所以具有较快的反应动力学特征，可以在5 min内即可实现对循环肿瘤细胞的快速高效捕获和富集。该法操作简便省时、富集效果好、特异性强、重现性好、非常可靠。而且纳米磁球对所捕获细胞的影响较小，捕获的细胞可以直接进行免疫染色鉴定，培养、RT-PCR等，从而实现对循环肿瘤细胞的分析研究和灵敏检测。
【专利附图】
【附图说明】[0015]图1为磁性纳米球的制备及生物功能化的示意图。
[0016]图2为免疫磁球对循环肿瘤细胞的富集及鉴定分析示意图。
[0017]图3为磁性纳米球的表征结果:A磁性纳米球的透射电镜图；B磁性纳米球的磁滞回线图；C利用磁力架吸附不同时间后的磁性纳米球的捕获率；D磁性纳米球的显微镜图片；E磁性纳米球与血液孵育一段时间的后的显微镜图片。
[0018]图4为免疫磁球对极低浓度肿瘤细胞的捕获情况:A免疫磁球在不同环境中对SK-BR-3细胞的捕获情况(肿瘤细胞的浓度为5-300个/mL):1 XPBS体系(□)，混合细胞体系(背景细胞为Jurkat T细胞，浓度为10 6个/mL) (.),经过红细胞裂解处理后的血液(▲)，未经处理的全血(▼) ;B不同孵育时间下免疫磁球对SK-BR-3细胞的捕获情况(肿瘤细胞的浓度约为100个/mL) ；C免疫磁球对混在全血中的SK-BR-3、HuH-7、H印G2、MCF-7细胞的捕获情况。
[0019]图5 A为用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)对捕获的肿瘤细胞染色后的荧光显微镜图片；B-E依次为被捕获的SK-BR-3细胞刚刚贴壁、长满、第一次传代长满、第五次传代长满后的显微镜图片；F-G分别为对人的角蛋白(CK19)和表皮生长因子受体(EGFR)基因的RT-PCR的凝胶电泳图。
[0020]图6为用免疫磁球捕获模拟血样中的循环肿瘤细胞并通过免疫染色鉴定的共聚焦显微镜图片。核(DAPI):激发405 nm,发射447 土 30 nm ；CK (FITC):激发488 nm,发射525 土 25 nm ;CD45 (APC):激发605 nm,发射685 土 20 nm ;共定位:三个通道的共定位图片。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例仅用于进一步说明本发明，但不应理解为本发明的实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换。
[0022]实施例1 循环肿瘤细胞的富集和分析
下面以乳腺癌细胞SK-BR-3为例，对利用磁性纳米球高效快速捕获和灵敏检测循环肿瘤细胞进行详细说明。
[0023]一、方法
1.磁性纳米球的制备
磁性纳米球的制备是在本实验室制备荧光-磁性双编码球的基础上进行的，即利用组装的方法，在苯乙烯-丙酰胺纳米球表面层层组装磁性纳米颗粒nano- y -Fe2O30具体为--①采用无乳聚合法制备得到苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球，并依此通过酰肼化、丁二酸酐化在纳米球表面修饰上羧基，并利用EDC/NHS活化法在得到的羧基纳米球表面组装一层聚乙烯亚胺(PEI)，并通过洗涤除去未反应的PEI 将上一步所得纳米球用乙醇脱水处理后分散在正己醇中，通过PEI上的氮和铁的配位作用，将同样分散在正己醇中的nano- y -Fe2O3磁性纳米颗粒组装到纳米球表面，并通过洗涤除去未反应的纳米颗粒；③将上一步所得纳米球分散到PEI溶液中，在其表面组装第二层PEI。再重复②③四次，在纳米球表面一共组装五层nano-Y-Fe2O3磁性纳米颗粒；④将所得的磁性纳米球通过四乙氧基硅氧烷和(3-氨基丙基)三乙氧基硅氧烷处理在其表面包覆一层硅壳并引入氨基；?将上一步得到的磁性纳米球通过丁二酸酐处理在其表面引入羧基。
[0024]2.磁性纳米球的生物功能化
利用EDC/NHS活化的方法将抗体修饰到磁性纳米球表面。具体为:取大约5 mg磁性纳米球，用0.01 M pH 6.8 PBS洗涤两次后分散到0.01 M pH 6.8 PBS中，并加入EDC、NHS使其最终浓度为均为50禮，反应活化0.5 h，用0.01 M pH 7.2 PBS通过磁力架将球洗涤三次，然后分散到I mL 0.01 M pH 7.2 PBS中，加入约50 μ g抗上皮细胞粘附分子抗体，反应四小时，用0.01 M pH 7.2 PBS洗涤五次除去未反应的抗体。最后存于4° C冰箱待用。
[0025]3.极低浓度的肿瘤细胞的捕获
O复杂体系中极低浓度肿瘤细胞的捕获
将用Hoechst 33342染核的SK-BR-3细胞与I XPBS、Jurkat T细胞(IO6个/mL分散于IXPBS中)、经过红细胞裂解液处理的健康人的外周血、未处理的健康人的外周血(全血)混合，调节SK-BR-3细胞的浓度在5、50、100、200、300个/mL，将免疫磁球投入到上述体系，37° C孵育，磁分选并洗涤，收集浊液和清液并对其中的SK-BR-3细胞计数，计算捕获率。
[0026]2)孵育时间对肿瘤细胞捕获率的影响
将用Hoechst 33342染核的SK-BR-3细胞与健康人的外周血混合，调节SK-BR-3细胞的浓度约为100个/mL,加入免疫磁球,37° C下孵育5 min、10 min、20 min、30 min。磁分选用I XPBS洗涤，收集浊液和清液并对其中的SK-BR-3细胞计数，计算捕获率。
[0027]3)普适性实验
将用Hoechst 33342染核的SK-BR-3细胞、MCF-7细胞、HuH-7细胞、H印G2细胞与健康人的外周血混合，调节细胞的浓度约为100个/mL，加入免疫磁球，37° C下孵育5 min。磁分选用I XPBS洗涤，收集浊液和清液并对其中的染核的细胞计数，计算捕获率。
[0028]4.捕获的肿瘤细胞的活性分析
将免疫磁球投入到SK-BR-3细胞悬液中，孵育5 min,磁分选并洗涤后，用2 μ M钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和4.5 μ M碘化丙啶(PI)染色30 min，将处理好的细胞在荧光显微镜下用蓝光激发观察，统计500个细胞，计算绿色细胞的数目占总细胞数的百分比即为捕获细胞的活性率。另外，将捕获的SK-BR-3细胞用DMEM培养基(含有10%胎牛血清、60 μ g/mL青霉素、100 μ g/mL链霉素溶液)，于37° C 5% CO2的细胞培养箱中培养，观察其贴壁、生长、增值及传代过程。
[0029]5.捕获的肿瘤细胞的RT-PCR分析
将免疫磁球投入到SK-BR-3细胞悬液中，孵育5 min,磁分选并洗涤后，用RNApreppure cell/bacteria kit (天根生化科技有限公司)提取细胞内的总RNA,再用Promega RTsystem (Promega Corporation)进行逆转录。然后用引物 5’-GACTACAGCCACTACTACACGACCAT-3，(SEQ ID N0.1)和 5，-GAGCGGA ATCCACCTCCACACT-3’ (SEQ ID N0.2)扩增人的角蛋白(CK19)的基因编码区 346-bp 片段，用引物 5’-CCAGTGACTGCTGCCACAACCA-3’ (SEQ IDN0.3)和 5’ -CGCCGTCTTCCTCCATCTCATAGC-3’ (SEQ ID N0.4)扩增人的表皮生长因子受体(EGFR)的基因编码区285-bp片段。反应条件分别为:CK19:94° C预变性5 min ；94° C变性30 s，55° C退火30 s，72° C延伸30 S，循环35次；最后在72。C延伸10 min。EGFR:94° C预变性5min;94° C变性30 s，67° C退火30 s，72° C延伸30 S，循环35次；最后在72° C延伸10 min。产物用2%琼脂糖凝胶分离并用溴化乙锭(EB)染色观察。
[0030]6.模拟血液样本的循环肿瘤细胞的捕获和染色鉴定
将SK-BR-3细胞与健康人的外周血混合，调节SK-BR-3细胞的浓度为50个/mL，加入免疫磁球，37° C下轻摇孵育5 min。磁分选用IXPBS洗涤一次后，加入4%多聚甲醛溶液重悬捕获的细胞并在37° C下孵育10 min，固定细胞。磁分选后加入0.1%曲通X-100 (Triton-X100)溶液重悬细胞并在37° C下孵育10 min，通透细胞。磁分选后加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液重悬细胞并在37° C下孵育30 min，封闭细胞。磁分选加入30 μ g/mL DAPI核染料溶液重悬细胞，再加入FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体、别藻蓝素(APC)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体，在37° C下孵育30 min，进行免疫细胞染色。磁分选并用1XPBS缓冲溶液洗涤三次，重悬于50 μ LlXPBS缓冲溶液中。并将细胞悬液置于PDMS小室中，用磁铁将其吸至小室底部，然后利用共聚焦荧光显微镜对细胞进行观察和鉴定。
[0031]7.检测方法的重复性考察
用免疫磁球捕获和免疫染色鉴定分析五个血液样本,每个样本分析三次，考察检测方法的重复性和可靠性。
[0032]8.实际肿瘤患者和健康人血液样本的检测
用EDTA抗凝真空采血管收集血样，加入免疫磁球，轻摇孵育5 min后磁分选并洗涤，然后按照步骤6进行免疫染色鉴定并对CTCs进行计数。
[0033]二、结果
1.磁性纳米球的表征
磁性纳米球的透射电镜图(图3A)表明所合成的纳米球粒径均一 (~380 nm)，分散性好。而通过纳米球的磁滞回线(图3B)可以看出纳米球的矫顽力和剩磁几乎为零，表明磁性纳米球在室温下呈现较好的超顺磁性，而且饱和磁化强度达34.9 emu/g。磁性纳米球的磁响应迅速，置于磁力架上吸附1 min基本上全部被捕获(图3C)。用显微镜观察磁性纳米球和与血液孵育一段时间的磁性纳米球(图3D和图3E)，发现磁性纳米球分散性依然保持良好。这表明磁性纳米球在复杂体系中很稳定，不会发生团聚。综上，该磁性纳米球处于纳米尺寸,粒径小,磁响应快,在血液中可以保持单分散性,这些都为磁性纳米球直接用于血液样本中CTCs的快速高效捕获提供了非常好的基础。
[0034]2.极低浓度的肿瘤细胞的捕获
将免疫磁球用于四种体系中极低浓度肿瘤细胞的捕获:1X PBS体系、混合细胞体系(背景细胞为Jurkat T细胞，浓度为10 6个/mL)、经过红细胞裂解处理后的血液、未经处理的血液。捕获情况见图4A，可以看出，免疫磁球在这四种体系中对肿瘤细胞都实现了高效的捕获，这说明环境的复杂性对免疫磁球和肿瘤细胞的结合影响很小，而免疫磁球可以直接应用于全血环境，这保证了该富集方法的可靠性。通过研究孵育时间对捕获率的影响，我们发现该免疫磁球具有很快的反应动力学特征，孵育5 min即可抓到全血中94%以上的SK-BR-3细胞(图4B)。而且免疫磁球普适性很好，不仅适用于SK-BR-3细胞，还可以对MCF-7细胞、HuH-7细胞、Hep G2细胞等实现高效的捕获(图4C)。
[0035]3.捕获的肿瘤细胞的活性和RT-PCR分析
用钙黄绿素乙酰甲酯(Calcein AM)和碘化丙啶(PI)鉴定捕获的肿瘤细胞的活性，Calcein-AM能透过活细胞的细胞膜，并与活细胞内的酯酶作用脱去AM，产物Calcein具有绿色荧光。而PI为核染料，其不能穿过活细胞的细胞膜，只能透过死细胞的细胞膜达到细胞核，与核内的DNA作用产生红色荧光。所以用Calcein-AM/PI染色，发绿色荧光的为活细胞，发红色荧光的为死细胞。由图5A可以看出捕获的SK-BR-3细胞绝大部分为呈现绿色荧光，说明大部分细胞保持较高的活性，统计捕获的细胞的活性率为(90.5±1.2)%。图5B-5E依次为捕获的SK-BR-3细胞刚刚贴壁、长满、第一次传代长满、第五次传代长满的显微镜图片，可以发现捕获的细胞基本能正常贴壁、生长增值并可以进行传代培养，且细胞的形态正常。说明免疫磁球对细胞的活性影响较小，捕获的细胞无需进行磁球释放过程，就可以直接进行再培养。图5F为对人的角蛋白(CK19)和表皮生长因子受体(EGFR)基因的RT-PCR的凝胶电泳图，可以看出捕获的细胞均扩增出相应的条带，证明免疫磁球捕获的细胞无需进行磁球释放过程即可直接用于RT-PCR。
[0036]4.模拟血液样本的循环肿瘤细胞的捕获和染色鉴定
使用DAPI核染料、FITC标记的抗角蛋白(CK19)抗体、别藻蓝素(APC)标记的抗白细胞共同抗原(CD45)抗体对捕获的细胞进行免疫染色鉴定。CK19为上皮细胞标志物，存在于正常上皮细胞和上皮癌细胞中。CD45是白细胞共同抗原，是白细胞的标志物。因此DAPI阳性、CK19阳性、CD45阴性的细胞被鉴定为循环肿瘤细胞。由图6可以看出，循环肿瘤细胞呈现绿色，CK19高表达，而白细胞呈现红色，⑶45高表达。表1为对五组血液样本的肿瘤细胞的检测结果，每组样本平行做三次，标准偏差计算得10.8%，表明该法重现性较好，方法可靠。
[0037]表1
【权利要求】
1.一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于: 利用层层组装法制备380nm磁性纳米球，并将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，制备得到免疫磁球； 将免疫磁球加入到待检样品中，37° C孵育5 min，磁分选并用IXPBS缓冲溶液洗涤，即实现了对循环肿瘤细胞的分离和富集。
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述的将抗上皮细胞粘附分子抗体共价偶联到磁性纳米球表面，具体为通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化磁球表面的羧基，然后与抗体上的氨基共价偶联。
3.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述免疫磁球是按照下面方法制备的:首先以苯乙烯-丙烯酰胺共聚纳米球为模板，在其表面层层组装油溶性的磁性纳米粒子nano- y -Fe2O3,组装五层后，再在其表面包被SiO2，之后经过丁二酸酐化在纳米球表面引入羧基，再通过1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺活化磁球表面的羧基，然后与抗体上的氨基共价偶联。
4.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于，所述待检样品为患有上皮组织来源恶性肿瘤的病人的外周血样品。
5.一种循环肿瘤细胞的富集试剂盒，包括免疫磁球、I XPBS缓冲溶液、离心管和EDTA抗凝真空采血管。
6.权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，利用EDTA抗凝真空采血管收集血样，将免疫磁球与血样在37° C下孵育5 min,然后用磁力架进行磁分选并用I XPBS缓冲溶液洗涤，则循环肿瘤细胞得以富集和纯化。
【文档编号】G01N1/40GK103630440SQ201310614556
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】庞代文, 温聪颖, 吴玲玲, 张志凌 申请人:武汉大学