产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸡肠道内源性细菌的分离培养技术，尤其是涉及产蛋鸡肠道内源性芥 子碱降解菌的分尚培养方法。
【背景技术】
[0002] 芥子碱是菜籽柏等十字花科类植物性饲料资源中最重要的一种抗营养因子之一， 其主要不利作用是在肠道内源性微生物的作用下，被最终降解为三甲胺，使动物产生鱼腥 味综合征。对于产蛋鸡，三甲胺会使鸡蛋产生类似鱼腥味的恶臭，严重威胁鸡蛋产品的安全 性。因此，分离培养产蛋鸡肠道具有芥子碱降解功能的细菌并研宄其作用机理是防止鱼腥 味鸡蛋产生的关键分子机制。但目前，还未见对肠道内源性芥子碱降解菌进行研宄的相关 报道。
[0003] CN101392228公开了一种空肠弯曲杆菌的分离培养方法，该方法是对已知菌种进 行分尚培养，培养方法和培养基组成是确定的；CN103184173A公开了一种培养分尚难培 养菌种的培养基，该方法主要适用于从土壤或酸性矿坑水中分离难培养的菌种，其培养基 组分复杂，含各种氨基酸、微量元素、有机酸、糖和维生素等，培养出来的是多种混合菌种； CN103614453A公开了医学微生物学实验胃肠道细菌检测方法，该方法主要是对已知的肠道 常见菌进行分离培养。上述专利申请中涉及的一些微生物分离培养技术为本发明提供了一 些研宄思路，但由于目标菌群的差异，与本发明无论从培养条件还是培养基组成上都存在 较大差异。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种培养基组成简单、培养条件可控性和特异 性强、分离效果好的产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌的分离培养方法。
[0005] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离 培养方法，该方法包括以下步骤：
[0006] 1)富集培养基制备：将NaN03: l-5g ;K 2HP04:0. 5-2g ;MgSO 4. 7H20 :0? 3-2g ;KC1 : 0. 3-2g ;FeS04:0. 01-0. lg ;芥子碱硫氰酸盐：2-5g ;水：800-1200ml混合均匀，倒入瓶中，密 封瓶口后灭菌备用；
[0007] 2)产蛋鸡肠道内容物收集：取空肠和回肠各一段，备用；
[0008] 3)富集培养：在所取肠段样品表面开一切口，将灭菌棉签伸入切口内，尽量将内 容物搅动均匀，取下步骤1)制备的含培养基的灭菌瓶塞，将含肠道内容物的棉签浸入培养 基内，搅动数次，让肠道内容物与培养基充分接触，再塞紧瓶口，将瓶置水浴或空气摇床上 34-37 °C富集培养5-8天；
[0009] 4)分离培养基制备：将 NaN03: l-5g ;K 2HP04:0. 5-2g ;MgSO 4. 7H20 :0? 3-2g ;KC1 : 0? 3-2g ;FeS04:0. 01-0. lg ;芥子碱硫氰酸盐：2-5g ;琼脂：10-30g ;水：800-1200ml，混合均 匀后，倒入培养皿，密封皿口后灭菌备用；
[0010] 5)分离培养：无菌条件下，在步骤3)所得到的富集培养基上挑选单一菌落，接种 到步骤4)所得到的分离培养基上，34-37°C分离培养5-8天，分纯后保种即得。
[0011]本发明的有益效果是：本发明的培养基组成简单、培养条件可控性强、操作简便， 分离效果好，专一性强；采用本发明的培养条件可以有效分离培养出产蛋鸡肠道具有芥子 碱降解功能的菌株。本发明特别适合于产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌的分离培养。
【具体实施方式】
[0012] 本发明方法包括以下步骤：
[0013] 1)富集培养基制备：将似勵3:1-58;1(2册04:0.5-2 8;]\%504.71120:0.3-28;1((：1 : 0. 3-2g ;FeS04:0. 01-0. lg ;芥子碱硫氰酸盐：2-5g ;水：800-1200ml混合均匀，倒入三角瓶， 密封瓶口后灭菌备用；
[0014] 2)产蛋鸡肠道内容物收集：采用颈椎脱白安死术，严格按照无菌操作要求解剖受 术鸡，取空肠和回肠各一段，用灭菌棉线捆扎，分别剪下后置于铺有3层灭菌报纸的白磁盘 上，备用；
[0015] 3)富集培养：在无菌室内，用尖头手术刀在所取肠段样品表面开一切口，将灭菌 棉签伸入切口内，在肠腔内至少打3圈，尽量将内容物搅动均匀，迅速取下步骤1)制备的 含培养基的灭菌三角瓶塞，将含肠道内容物的棉签浸入培养基内，搅动数次，让肠道内容物 与培养基充分接触，再迅速塞紧瓶口，将三角瓶置水浴或空气摇床上34-37 °C富集培养5-8 天；
[0016] 4)分离培养基制备：将似勵3:1-58;1(2册0 4:0.5-28;]\%504.71120:0.3-2 8;1((：1: 0? 3-2g ;FeS04:0. 01-0. lg ;芥子碱硫氰酸盐：2-5g ;琼脂：10-30g ;水：800-1200ml，混合均 匀后，倒入培养皿，密封皿口后灭菌备用；
[0017] 5)分离培养：无菌条件下，在步骤3)所得到的富集培养基上挑选单一菌落，接种 到步骤4)所得到的分离培养基上，34-37°C分离培养5-8天，分纯后保种即得。
[0018] 实施例1
[0019] 产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌富集培养基组成：NaN03:3g ;K 2HP04: lg ; MgS04. 7H20 :0? 5g ;KC1 :0? 5g ;FeS04:0.0 lg ;芥子碱硫氰酸盐：3. 7g ;水：1000ml。分离培养 基组成：NaN03:3g ;K2HP04:lg ;MgS04. 7H20 :0? 5g ;KC1 :0? 5g ;FeS04:0.0 lg ;芥子碱硫氰酸 盐：3. 7g ;琼脂：20g ;水：1000ml。培养条件：水浴摇床上35°C富集培养6天。
[0020] 实施例2
[0021] 产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌富集培养基组成：NaN03: lg ;K 2HP04:0. 5g ; MgS04. 7H20 :0? 3g ;KC1 :0? 3g ;FeS04:0 . 05g ;芥子碱硫氰酸盐：2g ;水：800ml。分离培养基组 成：NaN03:lg ;K2HP04:0. 5g ;MgS04. 7H20 :0? 3g ;KC1 :0? 3g ;FeS04:0 . 05g ;芥子碱硫氰酸盐： 3g ;琼脂：10g ;水：800ml。培养条件：空气摇床上34°C富集培养5天。
[0022] 实施例3
[0023] 产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌富集培养基组成：NaN03:5g ;K 2HP04:2g; MgS04. 7H20 :2g ;KC1 :lg ;FeS04:0. 10g ;芥子碱硫氰酸盐：5g ;水：1200ml。分离培养基组成： NaN03:5g ;K2HP04:2g ;MgS04. 7H20 :2g ;KC1 :lg ;FeS04:0. lg ;芥子碱硫氰酸盐：5g ;琼脂： 50g ;水：1200ml。培养条件：空气摇床上37°C富集培养8天。
[0024] 功效评价试验：
[0025] 将健康产蛋鸡1只，采用颈椎脱白法处死，严格按照无菌操作要求解剖受术鸡，取 回肠样品，用灭菌棉线捆扎，剪下后置于铺有3层灭菌报纸的白磁盘上，备用。设计9个三 角瓶富集培养基，平均分成3组，每组3个重复。3个组的培养基分别按上述实施例1-3配 制，灭菌备用。在无菌室内，用尖头手术刀在所取肠段样品表面开一切口，将灭菌棉签伸入 切口内，在肠腔内至少打3圈，尽量将内容物搅动均匀，迅速将内容物接种到9个含培养基 的三角瓶中。将三角瓶置水浴或空气摇床上培养，培养条件分别同实施例1-3。将培养前后 的富集培养液经微孔滤膜（0.45 ym)过滤，收集滤液，采用分光光度法测定滤液中芥子碱 硫氰酸盐含量，具体结果表1。
[0026] 表1发酵前后情况对照表
[0027]
【主权项】
1. 产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： 1) 富集培养基制备：将恥勵3:1-58;1(2册04:0.5-2 8;]\%504.71120:0.3-28;1((：1 :0.3-28; FeS04:0. 01-0.Ig;芥子碱硫氰酸盐：2-5g;水：800-1200ml混合均匀，倒入瓶中，密封瓶口 后灭菌备用； 2) 产蛋鸡肠道内容物收集：取空肠和回肠各一段，备用； 3) 富集培养：在所取肠段样品表面开一切口，将灭菌棉签伸入切口内，尽量将内容物 搅动均匀，取下步骤1)制备的含培养基的灭菌瓶塞，将含肠道内容物的棉签浸入培养基 内，搅动数次，让肠道内容物与培养基充分接触，再塞紧瓶口，将瓶置水浴或空气摇床上 34-37 °C富集培养5-8天； 4) 分离培养基制备：将恥吣3:1-58;1(2册04:0.5-2 8;]\%504.71120:0.3-28;1((：1 :0.3-28; FeS04:0. 01-0.Ig;芥子碱硫氰酸盐：2-5g;琼脂：10-30g;水：800-1200ml，混合均匀后，倒 入培养皿，密封皿口后灭菌备用； 5) 分离培养：无菌条件下，在步骤3)所得到的富集培养基上挑选单一菌落，接种到步 骤4)所得到的分离培养基上，34-37°C分离培养5-8天，分纯后保种即得。
2. 如权利要求1所述的产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，其特征在于， 步骤2)为：采用颈椎脱白安死术，按照无菌操作要求解剖受术鸡，取空肠和回肠各一段，用 灭菌棉线捆扎，分别剪下后置于铺有3层灭菌报纸的白磁盘上，备用。
3. 如权利要求1所述的产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，其特征在于， 步骤3)为：在无菌室内，用尖头手术刀在所取肠段样品表面开一切口，将灭菌棉签伸入切 口内，在肠腔内至少打3圈，尽量将内容物搅动均匀，取下步骤1)制备的含培养基的灭菌瓶 塞，将含肠道内容物的棉签浸入培养基内，搅动数次，让肠道内容物与培养基充分接触，再 迅速塞紧瓶口，将三角瓶置水浴或空气摇床上34-37°C富集培养5-8天。
4. 如权利要求1所述的产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，其特征在于， 步骤1)所述瓶为三角瓶。
【专利摘要】本发明提供一种培养基组成简单、培养条件可控性和特异性强、分离效果好的产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌的分离培养方法。产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌分离培养方法，该方法包括以下步骤：1)富集培养基制备；2)产蛋鸡肠道内容物收集；3)富集培养；4)分离培养基制备；5)分离培养。本发明的培养基组成简单、培养条件可控性强、操作简便，分离效果好，专一性强；采用本发明的培养条件可以有效分离培养出产蛋鸡肠道具有芥子碱降解功能的菌株。本发明特别适合于产蛋鸡肠道内源性芥子碱降解菌的分离培养。
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20
【公开号】CN104845918
【申请号】CN201510298930
【发明人】余丹, 邹成义, 李斌, 屈东, 陈瑾, 刘进远, 殷勤, 杨加豹, 汪林书, 刘忠敏, 邓卉, 殷明郁
【申请人】四川省畜牧科学研究院
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月3日