一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法
【专利摘要】本发明提供了一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法，该方法主要包括：对生物体液样本进行红细胞裂解处理；加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育；用滤膜过滤细胞悬液，富集循环肿瘤细胞。本发明对红细胞裂解、免疫微珠法和滤膜法富集CTCs方法的综合及优化，从而极大地提高循环肿瘤细胞的富集效果，该技术对白细胞的去除效率>99.9%，肿瘤细胞的富集效率>80%。同时，本发明还提供一种使用上述循环肿瘤细胞的富集方法的试剂盒，以及提供一种用于富集循环肿瘤细胞的装置。本发明还提供了一种上述富集的循环肿瘤细胞的分析方法，通过该方法，可以实现肿瘤细胞数量、基因突变、基因表达谱等动态变化的分析。
【专利说明】一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法。
【背景技术】
[0002]目前认为，肿瘤微转移灶起源于侵入循环中的肿瘤细胞，因此，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)可能是肿瘤远处转移的一种标志。近年来，随着分子技术的发展，使得分离、计数外周血CTCs成为可能。在疾病早期阶段，CTCs可能有助于良、恶性肿瘤的鉴别，转移风险的预测和判断。在疾病进展期，CTCs或许可以提供重要的预后信息，以及帮助医生监测治疗效果。而且，CTCs可能反映肿瘤特征，能够指导治疗方案的制定，并且可以作为靶向治疗的靶标。
[0003]现有的CTCs富集方法通常是基于CTCs的表面标志物，如免疫磁性分选法，或CTCs的物理性质(密度和大小),如梯度离心法。其中,基于免疫磁珠的CellRearch是一种半自动化的CTCs检测仪器，该方法针对CTCs表面的标志物进行正向富集，2004年已被美国FDA批准用于预测乳腺癌患者的无病生存期和总生存期，但由于CTCs在体内生长过程中会出现丢失上皮细胞黏附因子表面抗原等CTCs表面标志物的现象，不能富集该部分CTCs细胞，在实际使用的局限性较大。
[0004]密度梯度离心法的具有简单、廉价、快速等优点，但分离的肿瘤细胞不纯，分离效率不高，有相当一部分肿瘤细胞丢失，在实际应用仍有很大局限。
【发明内容】
[0005]本发明目的之一是提供一种富集循环肿瘤细胞的方法，该方法可以很好地实现肿瘤细胞的富集。
[0006]实现上述目的的技术方案如下。
[0007]—种循环肿瘤细胞的富集方法，主要包括以下步骤:
[0008]I)对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞；
[0009]2)加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育以去除
[0010]白细胞、血小板及残余的红细胞。
[0011]在其中一个实施例中，还包括步骤:3)将去除白细胞、红细胞后的细胞悬液在滤膜上进行过滤，得到富集循环肿瘤细胞的滤膜。
[0012]本发明中，所述生物体液样本包括但并不局限于以下来源:人或动物的外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。本发明中，所述免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以为含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上成分的微珠。
[0013]所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体，进一步地，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、CD45、CD35、CD235a中的两种或以上。
[0014]本发明中，所述滤膜孔径为5~8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。
[0015]本发明中，使用红细胞裂解液对生物体液样本进行红细胞裂解处理，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.1M~0.5M氯化铵、0.0OlM~0.2M碳酸氢钾、0.001~
0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.3M~0.32M氯化铵、0.018M~0.022M碳酸氢钾、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，还包括有0.01%~0.2%的甲醛。
[0016]本发明的另一目的是提供一种使用上述循环肿瘤细胞的富集方法的试剂盒。
[0017]实现上述目的的技术方案如下。
[0018]一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其组份主要包括:红细胞裂解液，免疫微珠。
[0019]进一步地，该试剂盒还可以包括滤膜。
[0020]本发明中，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体，进一步地，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的两种或以上。
[0021]本发明中，所述滤膜孔径为5~8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。
[0022]本发明中，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.1M~0.5M氯化铵、
0.0OlM~0.2M碳酸氢钾、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.3M~0.32M氯化铵、0.018M~0.022M碳酸氢钾、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。进一步地，还包括有0.01%~0.2%的甲醛。
[0023]本发明的另一目的是提供一种用于富集循环肿瘤细胞的装置，包括用于加入红细胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及过滤的部件。
[0024]本发明的另一目的是提供一种上述富集的循环肿瘤细胞的分析方法。该方法可用于循环肿瘤细胞的分析。
[0025]实现上述目的的技术方案如下。
[0026]本发明中，循环肿瘤细胞的分析方法包括:免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定。
[0027]在其中一个实施例中，该方法为免疫荧光，基因突变检测，基因表达检测。
[0028]在其中一个实施例中，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量与至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量进行比较，从而分析循环肿瘤细胞数量的动态变化。
[0029]进一步地，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR,基因突变检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定；以及至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定，比较测定结果从而动态的分析获取循环肿瘤细胞对象的基因突变、基因表达谱、蛋白表达谱，和/或酶学的变化。
[0030]本发明的另一目的是提供一种细胞纯化试剂盒。该试剂盒可用于去除生物体液中的白细胞、红细胞和/或血小板。该试剂盒主要组份包括有:与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；所述抗体选自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、⑶45、⑶35、⑶235a中的两种或以上。
[0031]本发明的主要优点在于:
[0032]I)目前富集CTCs的方法中，较为常用的是正性富集法，该法使用的微珠表面偶联与目的细胞结合的抗体(如EpCAM，HEA125，cK7/8)，细胞与磁珠结合后，直接被分离出来；而本发明使用的是负性富集法，采用微珠偶联抗白细胞的抗体，从而去除白细胞，使目的细胞得以纯化，避免了因CTCs表面标志物的丢失导致部分CTCs无法有效富集，本发明可以富集更多CTCs。
[0033]2)本发明使用负性富集法，避免如正性富集中抗体与CTCs的结合，从而有效保证CTCs细胞的完整性，有利于后续检测与工艺处理。
[0034]3)本发明对红细胞裂解、免疫微珠法去除白细胞和滤膜法富集CTCs方法的综合及优化，从而极大地提高循环肿瘤细胞的富集效果，该技术目前对白细胞的去除效率>99.9%，肿瘤细胞的富集效率>80%。
[0035]4)本发明联合多种⑶抗体免疫微珠，解决了目前由于不同类别白细胞表达⑶45的丰度不同，造成单一 CD45免疫微珠去除白细胞的结合效率差的问题，极大提高了白细胞的去除效果，从而可以有效富集循环肿瘤细胞。
[0036]5)本发明在使用联合多种CD抗体免疫微珠的同时采用微孔滤膜过滤的方法，进一步提高白细胞的去除效率和肿瘤细胞的回收率，极大的提高CTCs纯度，方便后续对肿瘤细胞的研究和分子检测。
【专利附图】
【附图说明】
图1为实施例6的免疫荧光结果示意图，其中图A =DLD-1细胞，图B:HepG2细胞，图C:NC1-H2228，箭头1:白细胞，箭头2:肿瘤细胞。
【具体实施方式】
[0037]实施例1 一种富集循环肿瘤细胞的试剂盒，主要包括有:
[0038]1、红细胞裂解液
[0039]用于红细胞裂解液，具有以下组成:
[0040]表1红细胞裂解液
[0041]
【权利要求】
1.一种循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，主要包括以下步骤: 1)对生物体液样本进行红细胞裂解处理以去除红细胞； 2)加入与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠进行孵育以去除白细胞、血小板及残余的红细胞。
2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，还包括: 3)将去除白细胞、红细胞后的细胞悬液在滤膜上进行过滤，得到富集循环肿瘤细胞的滤膜。
3.根据权利要求2所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述滤膜孔径为5~8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。
4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体。
5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞的富集方法，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自 CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的两种或以上。
6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，使用红细胞裂解液对生物体液样本进行红细胞裂解处理，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.1M~0.5M氯化铵、0.0OlM~0 .2M碳酸氢钾、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。
7.根据权利要求6所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.3M~0.32M氯化铵、0.018M~0.022M碳酸氢钾、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。
8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述的红细胞裂解液还包括有0.01%~0.2%的甲醛。
9.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述免疫微珠由抗体与微珠表面进行共价或非共价偶联而成，所述微珠的直径介于10纳米-100微米。
10.根据权利要求9所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述微珠为磁性或非磁性。
11.根据权利要求10所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述微珠含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上的成分。
12.根据权利要求1至11任一所述的循环肿瘤细胞的富集方法，其特征在于，所述生物体液样本来源于人或动物的:外周循环血，胸腔积液，腹水，脐带血，羊水，骨髓，或培养的人或动物细胞。
13.一种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括红细胞裂解液，免疫微珠。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括滤膜。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述的免疫微珠上偶联的抗体选自CD2、CD15、CD16、CD19、CD33、CD41、CD45、CD35、CD235a 中的两种或以上。
17.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述滤膜孔径为5~8um，选自聚碳酸酯滤膜、纤维滤膜、尼龙滤膜、或塑料薄膜。
18.根据权利要求13-17任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.1M~0.5M氯化铵、0.0OlM~0.2M碳酸氢钾、0.001~0.05M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述红细胞裂解液包括有以下浓度的组份:0.3M~0.32M氯化铵、0.018M~0.022M碳酸氢钾、0.003~0.005M乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸二钠。
20.一种用于富集循环肿瘤细胞的装置，包括用于加入红细胞裂解液的部件，用于加入免疫微珠的部件，以及过滤的部件。
21.一种权利要求1至11任一项富集的循环肿瘤细胞的分析方法，其特征在于，该分析方法包括免疫荧光，免疫组化染色，PCR,基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定。
22.根据权利要求21所述的循环肿瘤细胞的分析方法，其特征在于，该方法包括免疫荧光，基因表达检测，和/或基因突变检测。
23.一种权利要求1至11任一项富集的循环肿瘤细胞的分析方法，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量与至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞数量进行比较，从而分析循环肿瘤细胞数量的动态变化。
24.一种权利要求1至11任一项富集的循环肿瘤细胞的分析方法，该方法包括，将获取循环肿瘤细胞对象的第一份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定；以及至少接受一部分治疗的同一对象的第二份生物体液样本中的循环肿瘤细胞进行免疫荧光，免疫组化染色，PCR，基因突变检测，基因表达检测，基因表达谱分析，流式细胞术检测，蛋白表达谱分析，和/或酶学测定，比较测定结果从而动态分析获取循环肿瘤细胞对象的基因突变、基因表达谱、蛋白表达谱，和/或酶学的变化。
25.—种细胞纯化试剂盒，其特征在于，主要组份包括有:与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的免疫微珠，所述的免疫微珠上共价或非共价偶联有与白细胞、红细胞和/或血小板特异性结合的抗体；所述抗体选自⑶2、⑶15、⑶16、⑶19、⑶33、⑶41、⑶45、⑶35、⑶235a中的两种或以上。
【文档编号】C12M1/12GK104178454SQ201310200385
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】许嘉森, 刘志明, 吴诗扬, 刘苏燕, 林丽 申请人:益善生物技术股份有限公司