一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量检测引物及检测方法。所述引物序列如SEQ ID NO:1?142所示，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推，SEQ ID NO:141?142为一对上下游引物。应用该办法的引物、试剂盒或芯片用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测，可实现多种微生物碳氮磷硫功能基因的同步化检测、使不同基因得以在同一扩增条件下进行检测，提高检测效率；检测精度高，可以检测低至0.001％的目的基因；保留了荧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，同时具有芯片检测的高通量反应的优点，降低了检测成本，结合其他理化数据或微生物指标，可以分析当前生境下的碳氮磷硫元素循环的情况及其影响因素。
【专利说明】
-种微生物碳氮磯硫元素功能基因的高通量检测引物及检测 方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量 检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 微生物是自然界碳氮憐硫元素循环的主要驱动力，通过定量检测微生物碳氮憐硫 的功能基因，可W综合分析不同生境下碳氮憐硫循环的整体水平及其影响因素，为环境健 康和影响评价提供基因水平上的有力证据
[0003] 然而，目前很少有设及微生物碳氮憐硫功能基因的特异性引物设计，一方面源于 科学界对微生物驱动碳氮憐硫元素循环认识的缺乏，另一方面源于同一功能基因在不同微 生物中表现出多态性，增加了引物设计的难度。现公开的功能基因引物专利都是用来检测 功能细菌的，例如检测氨氧化古菌(CN201510185444)和聚憐菌(CN201310042881)，它们分 别对氨氮氨单加氧酶A基因和聚合憐酸盐激酶基因设计特异性引物，并用传统的实时巧光 定量PCR方法进行定量检测。尽管该方法具有高灵敏度和准确度，但由于不同的特异性引物 自身长度、碱基比例、扩增片段的大小不同，进行PCR反应时所需的退火溫度、延伸时间、扩 增程序也不同，例如，用于氨氧化古菌检测的PCR扩增程序为95°C变性453、54°(：退火1111^、 72°C延伸Imin，而用于聚憐菌的检测的PCR扩增程序为95°C变性40s、A°C退火lmin、72°C延 伸2min(其中A与它设计的5个特异性引物有关，分别为61、58、61、66和63°〇，因而难^设计 多种不同的功能基因，并使其在同一条件下进行扩增检测。随着越来越多的微生物功能需 要研究，就需要有可W同时检测多种微生物功能基因的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量检测引物，可 用于同步、平行和高效检测的高通量定量检测微生物碳氮憐硫元素功能基因的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量检 测引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO: 1-142所示，其中SEQ ID NO: 1和2为一对 上下游引物，SEQ ID N0:3和4为一对上下游引物，W此类推，SEQ ID NO: 141-142为一对上 下游引物。
[0006] 另外一方面，本发明还提供一种一种微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1的引物。
[0007] 另外一方面，本发明还提供一种一种微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 检测忍片，其特征在于，所述忍片含有所述引物或所述试剂盒中的引物。
[000引另外一方面，本发明还提供一种用于微生物碳氮憐硫元素功能基因的高通量定量 检测方法，其特征在于，步骤为，
[0009] 提取DNA样品；
[0010] PCR扩增:采用所述引物或所述试剂盒中的引物或所述忍片进行PCR扩增;所述对 照引物为沈Q ID NO :143-144;
[0011]
[0012]
[OOU] 其中，CN为基因丰度，RA为相对丰度，CNcnps为碳氮憐硫功能基因的丰度，CNi6s为 16S rRNA的丰度；
[0014] 进一步，所述PCR扩增的程序为，95°C预变性5min; 95°C，30s，40个循环;62°C，30s 退火，72°C，30s延伸，最后从72°C开始升溫至97°C，升溫速率为4°C/s，W每0.4°C -个测量 点对引物的溶解曲线进行测定。
[001引表1引物相关倍島表
[0016]
[0021]
[0022] DM样品的制备
[0023] 本方法适用于各类环境样本的DM。使用区城〇扣乂《±壤0魁提取试剂盒(MP生物医 药，美国）提取±壤样品DNA，每个样品需0.5-1.0邑±壤，其余类型环境样本请采用对应的提 取试剂盒按说明书进行提取。DNA质量用化no化op ND-2000分光光度计(赛默科技，美国）测 定的OD260/280值来确定，数值在1.6-1.9之间表示0麻可用。0麻浓度使用〇113〇1!下!〇山'"双链 DNA试剂盒(普洛麦格，美国）进行测定，一次功能基因定量至少需要有10微升30ng/化的DNA 样品。
[0024] 忍片的制备
[0025] 本方法采用多样品纳米分配器(WaferGen生物系统，美国）对引物和DNA样品在 Smad^ip纳米忍片(Waf erGen生物系统，美国）上进行分配，其中忍片共有72 X 72个纳米 孔，可支持5184个巧光定量PCR反应。本方法采用80个引物X64个样品的方案进行巧光定量 PCR检测。需要准备的材料为20皿ol/L的牛血清白蛋白水溶液、2块Nunc?384无酶孔板(赛 默科技，美国）、技oche?Li曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix(罗氏制药，美国）、去除核 酸的PCR级高纯水(罗氏制药，美国）和Wafe巧巧?忍片试剂盒。
[00%] 引物分配前，预先制备PCR反应液1(混合69化化ight切cler 480DNA SYBR Green I Mix和41化L高纯水），之后按照图1所示，在384孔板中前6列的相应位置分别加入12.1化 PCR反应液I和3.化L引物混合液。同样地，DNA样品分配前，预先制备PCR反应液II (混合61化 LLi曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix、122化牛血清白蛋白水溶液和24化L高纯水），之 后按照图2所示，在384孔板中前4列的相应位置分别加入12.9化PCR反应液II和3.化L DNA 样品，一个忍片反应最多可支持64个DNA样品。
[0027] 开始分配时，选择mRNA表达分析模式，选择MyDesign下的80个引物和64个样品分 配方案，并进行样品分配。分配过程为自动化操作过程。引物和样品分配后都需要将忍片离 屯、，第一次离屯、为3300转/minx 5min，第二次离屯、为3300转/minx 15min。离屯、完的忍片贴 膜后等待PCR检测。
[002引高通量巧光定量PCR检测
[00巧]高通量巧光定量PCR检测器为Smad^ip实时PCR系统(WaferGen生物系统，美国）。 PCR程序为95°C预变性5min，40个循环的变性(95°C X30s)、退火(62°CX30s)和延伸（72°C X30s)，最后从72°C开始升溫至97°C，W每0.4°C-个测量点对引物的溶解曲线进行测定。 PCR程序完成后，软件将自动分析并导出数据。
[0030] 有益效果
[0031] 1)本发明实现了多种微生物碳氮憐硫功能基因的同步化检测；
[0032] 2)调整和优化了引物的结构和产物的大小，使不同基因得W在同一扩增条件下进 行检测，提局检测效率；
[0033] 3)可W检测低至0.001 %的目的基因，检测精度高；
[0034] 4)保留了巧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，同时具有忍片检测的高通量反 应的优点，降低了检测成本；
[0035] 5)结合其他理化数据或微生物指标，可W分析当前生境下的碳氮憐硫元素循环的 情况及其影响因素。
【附图说明】
[0036] 图1是忍片制备中引物和对照在384孔板中的分配方案图。
[0037] 图2是忍片制备中DNA样品在384孔板中的分配方案图。
[0038] 图3是实施例1中的DNA样品和对照在384孔板中的分配方案图。
【具体实施方式】
[0039] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例 中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明 书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市购获得的常规产品。
[0040] 实施例1:
[0041] 现^±壤样本为实施例，对本发明的高通量检测方法做进一步阐述
[0042] 1、±壤样本描述
[0043] ±壤样本来源于中国科学院封丘农业-生态试验站27年长期施肥±壤，共7种不同 的施肥方式:不施肥(CK)、施氮钟肥(NK)、施氮憐肥(NP)、施憐钟肥(PK)、施氮憐钟肥(NPK)、 施有机肥(CM)和施有机肥和氮憐钟肥各半的混合肥（1/20MN)，其中有机肥为玉米杆、豆饼 和棉巧饼的混合物，混合重量比例为100 :40:45。每个处理每年的氮肥施用量为150kg/ha (CK和PK除外），憐肥施用量为75kg/ha(CK和NK除外），钟肥施用量为150kg/ha(CK和NP除 外）。±壤采样时的当季作物为玉米。采样方式为相同处理内随机取5个不同位置的表层± (0-15cm)，将其均匀混合后作为一个样品，每个处理取4个样品，共28个样品。
[0044] 2、样本DNA提取
[0045] 取每个±壤样本0.5g，川Fas…NA化±壤0論提取试剂盒提取±壤0歴，分别用 化no化op ND-2000分光光度计和QuariliFlou愧双链DNA试剂盒对提取的DNA质量和浓度进 行检巧U(表2)，可W看出，所有DNA的0D260/280均处于1.6-1.9之间，浓度大于30ngAiL，每个 样品提取10化L DNA溶液，满足后续定量实验要求。
[0046] 表2 DNA质量和浓度检测表
[nru7l
[004引
[0049] 3、忍片准备
[0050] 按本发明方法，将合成的引物制成引物混合液后如图1所示加入到384孔板前6列 (预先制备PCR反应液1(混合69化L Li曲t切cler 480DNA SYBR Green I Mix和41化L高纯 水），按照图1所示，在384孔板中前6列的相应位置分别加入12.化L PCR反应液巧日3.化L引 物混合液），之后用多样品纳米分配器将引物分配到一片Samrtchip忍片上，将忍片3300转/ min离屯、5min。将28个样品如图3所示，加入到新的384孔板前4列(预先制备PCR反应液II (混 合610化Light切cler 480DNA SYBR Green I Mix、122化牛血清白蛋白水溶液和24化L高 纯水），按照图2所示，在384孔板中前4列的相应位置分别加入12.9化PCR反应液II和3.化L DNA样品），此0样品位置加入与DNA等量的高纯水，作为阴性对照。运样，每个DNA样品都有2 个计数平行。之后再用多样品纳米分配器将DNA样品分配到同一 SmadcMp忍片上(开始分 配时，选择mRNA表达分析模式，选择MyDesign下的80个引物和64个样品分配方案，并进行样 品分配。分配过程为自动化操作过程。）引物和DNA样品分配后都需要将忍片离屯、，第一次离 屯、为3300转/minx 5min，第二次离屯、为3300转/minx 15min。离屯、后的忍片贴膜后等待定 量。
[0051 ] 4、高通量巧光定量和数据处理
[0化2]用Smart化ip实时PCR系统(WaferGen生物系统，美国）对忍片进行高通量定量检 测，检测的PCR程序为95°C预变性5min，40个循环的变性(95°CX30s)、退火(62°CX30s)和 延伸（72°C X 30s)，最后从72°C开始升溫至97 °C，升溫速率为4°C/s，W每0.4°C -个测量点 对引物的溶解曲线进行测定。PCR程序完成后，软件将自动分析并导出数据。检测完毕后，导 出的数据按W下条件进行筛选：1)扩增效率需在90%-110%之间；2)循环临界值(Ct)必须 小于31 ;3)两个计数平行样品同时得到扩增的认定为有效扩增。筛选后的数据计算相对丰 度(RA):
[0化3]
[0化4]
[00对其中，CN为基因丰度，CNcnps为碳氮憐硫功能基因的丰度，CN16S为16S rRNA的丰度。
[0056] 每个施肥处理的碳氮憐硫功能基因相对丰度为4个平行样品的平均值，结果见表 3。
[0057] 表3碳氮憐硫功能基因的相对丰度（％ )和平均变异系数SV( % )表 [00581
[0061]
[0062] 由于每个基因在微生物中表达量存在很大差异，并且不同环境来源的微生物种类 也存在很大差异，因而每个基因的相对丰度也存在较大不同。下面就该±壤中不同功能基 因含量差异进行分析，仅供参考。
[0063] acsA表达碳单氧化物水解酶，用于形成乙酷辅酶A合成酶并将C0和也0氧化成C〇2， 是微生物体内的常见基因，本实例中其相对丰度为36.496-45.433 %，氮元素添加对acsA的 表达有益，因此除PK外，其余处理的基因丰度都高于CK"acsE编码铁硫蛋白甲基转移酶，将 甲基四氨叶酸的甲基转移到铁硫蛋白上，是细胞内电子传递和能量传递的关键环节，应具 有较高表达量，本例中其相对丰度为12.676-15.395 %。gam编码葡萄糖氧化酶，是微生物葡 萄糖利用的胞外酶，由于葡萄糖是最广泛存在也是容易被微生物利用的碳源，其丰度值应 较高，本例中其相对丰度为16.924-20.394%，憐肥施用可能对其有降低效果。met表达C1- C4 CoA转移酶，参与炭基转移和甲基天冬氨酸循环，是S簇酸循环中重要的供能步骤之一， 应具有高表达量，本实例中其相对丰度为53.231-63.333 %，施肥处理能明显提高该基因的 相对丰度。amyX、exc和pox分别编码普鲁兰酶、几下质酶和酪氧化酶，有很强的底物特异性， 只针对普鲁兰糖、几下质和多酪类难降解有机物有效，其丰度与±壤中特异性底物浓度的 多少有关，因此可能具有较低的基因丰度，本例中它们的丰度仅分别为0.002-0.007%、 0.002-0.003 %和0.043-0.067 % 〇mcrA编码甲基辅酶A还原酶，是厌氧条件下生成甲烧的关 键基因，仅存在于特定的甲烧产生菌上，与所处的厌氧环境密切相关，因而表达量因±壤的 采样位置而异，本例中其表达量为0.002-0.015%，运与采样时取±为表层±有关。ureC基 因是微生物降解有机氮的关键基因，能够降解尿素形成氨和二氧化碳，而尿素是农业施肥 常用的氮肥，其相对丰度值在农业±壤上应较高，本例中其相对丰度为18.633-21.475%。 hzo编码联氨氧化酶，hzsA和hzsB均为联氨合成酶基因，=者均用于调控±壤的厌氧氨氧化 过程，只有厌氧环境下的特定菌群具备该基因，因此表达量较低，本例中=者的表达量分别 为0.001-0.002%、0.001-0.002%和0.017-0.024% ehao基因编码径胺氧化还原酶，主导径 胺形成亚硝酸或者化0的过程，而nosZl和nosZ2均用于表达氧化亚氮还原酶，主导者化0还原 成化的过程，它们是氮元素循环硝化与反硝化过程的关键基因，应具有较高的表达水平，在 本例中它们的相对丰度分别为 13.928-18.175%、11.971-14.247 %和 13.412-15.524%。 PPX表达外切聚憐酸酶，用于调控胞内多聚憐酸降解，形成单憐酸盐广泛用于其它生理生化 反应，是细胞内憐元素供应的中枢环节，应具有高表达水平，本实例中其相对丰度为 44.742-53.041 %，施肥处理能明显提高该基因的相对丰度。地oD和地nK被广泛用于检测碱 性憐酸酶(断裂C-0键)和C-P裂解酶(断裂C-P键），分别用于胞外有机憐降解利用和胞内C-P 信号分子的合成与降解，是常见的憐循环基因，应具有较高的表达水平，在本例中它们的表 达量分别为11.624-13.091 %和16.903-19.731 %，施肥过程能显著提高它们的相对丰度。 cphy是半脫氨酸植酸酶的编码基因，常见于海洋菌分泌的植酸酶，在±壤中含量较低，在本 例中其表达量仅为0.005-0.008% DapsA是硫酸盐同化菌的特征基因，±壤硫循环无机硫活 化的关键基因，应具有较高的表达水平，本例中其相对丰度为21.424-26.942%，施肥处理 能明显提高该基因的相对丰度。
[0064] 其余基因的表达量均在1-10%之间，是功能基因相对丰度的常见范围。
[0065] 现举例说明，如何判断不同处理间的实验结果。
[0066] 通过与不施肥(CK)处理进行对比，可W得到施加相应肥料后±壤微生物相关基因 含量的变化，现W CK和0M为例进行说明。相比于不施肥对照组（CK)，除f rdA、amyX、mcrA、 ni巧和cphy之外，施加有机肥(OM)对其余所有基因都有显著的提高。有报道表明，有机肥能 够增加±壤有机质含量，给±壤微生物带来丰富的物质和能量来源，提高±壤微生物多样 性和活力。因此，施加有机肥能全面提高微生物对±壤碳氮憐硫循环的促进作用。
[0067] 将不同施肥组进行比较，可W得到相应元素添加对功能基因含量的影响，现WPK 和NPK为例进行说明。将PK和NPK处理作对比，可W分析氮肥施加对功能基因的影响。可W发 现，施加氮肥(尿素）后，除rb化、smtA、mct和frdA外，其余固碳及碳循环基因的相对丰度均 得到显著性提升，并且大部分碳化合物降解基因（包括gam、abfA、xylA、exg、exoPG、nmp、 Isop、amyX、apu、glx和lig)均得到显著性增加。有报道表明，氮是构成微生物体内参与元素 循环过程中重要酶的组成成分，氮肥的施加增加了微生物对碳元素的利用和转化能力，而 碳元素的固定和转化也为氮元素的循环过程提供了能量支持，因而施加氮元素有利于促进 ±壤碳循环过程。然而大多数的氮相关基因却显著降低，包括脈酶基因 ureC、氨氧化细菌 amoA2、氨氧化古菌amoB、径胺氧化还原酶hao、亚硝酸盐还原酶nxrA、ni;rKl、ni;rK2和ni;rK3、 硝酸盐还原酶napA和nasAW及氧化亚氮还原酶nosZ2。有报道表明，长期施加氮肥可能使作 物减少根系分泌物的分泌，从而降低对微生物单循环相关基因的刺激及促进作用；另外，长 期施加氮肥可能使±壤微生物对氮元素产生依赖，从而降低了某些氮利用基因的丰度，从 而减缓了氮元素的微生物循环效率。因此，从整体上看，长期施加氮肥，对±壤氮元素的循 环过程可能产生副作用。另外，氮肥施加对无机解憐基因 pqqC和植酸酶基因 bpp都有促进作 用。有报道表明，憐元素由于±壤缓冲和金属离子的作用而难W被作物利用，而施加氮肥不 仅可W降低抑，还能提高微生物释放有机酸阴离子的能力，从而竞争性馨合金属离子，释放 憐酸盐，提高上壤速效憐的含量。
[0068] 此外，该忍片方法可W同时检测到71种碳氮憐硫功能基因的基因丰度，并且能够 检测到0.001%水平的功能基因相对丰度，检测精度高，提高了检测效率，降低了检测成本。 从平均变异系数上看，变异范围在6.1-24.9%之间，整体准确度高。
[0069] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可W理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨 的情况下在本发明的范围内可W对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测引物，其特征在于，所述引物 序列如3￡〇10勵：1-142所示，其中5￡〇10勵：1和2为一对上下游引物，5￡〇10勵:3和4为 一对上下游引物，以此类推至SEQ ID NO: 141-142为一对上下游引物。2. -种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒含有权利要求1的引物。3. -种微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测芯片，其特征在于，所述芯片 含有权利要求1的引物或权利要求2试剂盒中的引物。4. 一种用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测方法，其特征在于，步骤 为， 提取DNA样品； PCR扩增:采用权利要求1的引物或权利要求2试剂盒中的引物或权利要求3的芯片进行 PCR扩增;所述对照引物为SEQ ID NO: 143-144; 结果计算及判断其中，CN为基因丰度，RA为相对丰度，CNcnps为碳氮磷硫功能基因的丰度，CN16S为16S rRNA的丰度。5. 权利要求4所述用于微生物碳氮磷硫元素功能基因的高通量定量检测方法，其特征 在于，所述PCR扩增的程序为，95°C预变性5min; 95°C，30s，40个循环;62°C，30s退火，72°C， 30s延伸，最后从72°C开始升温至97°C，升温速率为4°C/s，以每0.4°C-个测量点对引物的 溶解曲线进行测定。
【文档编号】C12Q1/68GK106048041SQ201610537546
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】朱永官, 郑邦晓, 苏建强, 李虎, 姚槐应
【申请人】中国科学院城市环境研究所