一种人循环miR?122的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种人循环miR?122的检测方法，包括：提取血清总RNA作为样品，将样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进行miR?122特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值对芯片反映的结果进行验证，即可。本发明检测方法提高了灵敏度，为人体肥胖状态下循环miRNAs的变化提供了新的临床依据，循环miR?122水平与肥胖、糖调节、胰岛素抵抗密切相关。
【专利说明】
-种人循环m i R-122的检测方法
技术领域
[000。 本发明属于肥胖症诊断生物学标志物领域，特别设及一种人循环miR-122的检测方法。
【背景技术】
[0002] 研究表明，脂肪细胞在膜岛素抵抗的发病过程中发挥中屯、作用。机体在肥胖状态 下，脂肪细胞分泌功能素乱、脂质过度积聚，进而导致细胞脂毒性、膜岛素抵抗等病理过程 的发生。目前，关于肥胖症的基础研究初步掲示了其发病机制，但可用于肥胖症诊断生物学 标志物仍较为匿乏、现有治疗效果亦不尽如人意。
[0003] 新近基础研究发现，miRNAs在肥胖发生、膜岛素抵抗发生发展过程中发挥重要作 用，但其调控机制尚未阐明。在肿瘤、屯、血管疾病和代谢性疾病领域，特定miRNAs已成为潜 在生物学标志物和药物干预祀点。2013年，改造 miR-34分子结构制备的药物MRX34已进入I 期临床试验，目标人群为不适于手术切除的原发性肝癌或累及肝脏的实体肿瘤患者。
[0004] 内源性循环miRNAs具有相对稳定、微创、易于检测等特点，在疾病状态下其表达谱及 表达量显著改变，有望用于疾病诊断、病理分型、预后评估。然而，现有的筛选特定循环miRNAs 用作肥胖症诊疗生物学标志物的人群研究样本量小，不同研究所报道的结果并不一致。新近 研究发现，血浆 miR-142-化、miR-140-5p、miR-423-5p、miR-520c-3p 及 miR-Ea 可能是肥胖症风 险评估及疾病分类的新的生物学标志物。另一项研究提示，血清miR-巧b、miR-138、miR-376a 可用作预测肥胖症的有效生物学指标。关于循环miRNAs与代谢调节的关系亟需更多临床佐证。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人循环miR-122的检测方法，该方法检测 方法提高了灵敏度，为人体肥胖状态下循环miRNAs的变化提供了新的临床依据，循环miR- 122 水平与肥胖、糖调节、膜岛素抵抗密切相关; 尤为重要的是，本发明证实了循环 miR-122 水平上调是膜岛素抵抗的独立危险因素;循环miR-122具有用作诊治肥胖症、膜岛素抵抗的 血清学标志物的广阔前景。
[0006] 本发明的一种人循环miR-122的检测方法，包括：
[0007] 提取血清总RNA作为样品，将样品溶于去核酸酶的蒸馈水中，取部分逆转录为cDNA， 进行miR-122特异性实时巧光定量PCR反应，得到Ct值对忍片反映的结果进行验证，即可。
[0008] 所述逆转录采用的逆转录混合液的组成为:5X逆转录反应液化1，逆转录酶mix 1 ，质控用Sp化e-In溶液0.化1，去核酸酶的蒸馈水4.化1。
[0009] 所述逆转录条件为:42°C反应化，95°C反应5min，随后降至4°C。
[0010] 所述实时巧光定量PCR的反应体系为：cDNA模板化1，引物化1，2XSY服化1。
[0011] 所述实时巧光定量PCR的反应条件为:95°C预变性lOmin; 95°C 10s，60°C延伸Imin， 45个循环。
[00。] 有益效果
[0013]本发明检测方法提高了灵敏度，为人体肥胖状态下循环miRNAs的变化提供了新的 临床依据，循环miR-122水平与肥胖、糖调节、膜岛素抵抗密切相关;尤为重要的是，本发明 证实了循环miR-122水平上调是膜岛素抵抗的独立危险因素;循环miR-122具有用作诊治肥 胖症、膜岛素抵抗的血清学标志物的广阔前景。
【附图说明】
[0014] 图1(A)为正常体重对照组(n=107)与肥胖症患者组(n=123)循环miR-122的比较； (B)为正常体重对照组与肥胖症患者组循环miR-122实时巧光定量PCR实验原始Ct值；（C)为 校正性别、年龄、ALT、皿心(3后，肥胖症患者组循环miR-122水平与正常体重对照组的比较；
[0015] 图2为不同程度肥胖症患者血清miR-122水平;其中，（A)为轻度肥胖组(n = 28)、中 度肥胖组(n = 66)、重度肥胖组(n = 29)循环miR-122与正常体重对照组(n = 107)的比较； (B)为校正性别、年龄、41；1\皿心(3后，轻度肥胖组、中度肥胖组、重度肥胖组循环11111?-122水 平与正常体重对照组的比较。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 [0017]实施例1
[0018] 研究人群：18~30岁人群。肥胖症患者均为肥胖专病口诊的患者;正常体重受试者 均为在校学生志愿者。
[0019] 1.血清RNA抽提
[0020] 血清总RNA的提取使用microRNA抽提试剂盒(miR化asy Mini Kit),并参照德国 Qiagen公司提供的说明书。
[0021 ] (1)将血清样本从-80°C冰箱内取出，置于冰上完全融化；
[0022] (2)向每个装有血清样本的EP管中，加入1.5ml QIAzol裂解液，W最高速在縱满混 合器上剧烈振荡15s后置于冰上，可重复运一过程，直至白色沉淀完全消失，室溫静置5min;
[0023] (3)每管加入20化1氯仿溶液，W最高速在縱满混合器上剧烈振荡15s，静置3min;
[0024] (4)4°C，12,000g离屯、15min，将上层无色水样溶液至另一RNAse Free的EP管中，加 入1.5倍体积无水乙醇后轻柔混匀；
[00巧](5)吸取700yr混合物加入RNeasy Mini离屯、柱，室溫9000g离屯、15s，弃2ml收集管 中的液体，重复该步骤直至所有混合物均加入RNeasy Mini离屯、柱；
[00%] (6)向每个RNeasy Mini离屯、柱加入70化1 RWT洗液，室溫9000g离屯、15s，弃2ml收 集管中的液体；
[0027] (7)向每个RNeasy Mini离屯、柱加入50化1 R阳洗液，室溫9000g离屯、15s，弃2ml收 集管中的液体；
[002引 （8)再向每个RNeasy Mini离屯、柱加入500山R阳洗液，室溫9000g离屯、2min，弃2ml 收集管；
[00巧](9)将RNeasy Mini离屯、柱置于新的2ml收集管上，室溫最大转速离屯、lmin，W去除 离屯、柱残存的无水乙醇；
[0030] (10)将RNeasy Mini离屯、柱置于RNAse Rree的1.5ml离屯、管上，向每个离屯、柱滤膜 中央加入30iil RNAse化ee的蒸馈水，室溫12,000g离屯、Imin洗脱RNA;
[00川 （11)室溫最大转速离屯、Imin，充分洗脱滤膜上的RNA，将RNA转移入新的RNAse 化ee的离屯、管中。
[0032] 2.血清miRNAs Microarray忍片
[0033] (1)为尽可能排除样品间个体差异的影响，将发现人群肥胖组患者的血清miRNAs 样本随机混合为2个混合样品（pooled sample)，每个肥胖组混合样品含28个患者的血清 miRNAs样本，正常体重组也W此方法随机混合为2个混合样品；
[0034] (2)据由Aglient 2100生物分析仪测得的混合样品浓度，取总量为l(K)ng的RNA样 品，放入1.5ml离屯、管，置于冰上；
[OO%] (3)加入化1小牛肠憐酸醋酶（calf intestinal地osphatase,CIP)mix，轻柔混 匀，37°C水浴30min，W使样品去憐酸化，CIP mix现用现配、置于冰上，具体如下表：
[0037]每次多配10%的量备用；
[003引 （4)加入2.祉1 DMSOaOOr水浴5~lOmin变性；
[0039] (5)立即将样品转移至冰上，每个样品加入4.化1连接酶mi X，轻柔混匀，16 °C水浴 2h，T4RNA连接酶mix现用现配、置于冰上，具体如下表： 「AA>1Al
[0041] 每次多配10%的量备用；
[0042] (6)50°C真空浓缩30min~化，直至样品完全干燥；
[0043] (7)用17iil RNAse Free的蒸馈水重悬样品，每管加入2祉1杂交mix(每次多配10% 的量备用），如下表所示： L0045」总体系为45iil，充分混匀；
[0046] (8)100°C水浴5min，立即转移至冰浴5min;
[0047] (9)将样品与miRNA(8*70K)V16.0忍片在滚动杂交炉中55°C，20巧m滚动杂交20h;
[004引 （10)杂交完成后，将忍片置于洗缸中，用加入10%化iton X-102的基因洗涂剂(GE Wash Buffer)l、基因洗涂剂2洗片5-6次；
[0049] (11)忍片结果采用4旨116111:基因忍片扫描仪进行扫描，用化日1:山"6 6义化日(31:;[0]1软 件10.7读取结果，设置扫描分辨率=5皿，PMT100 %、5 % ;
[0050] (12)使用Gene Spring软件11.0将所有数据进行归一化处理，所用算法为分位数 法(Qu曰ntile)。
[0化1] 3.miRNAs的逆转录
[0052] miRNAs的逆转录使用miRCURY LNA通用逆转录试剂盒(miRCURY LNA Universal RT Kit)，并参照丹麦Exiqon公司提供的说明书。
[005；3] (1)从30山RNA溶液中精确吸取2山RNA溶液置于新的RNAse Free的EP管中，置于冰上；
[0054] (2)按照Exiqon公司提供的说明书每个样本按W下的体系配制逆转录mix混合酶 溶液，具体如下： 「nncKl
[0056]每次多配10%的量备用；
[0化7] (3)向每个样本加入如1 mix混合溶液，快速离屯、，放入PCR仪42。(：反应化，95C 5min，立即降至4°C ;
[005引 （4)向cDNA产物中加入39化1去核酸酶的蒸馈水稀释至40化1备用(40倍稀释）。
[0059] 4.实时定量？〇?^6￡^-^1116?〇0
[0060] 采用实时巧光定量PCR试剂盒及人miR-122特异性引物化xiqon公司产品），参照丹 麦Exiqon公司提供的说明书，在罗氏Li曲t切cler 480仪器上进行实时定量PCR，每个样本 设置3个复孔。
[0061] (1)反应体系 「noA^I
[0063] (2)反应条件
[0064] S 化 ge 1 预变性：95°C10min
[00化]S化ge 2扩增：95°C10s，6(TClmin(1.6°C/s)，45Cycles;
[0066] S化ge 3溶解曲线分析。
[0067] (3)实验结果分析:实验组与对照组的表达变化表示。
[006引 5.结果
[0069] (1)人群循环miRNAs的表达水平
[0070] 表1肥胖痛患者表达量改巧的循环miRNAs
[0071]
[0072]
[0073]
[0074]
[0075] 为尽可能排除个体差异对实验结果的影响、富集最具差异性表达的miRNAs，将肥 胖症患者组、正常体重对照组各做2个随机混合样品。倍数差异(fold changes,FC)〉3或FC <-3的miRNAs纳入进一步分析。忍片结果表明，单纯性肥胖症患者血清中共有34个miRNAs表 达量发生显著性改变(表1);其中，共有4个miRNAs表达显著上调、30个miRNAs表达显著下 调。在所有表达水平显著性改变的miRNAs中，微小RNA-122(microRNA-122，miR-122)是循环 中表达丰度最高的miRNA;先前研究表明，肝脏代谢素乱状态下，miR-122表达量失调；其在 小鼠体内调节血浆胆固醇及血脂含量。因此，选用循环miR-122表达水平与肥胖和膜岛素抵 抗的关系。
[0076] (2)肥胖症患者循环miR-122表达水平上调
[0077] 巧光定量PCR与微阵列忍片结果一致，较之正常体重对照组，验证人群肥胖症患者 血清miR-122水平升高至3.07 ±0.24倍(P = 7.10 X 1〇-12，图1A)。肥胖症患者组血清miR-122 的CT值为30.85± 1.17，正常体重组血清miR-122的CT值为32.37± 1.55(图1B)。校正性别、 年龄、血脂和肝功能后，肥胖症患者组循环miR-122水平仍显著高于正常体重对照组（P< 0.001，图1C)。
[0078] 为进一步探究循环miR-122水平与肥胖发生的关系，将肥胖症患者分为轻度肥胖 组、中度肥胖组和重度肥胖组。与正常体重对照组相比，轻度肥胖组、中度肥胖组和重度肥 胖组循环miR-122水平均显著升高(P均<0.05,图2A);循环miR-122水平呈现随肥胖程度加 重而升高的趋势，尽管不具有统计学差异。校正性别、年龄、血脂和肝功能后，较之正常体重 对照组，轻度肥胖组、中度肥胖组、重度肥胖组循环miR-122水平仍显著升高（P<0.01，图 2B)。（3)循环miR-122水平与多个变量的相关性分析
[0079] 表2循环miR-122水平与各变量的相关性和多元逐步回归分析
[0080]
[0081]
[0082] 注:r，Pearson相关系数;0，标准回归系数；表示该变量未进入最优回归方程。
[0083] Pearson相关性分析显示，循环miR-122水平与BMI、腰臀比、体脂含量、血压、肝酶、 TG、HDkc、空腹血糖和膜岛素、0GTT-2h血糖和膜岛素、H0MA-IR、性别显著相关(P均<0.01， 表2)。多元逐步回归分析发现，循环miR-122水平与血清ALT水平独立相关(0 = 0.648，P< 0.001;表 2)。
[0084] 表3正常体重受试者循环miR-122水平与各变量的相关性和多元逐步回归分析
[0085]
[0086]
[0087] 注:r，Pearson相关系数;0，标准回归系数；表示该变量未进入最优回归方程。
[0088] 鉴于正常体重组与肥胖症患者组在膜岛素敏感性、血糖调节、肝功能等方面存在 较为明显的差别，我们分别在正常体重组及肥胖症患者组中分析了循环miR-122水平与各 代谢指标的相关性。在正常体重受试者中，循环miR-122表达水平与ALT、ALP、丫 -GTJDkc、 血糖、空腹膜岛素、性别显著相关(P均<0.05,表3)。多元逐步回归分析显示，循环miR-122表 达水平与性别(0 = -〇.425，？<〇.〇〇1)和皿1-(：(0 = -〇.287，？<〇.〇〇1)独立相关(表3)。
[0089] 表4肥胖症患者循环miR-122水平与各变量的相关性和多元逐步回归分析
[0090]
[0091]
[0092] 注:r，Pearson相关系数;0，标准回归系数；表示该变量未进入最优回归方程。
[0093] 在肥胖症患者中，循环miR-122表达水平与ALT、AST、丫 -GT、TG及血糖显著相关(P 均<0.05，表4)。多元逐步回归分析结果表明，循环miR-122表达水平与血清ALT水平独立相 关(e = 0.554，P<0.001;表 4)。
[0094] 结果表明，人循环miR-122水平与肝酶水平显著相关。此外，多元逐步回归分析发 现，人循环miR-122水平与血清ALT浓度独立相关。Wang等研究发现，小鼠血浆miR-122浓度 与ALT水平、肝脏病变成剂量依赖性、暴露时间依赖性相关;较之ALT水平，循环miR-122水平 变化的灵敏度、可信度更高。W后的研究可进一步比较人体循环miR-122水平、ALT水平的灵 敏度、可信度，从而推广循环miR-122水平的临床应用。此外，未来的基础研究可进一步研究 循环miR-122是否具有调控膜岛素敏感性的生物学功能。
【主权项】
1. 一种人循环miR-122的检测方法，包括： 提取血清总RNA作为样品，将样品溶于去核酸酶的蒸馏水中，取部分逆转录为cDNA，进 行miR-122特异性实时荧光定量PCR反应，得到Ct值对芯片反映的结果进行验证，即可。2. 根据权利要求1所述的一种人循环miR-122的检测方法，其特征在于:所述逆转录采 用的逆转录混合液的组成为：5 X逆转录反应液2μ1，逆转录酶mix ΙμL，质控用Spike-In溶 液0.5μ1，去核酸酶的蒸馏水4.5μ1。3. 根据权利要求1所述的一种人循环miR-122的检测方法，其特征在于:所述逆转录条 件为:42°C反应lh，95°C反应5min，随后降至4°C。4. 根据权利要求1所述的一种人循环miR-122的检测方法，其特征在于:所述实时荧光 定量PCR的反应体系为:cDNA模板4μ1，引物ΙμL，2 X SYBR 5μ1。5. 根据权利要求1所述的一种人循环miR-122的检测方法，其特征在于:所述实时荧光 定量PCR的反应条件为:95°C预变性1〇11^11 ;95°(：1〇8,60°(：延伸111^11，45个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK106048037SQ201610527650
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】王卫庆, 王睿, 曹亚南, 洪洁, 顾卫琼, 张翼飞, 石娟
【申请人】上海市内分泌代谢病研究所, 上海交通大学医学院附属瑞金医院