一种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒及使用方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测技术，旨在提供一种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒。该试剂盒包括多个冻存管，其中冻存管A装有冻干粉，其成分包括探针法荧光定量PCR预混液试剂，以及用于荧光定量检测的两条引物和一条探针；5个冻存管B分别装有无菌双蒸水；5个冻存管C分别装有TZ裂解液；冻存管D～J共7个，分别装有不同浓度的空肠弯曲菌标准品DNA冻干粉，空肠弯曲菌浓度按十倍递减。本发明空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒是基于对空肠弯曲菌mapA基因设计引物探针以及检测条件的优化而实现的。空肠弯曲菌快速定量检测方法可在短时间内检测并定量样品中的空肠弯曲菌数量，最低检测下限可达102CFU/mL，具有很好的特异性、灵敏性和准确性，方便快捷易操作。
【专利说明】
-种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒及使用方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术，特别设及食品中空肠弯曲菌的快速和定量检测。旨在 建立基于空肠弯曲菌巧光定量PCR快速检测技术，即空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒及使 用方法。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲菌属于弯曲菌属，是一种革兰氏阴性、微量需氧的螺旋状菌，主要引起人 体急性肠炎，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-己利综合症等免疫性损伤性疾 病。1980年，世界卫生组织(WHO)已将弯曲菌肠炎列为最常见传染病之一。2003年，我国国家 食源性疾病监测网将也将弯曲菌列为监测对象。
[0003] 在许多国家，冷链供应了超过一半的食品到达消费者。通常来讲，运种储存方法被 认为可W是一种有效减少细菌的方法，然而新鲜产品的需求不断增加，创造了冷链中新的 风险一一活的不可培养状态细菌(VBNC)。大量病原菌（比如大肠杆菌、鼠伤寒沙口氏菌、霍 乱球菌、幽口螺旋杆菌和李斯特菌)会进入VBNC状态来应对寒冷、高pH值和高渗透压等不同 的环境压力。
[0004] 检测弯曲菌常用传统的培养方法，传统方法耗时长，通常要5~6天才能得到检测 结果。空肠弯曲菌可在环境中W "活的不可培养"状态生存几个星期，传统检测方法不能有 效地检测到运些细菌。因此，W实时定量PCR为基础的、基于遗传基础的检测和鉴别空肠弯 曲菌的方法对食源性微生物的检测尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种空肠弯曲菌快速 定量检测试剂盒及使用方法。
[0006] 为解决技术问题，本发明的解决方案是：
[0007] 提供一种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒，包括多个冻存管，各冻存管的数量和 其中内容物具体是：
[000引（1)序号为A的冻存管1个，装有冻干粉，其成分包括探针法巧光定量PCR预混液试 剂，W及用于巧光定量检测的两条引物和一条探针：
[0009] 引物CJ-F: 5 ' -TGTCAAGCACAACTATTCCTC-3 '
[0010] 引物CJ-R: 5 ' -TAAAAGAAGGGCAAAAGGT-3 '
[0011] 探针legman: 5 ' -FAM-ACCGCATTAAAATTCACATCGACA-TAMRA-3 ' ；
[0012] 该冻干粉通过下述方法制备获得：
[0013] 取探针法巧光定量PCR预混液试剂ImL、所述两条引物各0.化M、探针Taqman 0.2nM，混匀后冻干，备用；
[0014] (2)序号为B的冻存管5个，分别装有无菌双蒸水
[0015] (3)序号为C的冻存管5个，分别装有TZ裂解液ImL
[0016] (4)序号为D~J的冻存管，共7个，分别装有不同浓度的空肠弯曲菌标准品DM冻干 粉;其中，序号为D的冻存管中是空肠弯曲菌浓度为108CFU/mL的菌液DNA，序号为E的冻存管 中是冻存管D中的菌液稀释十倍后菌液的DNA，依次类推。
[0017] 本发明进一步提供了所述空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒的使用方法，包括W下 步骤：
[001引（1)冻存管A的稀释
[0019] 取冻存管B中的无菌双蒸水1.8mL，加至冻存管A中，重悬，充分混匀；
[0020] (2)样品DNA提取
[0021] 取ImL作为待检样品的细菌培养物、水样，或者是W0.01M、抑7.2的无菌憐酸缓冲 盐溶液冲洗固体样品表面的冲洗液;将待检样品W1200化pm离屯、2min，弃上清；用5(K)化无 菌双蒸水重悬沉淀，12000巧m离屯、2min，弃上清;沉淀中加入50化的冻存管C中的TZ裂解液 充分混匀，-20 °C冰箱放置30min;沸水煮lOmin，冰浴lOmin，6000巧m离屯、5min，收集上清液， 作为待检测样品的DNA模板；
[0022] (3)标准品稀释和加样
[0023] 取冻存管B中的无菌双蒸水，分别加50iiL至序号为D~J冻存管中，震荡混匀；取稀 释后的D~J冻存管中含有空肠弯曲菌标准品DNA的液体，并W化L冻存管B中的无菌双蒸水 作为空白对照，分别加入巧光定量PCR管中，每个浓度和空白对照设置2个重复孔;再分别加 入1祉L步骤(1)中的稀释液，混合；
[0024] (4)待检样品加样
[0025] 取化L步骤(2)中提取的待检测样品的DNA模板，加入至巧光定量PCR管中，每个样 品设置2个重复;再分别加入1祉L步骤(1)中的稀释液，混合；
[00%] (5)巧光定量PCR检测
[0027] 取步骤(3)和(4)中加样后的巧光定量PCR管，放入巧光定量PCR仪上进行扩增，条 件为:951：5111111;95°(：1〇36(3,561：3〇36(3,681：3〇36(3采集信号，共40个循环；
[0028] (6)标准曲线绘制
[0029] 根据标准品的Ct值平均值和细菌数量绘制标准曲线；
[0030] (7)待检样品中细菌数的计算
[0031] 含有空肠弯曲菌的样品扩增曲线呈S型，记录样品的Ct值，将待检样品的Ct值与空 肠弯曲菌标准品绘制的标准曲线进行比较，计算得到待检样品中的空肠弯曲菌数量。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0033] 1、本发明通过对空肠弯曲菌mapA基因设计引物探针W及检测条件的优化，开发了 一种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒。
[0034] 2、本发明建立的空肠弯曲菌快速定量检测方法可在短时间内检测并定量样品中 的空肠弯曲菌数量，最低检测下限可达102CFU/mL，具有很好的特异性、灵敏性和准确性，方 便快捷易操作。
【附图说明】
[0035] 图1为根据标准品细菌数量和某次扩增后Ct值绘制的标准曲线；
[0036] 图2为本试剂盒特异性检测一空肠弯曲菌和其他细菌的扩增曲线；
[0037] 图3为本试剂盒敏感性检测梯度浓度空肠弯曲菌；
[0038] 图4为本试剂盒敏感性检测的重复试验；
[0039] 图5为本试剂盒检测模拟污染水样；
[0040] 图6为本试剂盒检测模拟污染鸡肉样品。
[0041] 图3-6中，空屯、方框代表根据巧光定量标准曲线计算出的样品菌落数，实屯、=角形 代表点板计数结果。
【具体实施方式】
[0042] 本发明中的空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒由不同成分的冻存管，可进行80个样 品的检测。
[0043] 本发明的空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒由代号4、8、(：、0、6少、6、山1和1含不同 成分的冻存管组成；1个冻存管A，装有探针法巧光定量PCR预混液试剂，引物(序列分别为 SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2)，探针(序列为沈Q ID N0:3);5个冻存管B，分别含有无菌双蒸 水5个冻存管C，分别含有TZ裂解液ImL冻存管D~J各一个，分别含有不同浓度的空肠 弯曲菌标准品DNA冻干粉，其中，D管为浓度为108CFU/mL空肠弯曲菌溶液的DNA，E管为上述 菌液稀释十倍后菌液的DNA，依次类推，J管为上述菌液连续十倍稀释6次后的菌液DNA，即浓 度为102CFU/mL空肠弯曲菌的DNA。
[0044] 上述引物和探针的序列见表1。
[0045] 表1巧光定量的引物和探针
[0046]
[0047] 空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒的检测步骤如下：
[004引（1)冻存管A的稀释:取冻存管B中的无菌双蒸水1.8mL，加至冻存管A，重悬，充分混 匀；
[0049] (2)样品DNA提取:取ImL作为待检样品的的细菌培养物、水样，或W无菌憐酸缓冲 盐溶液(0.01M pH 7.2)冲洗固体样品表面的冲洗液;将待检样品W1200化pm离屯、2min，弃 上清；用5(K)化无菌双蒸水重悬沉淀，12000巧m离屯、2min，弃上清;沉淀中加入50化的冻存管 C中的TZ裂解液充分混匀，-20°C冰箱放置30min;沸水煮lOmin，冰浴lOmin，6000巧m离屯、 5min，收集上清液，作为待检测样品的DNA模板；
[0050] (3)标准品稀释和加样:取冻存管B中的无菌双蒸水，分别加50化至序号为D~J冻 存管中，震荡混匀;取稀释后的D~J冻存管中（空肠弯曲菌标准品DNA)的液体(W化L冻存管 B中的无菌双蒸水作为空白对照），分别加入巧光定量PCR管中，每个浓度和空白对照设置2 个重复孔;再分别加入步骤(1)的稀释液l祉レ混合；
[0051] (4)待检样品加样:取化L步骤(2)抽提的样品DNA，加入至巧光定量PCR管中，每个 样品设置2个重复;再分别加入步骤(1)的稀释液l祉レ混合；
[0052] (5)检测:取步骤(3)和(4)加样后的巧光定量PCR管，放入巧光定量PCR仪上进行扩 增，条件为:95 °C 5min; 95 °C lOsec，56 °C 30sec，68 °C 30sec采集信号，共40个循环；
[0053] (6)结果判定:含有空肠弯曲菌的样品扩增曲线呈S型，记录样品的Ct值，根据标准 品的Ct值平均值和细菌数量(表2)绘制标准曲线（图2)，将样品的Ct值与空肠弯曲菌标准品 绘制的标准曲线进行比较，计算样品中的空肠弯曲菌数量。
[0054] 表2标准品细菌数量 「AACC1
[0056]具体实施例：
[0化7] -.冻存管组成
[0化引 A管为冻干粉，含有探针法巧光定量PCR预混液试剂(AceQ? qPCR Probe Master Mix,南京诺唯赞的产品），引物和探针(SEQ ID ^:1-3所示）。保存于-20°(：。
[0化9] B管含有无菌双蒸水2mL，保存于-2(TC。
[0060] C管含有TZ裂解液ImL，保存于-20°c。
[0061 ]冻存管D~J分别装有空肠弯曲菌浓度从10化即/mL至102C即/mL的空肠弯曲菌标 准品DNA冻干粉，保存于-20°C。
[0062] 二.加样及检测步骤说明
[0063] 按前述空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒的检测步骤进行操作。
[0064] 下面通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。
[00化]1材料与方法
[0066] 1.1菌株及培养
[0067] 空肠弯曲菌参考菌株为浙江大学动物预防医学研究所分离保存。食物中常见的结 肠弯曲菌（Campylobacter coli)，大肠杆菌化nterobacteriaceae coli)，单核细胞增生李 斯特菌化isteria monoc}ftogenes)，猪链球菌（Streptococcus suis)，肠炎沙口氏菌 (Salmonella enteritidis)，鸡白频沙口氏菌（Salmonella pullorum)，副溶血性弧菌 (Vibrio化rahemolyticus)亦为该研究所保存。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌接种于5mL布氏 肉汤培养基，42 °C微需氧培养4她。其他菌株接种于5mL BHI培养基，37 °C振荡培养过夜。
[0068] 1.2 DNA模板制备
[00例取ImL细菌培养物、水样或者固体样品的PBS冲洗液，12000巧m离屯、2min，弃上清。 用B管中的水悬浮沉淀，12000rpm离屯、2min，弃上清。加入50化的C管中的TZ裂解液充分混 匀，-20 °C冰箱放置30min，沸水煮1 Omin，冰浴1 Omin，6000巧m离屯、5min，收集上清液为模板。
[0070] 1.3标准品的制备
[0071] 将空肠弯曲菌培养物eOOOrpm离屯、lOmin，用PBS重悬沉淀调整菌液0D62日为0.12,此 时空肠弯曲菌浓度约为10化即/mL，连续十倍稀释7次，将8个浓度梯度的菌液分别于哥伦比 亚血琼脂培养基上点板计数，并各取ImL按照上述方法对细菌基因组DNA进行提取。
[0072] 1.4 Real-time PCR体系的建立
[0073] 1.4.1引物设计
[0074]针对空肠弯曲菌中特异性基因 mapA设计一对引物和一条探针(表1)，由上海捷瑞 生物工程有限公司合成。
[00巧]1.4.2 Real-time PCR反应体系及条件
[0076] 通过Real-time PCR体系及条件的优化，确定反应体系为：
[0077]
[007引
[0079]
[0080] 1.4.3特异性试验
[0081] 将空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、猪链球菌、肠炎沙 口氏菌、鸡白频沙口氏菌和副溶血性弧菌分别抽提DNA后用巧光定量方法进行检测，并用水 作为阴性对照，考察巧光定量PCR检测方法的特异性。
[0082] 1.4.4敏感性及重复性试验
[0083] 将空肠弯曲菌培养液调整浓度至约为10化即/mL，连续十倍稀释7次，将8个浓度梯 度的菌液分别于哥伦比亚血琼脂培养基上点板计数并抽提DNA进行巧光定量扩增。根据巧 光定量结果和点板计数的结果来确定此方法的检测下限。重复一次本试验，验证本方法的 重复性。
[0084] 1.4.5模拟样品检测
[0085] (1)模拟污染鸡肉样品
[0086] 将复苏的空肠弯曲菌培养物调整至约为108CFU/mL，十倍稀释至10 3CFU/mL。每个稀 释度取ImL接种5g的鸡肉（鸡肉经C〇60 14kGy福照），待菌液吸附完全后，用20mLPBS振荡混 匀，取稀释液点板计数并抽提DNA进行巧光定量扩增。
[0087] (2)模拟污染水样
[0088] 考虑到水样中有其他数量较多的菌，制备混合菌液来进行巧光定量。调整大肠杆 菌浓度约为109CFU/mL，空肠弯曲菌浓度约为108CFU/mL，两种细菌悬液分别点板计数，然后 将两种细菌悬液等体积混合后十倍稀释，各个稀释度的菌液用试剂盒抽提DNA进行巧光定 量扩增。
[0089] 根据模拟样品的巧光定量结果和点板计数的结果比较来确定此方法在实际样品 中的可行性。
[0090] 1.6实际样品检测加样及检测步骤
[0091 ] 1.6.1取冻存管B中的无菌双蒸水1.8mL，加至冻存管A,重悬，充分混匀；
[0092] 1.6.2取1血的细菌培养物、水样或W无菌憐酸缓冲盐溶液(0.01M pH 7.2)冲洗固 体样品表面的冲洗液，12000rpm离屯、2min，弃上清；用50化L无菌双蒸水重悬沉淀，12000巧m 离屯、2min，弃上清；沉淀中加入50化的冻存管C中的TZ裂解液充分混匀，-20°C冰箱放置 30min;沸水煮lOmin，冰浴lOmin，6000巧m离屯、5min，收集上清液，作为待检测样品的DNA模 板；
[0093] 1.6.3取冻存管B中的无菌双蒸水，分别加入序号为D~J冻存管50化，震荡混匀;取 稀释后的D~J冻存管中（空肠弯曲菌标准品DNA)的液体W及冻存管B中的无菌双蒸水(空白 对照)2化，分别加入巧光定量PCR管中，每个浓度和空白对照设置2个重复孔;再分别加入步 骤1.6.1的稀释液l祉レ混合；
[0094] 1.6.4取2化步骤1.6.2抽提的样品DNA，加入至巧光定量PCR管中，每个样品设置2 个重复;再分别加入步骤1.6.1的稀释液l祉レ混合；
[00巧]1.6.3将PCR管盖上盖子，放入巧光定量PCR仪上进行扩增:95°C5min; (95°C lOsec， 56 °C 30sec，68 °C 30sec 采集信号)40 个循环。
[0096] 2 结果
[0097] 2.1特异性试验
[0098] 空肠弯曲菌经巧光定量PCR扩增出现S型扩增曲线，结肠弯曲菌、大肠杆菌、单核细 胞增生李斯特菌、猪链球菌、肠炎沙口氏菌、鸡白频沙口氏菌和副溶血性弧菌无扩增曲线 (图3)，表明此方法特异性较好。
[0099] 2.2敏感性试验
[0100] 用巧光定量对空肠弯曲菌8个稀释度菌液的DNA样品进行扩增，重复两次，巧光定 量结果和点板计数的结果比较见图4和图5。由标准曲线计算出的结果与实际点板计数结果 比较一致，差异性不显著(P>〇.05)。两次重复试验均表明巧光定量PCR对空肠弯曲菌的最 低检测下限为102CFU/mL。
[0101] 2.3模拟污染样品检测
[0102] 将鸡肉模拟污染及水样模拟污染梯度稀释后抽提的DNA进行巧光定量检测（图5、 6)，结果显示，由巧光定量标准曲线计算出的结果与点板计数结果差异性不显著（P> 0.05)。结果表明在有鸡肉或者数量较大的其他菌干扰时，该方法仍可特异地检测到空肠弯 曲菌，检测下限为10?即/mL。说明建立的该巧光定量方法可W应用于实际样品检测。
[0103] W上结果均证实空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒的可靠性。
【主权项】
1. 一种空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒，其特征在于，包括多个冻存管，各冻存管的数 量和其中内容物具体是： (1) 序号为A的冻存管1个，装有冻干粉，其成分包括探针法荧光定量PCR预混液试剂，以 及用于荧光定量检测的两条引物和一条探针： 引物CJ-F: 5 ' -TGTCAAGCACAACTATTCCTC-3 ' 引物C J-R: 5 ' -TAAAAGAAGGGCAAAAGGT-3 ' 探针Taqman: 5 ' -FAM-ACCGCATTAAAATTCACATCGACA-TAMRA-3 ' ； 该冻干粉通过下述方法制备获得： 取探针法荧光定量PCR预混液试剂lmL、所述两条引物各0.9nM、探针Taqman 0.2nM，混 匀后冻干，备用； (2) 序号为B的冻存管5个，分别装有无菌双蒸水2mL; (3) 序号为C的冻存管5个，分别装有TZ裂解液lmL; (4) 序号为D~J的冻存管，共7个，分别装有不同浓度的空肠弯曲菌标准品DNA冻干粉； 其中，序号为D的冻存管中是空肠弯曲菌浓度为10 8CFU/mL的菌液DNA，序号为E的冻存管中 是冻存管D中的菌液稀释十倍后菌液的DNA，依次类推。2. 权利要求1所述空肠弯曲菌快速定量检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 冻存管A的稀释 取冻存管B中的无菌双蒸水1.8mL，加至冻存管A中，重悬，充分混匀； (2) 样品DNA提取 取11^作为待检样品的细菌培养物、水样，或者是以0.0謂、？!17.2的无菌磷酸缓冲盐溶 液冲洗固体样品表面的冲洗液;将待检样品以12000rpm离心2min，弃上清；用500yL无菌双 蒸水重悬沉淀，12000rpm离心2min，弃上清;沉淀中加入50yL的冻存管C中的TZ裂解液充分 混勾，-20 °C冰箱放置30min;沸水煮lOmin，冰浴lOmin，6000rpm离心5min，收集上清液，作为 待检测样品的DNA模板； (3) 标准品稀释和加样 取冻存管B中的无菌双蒸水，分别加50yL至序号为D~J冻存管中，震荡混匀；取稀释后 的D~J冻存管中含有空肠弯曲菌标准品DNA的液体，并以2yL冻存管B中的无菌双蒸水作为 空白对照，分别加入荧光定量PCR管中，每个浓度和空白对照设置2个重复孔;再分别加入18 yL步骤(1)中的稀释液，混合； (4) 待检样品加样 取2yL步骤(2)中提取的待检测样品的DNA模板，加入至荧光定量PCR管中，每个样品设 置2个重复;再分别加入18yL步骤(1)中的稀释液，混合； (5) 荧光定量PCR检测 取步骤(3)和(4)中加样后的荧光定量PCR管，放入荧光定量PCR仪上进行扩增，条件为： 95°C5min;95°C10sec，56°C30sec，68°C30sec 采集信号，共 40 个循环； (6) 标准曲线绘制 根据标准品的Ct值平均值和细菌数量绘制标准曲线； (7) 待检样品中细菌数的计算 含有空肠弯曲菌的样品扩增曲线呈S型，记录样品的ct值，将待检样品的ct值与空肠弯 曲菌标准品绘制的标准曲线进行比较，计算得到待检样品中的空肠弯曲菌数量。
【文档编号】C12Q1/68GK106048039SQ201610528308
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】李肖梁, 方维焕, 刘玺, 潘航
【申请人】浙江大学