一种基于线粒体dna序列的中国大鲵群体划分方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，包括：(1)采集大鲵样本，并提取基因组DNA；(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；(3)对大鲵样本进行PCR扩增并对PCR扩增产物测序；(4)对获得的序列与参考序列进行比对；(5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。本发明以大鲵线粒体DNA序列作为区别中国大鲵种群的序列标记，通过与参考序列的序列特征进行比对，能够快速准确的对目标种群进行鉴定。可用于对大鲵养殖场的大鲵个体进行鉴定，确定个体来源；在亲本繁殖时可辅助育种选择。还可应用于增殖放流样本的鉴定，确定其所属的群体，然后放流到适合的区域，避免放流群体对野生群体的种质混杂。
【专利说明】
-种基于线粒体DNA序列的中国大銳群体划分方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物鉴定技术领域，具体地说，设及一种基于线粒体DNA序列的中国大 銳群体划分方法。
【背景技术】
[0002] 中国大銳(Andrias davidianus)是现存两栖类当中，体型最大的一种，最大个体 体长可达1米W上，体重可达8公斤W上。中国大銳仅分布于我国，为我国特有，分布区域包 括北京、河北、河南、山西、陕西、甘肃、青海、四川、贵州、湖北、湖南、安徽、江苏、浙江、江西、 福建、广东和广西等省、市、区。由于具有重要的科研和经济价值，市场需要很大，导致中国 大銳过度捕拱，加上栖息地减少，目前大銳野生资源极为稀少，已我国被列为国家二级保护 动物。
[0003] 当前国家在不断加强野生大銳保护的力度，设置有国家级、省级、市县级等各类中 国大銳保护保护区十余个，W保护野生中国大銳资源。同时，我国还有很多规模不一的养殖 场，其繁殖和养殖的大銳不仅用于市场消费，也有部分用于增殖放流，补充野生资源。对大 銳进行保护，不仅要保护大銳的数量，也要保护大銳的遗传多样性。大銳属两栖类动物，生 活依赖河流水体，行动缓慢。山脉水系的隔离、栖息地的破碎化在长期的演化中引起大銳的 地理分化和遗传结构变异。寻找区分不同地理群体的遗传标记，具有很高的应用价值。一方 面，在保护工作实践中，存在遗传分化的每一个群体应作为不同种质资源管理单元，加 W保 护，避免遗传多样性丧失。另一方面，也用于大銳养殖场的亲本来源进行鉴定，区分种质资 源，避免在人工繁殖时造成种质混杂。同时还可W对用于放流的大銳进行鉴定，避免将不同 地理群体的大銳相互放流，造成野生群体种质混杂。
[0004] 目前，一些工作者通过体表花纹辨认不同地理群体的大銳，但是体表花纹并不稳 定，没有固定的标志，难W作为群体划分的标准。国内外有一些报道，采用线粒体DNA分析少 量样本，发现中国大銳群体存在一定的遗传差异，但没有提出明确的群体标记。线粒体DNA 序列变异速率较快，不同隔离群体容易产生可识别的序列标记。因此，利用线粒体DNA序列 作为区别中国大銳群体的标记既方便有可靠。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是现有技术中没有对大銳种群鉴定较为方 便可靠的方法。提供一种基于线粒体DNA序列的中国大銳群体划分方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于线粒体DNA序列的中国大銳群体 划分方法，其特征在于，包括W下步骤：（1)采集大銳样本，并提取基因组DNA; (2)合成大銳 特异线粒体DNA引物；（3)对大銳样本进行PCR扩增并对所述PCR扩增产物测序；（4)对获得的 序列与参考序列进行比对;（5)根据相应位点的序列特征，判断样本所属的群体。
[0007] 进一步的，步骤（2)中所述大銳特异线粒体DNA引物为L14764和H16062,所述 L14764如沈Q ID N0.1，所述H16062如沈Q ID N0.2。
[000引进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增反应体系为:总体积50化，包含10 XPCR buffer 5化、lOmmol/L的dNTPs 0.5化、10曲lol/L的引物L14764和H16062各化LJaq DNA聚合酶2单 位、模板DNA20~l(K)ng，补充灭菌双蒸水至50化。
[0009] 进一步的，步骤(3)中所述PCR扩增反应条件为:94°C预变性3min;94°C变性30s，56 。(:退火30s，72°C延伸90s，35个循环;72°C再延伸8min。
[0010] 进一步的，步骤(3)中所述测序方法为:将所述PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳 检测，采用PCR产物凝胶回收试剂盒纯化回收，利用引物L14764和H16062对回收产物进行双 向测序。
[0011] 进一步的，步骤(4)具体为:将步骤(3)获得的序列与参考序列组进行比对，W所述 序列组的起始序列所设定的位点为准，参照相应位点的序列特征，确定所测的样本归属的 群体。
[0012] 进一步的，步骤(4)中所述种群的特征序列如下：
[0013] P0P1:位点 654 ~903,910~920,927~972缺失，904~909为6〔4616、6〔4646或 GCAGGG，位点 921 ~926 为 CGAATT;
[0014] POP2:位点 654 ~659，664 ~903，910 ~920，930 ~974缺失，位点 660 ~663 为 T，位点 904~909为ACAGAG;
[0015] POP3:位点 654 ~659，664 ~903，910 ~920，929 ~974缺失，位点 660 ~663 为T;位点 904~909为ACAGGG;
[0016] P0P4:位点 653 ~659,664~895缺失，位点593~605为1'刊1'〔4(：1'1'刊4，位点660~ 663为TTTT;
[0017] P0P5:位点 653 ~659,664~895缺失，位点593~605为1'刊〔4(：1'1'1'1'1'〔4，位点660~ 663为TTTT;
[001 引 P0P6:656 ~659,664~896缺失，位点610~619为1'押446601'，位点653~655为41八， 897 ~901 为 GAGAT，973 ~977 为 GAAA，1005 ~1007 为 CAA;
[0019] P0P7:位点 664 ~895缺失，位点 653 ~663 为 AAAATATTTTT，位点 897 ~901 为 ATGTT;
[0020] P0P8:位点 364 ~368 为 GGGGG，位点 664 ~802 为
[0021] GATGTACTTTCTTTTTGCCTATGCAATTCTCCGATCAACCCCAAACAAACTCGGAGGCGTCCTAGCCTTAGGGGCCT CCATTTTCATTTTMTCCTATACCCCTTCTTCATACATCAAAACAACGAGGTTTMTATTCC。
[0022] 进一步的，步骤(4)中所述种群P0P1-P0P8的分布范围如下：
[0023] P0P1群体主要分布在湖南、湖北、河南、陕西、山西、安徽、甘肃、重庆、贵州、云南、 四川、广西融水等地区；
[0024] POP2群体主要分布在广西资源县；
[0025] POP3群体主要分布在河南架川、安徽来榜及陕西安康等地区；
[00%] P0P4群体主要分布在安徽黄山地区；
[0027] P0P5群体主要分布在江西、浙江、安徽来榜等地区；
[00%] P0P6群体主要分布在安徽黄山和浙江丽水部分地区；
[0029] P0P7群体主要分布在湖南永定和龙山、湖北恩施、重庆洁陵和武隆、贵州、云南、广 西融水等地区；
[0030] POPS群体主要分布在广西兴安县。
[0031] 进一步的，步骤(1)中所述采集中国大銳样本，包括罐条、血液、肌肉、新鲜蚁皮、粘 液或口腔上皮细胞。
[0032] 与现有技术相比，本发明可W获得包括W下技术效果：
[0033] 1)本发明W大銳线粒体DNA序列作为区别中国大銳种群的序列标记，通过与参考 序列的序列特征进行比对，能够快速准确的对目标种群进行鉴定。
[0034] 2)本发明的技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。
[0035] 3)本发明中选用的实验试剂均为常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
[0036] 4)本发明可用于对大銳养殖场的大銳个体进行鉴定，确定个体来源;在亲本繁殖 时可辅助育种选择。
[0037] 5)本发明还可应用于增殖放流样本的鉴定，确定其所属的群体，然后放流到适合 的区域，避免放流群体对野生群体的种质混杂。
[0038] 当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到W上所述的所有技术效果。
【具体实施方式】
[0039] W下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手 段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据W实施。
[0040] 实施例
[0041] (1)样本采集及DNA提取
[0042] 在中国广西兴安(GXXA)、湖南龙山化NLS)、江西静安(JXJA)、安徽黄山（A皿S)、湖 北来凤化BLF)、浙江丽水(Z化S)等地采集中国大銳个体。采集的部分或组织可W是少量罐 条、血液、肌肉、新鲜蚁皮，或用灭菌好的棉签刮取口腔上皮细胞等。采用DNA提取试剂盒或 酪氯仿的方法提取基因组DNA。用分光光度计测定DNA的纯度和含量，-20°C保存备用。使用 时DNA浓度调整至lO-lOOng/化。
[00创 （2)引物合成
[0044] 在上海生工生物技术有限公司合成W下引物：
[0045] L14764:5'-ATGAAACAGGGTCAAGCAATCCAAC-3'
[0046] H16062:5' -AGATGAGGGCAGACTCAGTTATG-3'。
[0047] 用灭菌的双蒸水溶解并稀释引物至浓度为10皿o/L。
[004引 （3)PCR扩增及测序
[0049] PCR的反应总体积为50化，其中含10XBuffer(Mgh)5化、Taq酶巧U/U2单位、dNTPs (10mmol/L)0.化L、10皿ol/L的引物各化L、模板DNA20~l(K)ng、灭菌双蒸馈水补至50化。
[00加]反应程序:94°C预变性3min;94°C变性3〇8,56。(：退火3〇3,72。(：延伸9〇3,35个循环； 72°C再延伸8min。
[0051] PCR结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA片段(800-12(K)bp)切下，用胶回收 试剂盒回收纯化。
[0052] 将纯化的DNA片段送到上海生工生物技术有限公司进行测序，采用与PCR扩增相同 的引物进行双向测序。
[0053] (4)序列拼接与比对
[0054] 用Lasergene软件包中Seqman对测序结果进行拼接，并人工校正。将测得的序列与 本发明提供的8条序列(P0P1-P0P8)放在一起，用CLUSTALX进行对位排列。
[0055] (5)结果分析
[0056] 将所测序列与P0P1~P0P8逐条逐位点进行比较，结果见表1，序列上的数字表示序 列的位置;下划线表示样本的序列特征。
[0化7] 表1测定序列与P0P1~P0P8逐条逐位点比较 「00581
[0076]
[0077] 从表1中可W看出，取自湖北来凤县(编号:皿LF517)和湖南龙山县(编号:HNLS70) 大銳的序列在位点654~903,910~920,927~972上缺失;位点921~926序列为〔6441'1';位 点904~909序列为GCAGTG。运些位点的特征与P0P1的序列相同，所W，运些样本属于P0P1群 体。
[007引取自江西静安(编号:JXJA322)和浙江丽水(编号:Z化S535)大銳的序列在位点653 ~659,664~895缺失；位点593~605为口'批4(：1'1'1'口'〔4;位点660~663为1'1'1'1'。运些位点的 特征与P0P5的序列相同，所W，运些样本属于P0P5群体。
[0079] 取自安徽黄山（编号:AHHS474)大銳的序列在位点664~895缺失，位点653~663为 AAAATATTTTT，位点897~901为ATGTT。运些位点的特征与P0P7的序列相同，所W，运个样本 属于P0P7群体。
[0080] 取自广西兴安（编号：GXXA616)大銳的序列在位点364~368为GGGGG，位点664~ 802为
[0081] GATGTACTTTCTTTTTGCCTATGCAATTCTCCGATCAACCCCAAACAAACTCGGAGGCGTCCTAGCCTTAGGGGCCT CCATTTTCATTTTAATCCTATACCCCTTCTTCATACATCAAAACAACGAGGTTTAATATTCC。运些位点的特征 与P0P8的序列相同，所W，运个样本属于P0P8群体。
[0082] 本发明W大銳线粒体DNA序列作为区别中国大銳种群的序列标记，通过与参考序 列的序列特征进行比对，能够快速准确的对目标种群进行鉴定。可用于对大銳养殖场的大 銳个体进行鉴定，确定个体来源;在亲本繁殖时可辅助育种选择。还可应用于增殖放流样本 的鉴定，确定其所属的群体，然后放流到适合的区域，避免放流群体对野生群体的种质混 杂。
[0083] 本发明技术方案，步骤简单，易于操作，重复性好，技术人员易学、易掌握。选用的 实验试剂均为常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。
[0084] 如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术 人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不 W名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的"包含"为 一开放式用语，故应解释成"包含但不限定于"。"大致"是指在可接收的误差范围内，本领域 技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续 描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃W说明本发明的一般原则为目的，并非 用W限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
[0085] 还需要说明的是，术语"包括"、"包含"或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的 包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确 列出的其他要素，或者是还包括为运种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情 况下，由语句"包括一个……"限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还 存在另外的相同要素。
[0086]上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发 明所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，包括以下步骤：（1) 采集大鲵样本，并提取基因组DNA;(2)合成大鲵特异线粒体DNA引物；（3)对大鲵样本进行 PCR扩增并对所述PCR扩增产物测序；（4)对获得的序列与参考序列进行比对；（5)根据相应 位点的序列特征，判断样本所属的群体。2. 如权利要求1所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(2)中所述大鲵特异线粒体DNA引物为L14764和H16062,所述L14764如SEQ ID NO. 1，所述 H16062如SEQ ID N0.2。3. 如权利要求2所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤（3)中所述PCR扩增反应体系为：总体积50yL，包含10XPCR buffer 5yL、10mmol/L的 dNTPs 0.5yL、10ymol/L的引物L14764和H16062各2yL、Taq DNA聚合酶2单位、模板DNA20~ lOOng，补充灭菌双蒸水至50yL。4. 如权利要求3所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(3)中所述PCR扩增反应条件为:94 °C预变性3min; 94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 90s，35个循环；72 °C再延伸8min。5. 如权利要求4所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(3)中所述测序方法为:将所述PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用PCR产物凝 胶回收试剂盒纯化回收，利用所述引物L14764和H16062对回收产物进行双向测序。6. 如权利要求5所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(4)具体为:将步骤(3)获得的序列与参考序列组进行比对，以所述序列组的起始序列所 设定的位点为准，参照相应位点的序列特征，确定所测的样本归属的群体。7. 如权利要求6所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(4)中所述种群的特征序列如下： P0P1:位点 654 ~903，910 ~920，927 ~972 缺失，904 ~909 为 GCAGTG、GCAGAG 或 GCAGGG， 位点 921 ~926 为 CGAATT; POP2:位点 654 ~659，664 ~903，910 ~920，930 ~974缺失，位点 660 ~663 为T，位点 904 ~909为ACAGAG; POP3:位点654~659，664~903，910~920，929~974缺失，位点660~663为^位点卯斗 ~909为ACAGGG; P0P4:位点 653 ~659,664~895缺失，位点593~605为1'1'1'1^4(：1'1'7^，位点660~663为 TTTT； P0P5:位点 653 ~659,664~895缺失，位点593~605为1'1'1^^(：1'1'1'1'1^厶，位点660~663为 TTTT； P0P6:656 ~659,664~896缺失，位点610~619为1'(7^厶6661'，位点653~655为厶了厶，897 ~901为GAGAT，973~977为GAAA，1005~1007为CAA; P0P7:位点 664 ~895缺失，位点 653-663 为 AAAATATTTTT，位点 897 ~901 为 ATGTT; P0P8:位点364~368为GGGGG，位点664~802为 GATGTACTTTCTTTTTGCCTATGCAATTCTCCGATCAACCCCAAACAAACTCGGAGGCGTCCTAGCCTTAGGGGCCT CCATTTTCATTTTAATCCTATACCCCTTCTTCATACATCAAAACAACGAGGTTTAATATTCC。8. 如权利要求7所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(4)中所述种群POP 1-P0P8的分布范围如下： P0P1群体主要分布在湖南、湖北、河南、陕西、山西、安徽、甘肃、重庆、贵州、云南、四川、 广西融水等地区； POP2群体主要分布在广西资源县； POP3群体主要分布在河南栾川、安徽来榜及陕西安康等地区； P0P4群体主要分布在安徽黄山地区； P0P5群体主要分布在江西、浙江、安徽来榜等地区； P0P6群体主要分布在安徽黄山和浙江丽水部分地区； P0P7群体主要分布在湖南永定和龙山、湖北恩施、重庆涪陵和武隆、贵州、云南、广西融 水等地区； P0P8群体主要分布在广西兴安县。9.如权利要求1所述的基于线粒体DNA序列的中国大鲵群体划分方法，其特征在于，步 骤(1)中所述采集中国大鲵样本，包括鳍条、血液、肌肉、新鲜蜕皮、粘液或口腔上皮细胞。
【文档编号】C12Q1/68GK106048038SQ201610528281
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】汪登强, 梁志强, 危起伟, 伍远安
【申请人】中国水产科学研究院长江水产研究所, 湖南省水产科学研究所