双孢蘑菇ssr分子标记特异引物体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体设及双抱磨茹SSR分子标记特异引物体系 及其应用。 技术背景
[000引双抱磨茹（心sriciwAi巧wrus)的人工栽培迄今已有300多年的历史，是当今世 界上第一大宗食用菌。因其味道鲜美、营养丰富，深受人们的喜爱，在世界各地广为栽培， 尤其是近几年来，双抱磨茹的商业化、规模化栽培模式发展更是迅速。双抱磨茹在我国福 建等省已有大规模的规范化栽培，国内出口量已占世界第一位。
[0003] 随着人们对食用菌营养价值和药用价值认识的提高，食用菌的遗传研究已成为关 注的热点之一。近年来，分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的 发展。而食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很 好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。形态鉴别 不能准确反映被鉴定物种的分类地位，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。同时，食 用菌中同物异名的现象非常严重，严重的影响双抱磨茹的生产和知识产权的保护，极大地 损害了育种者和生产者的利益。因此，利用分子标记技术对双抱磨茹的菌种进行分子水平 的鉴定，结合农艺性状进行综合分析，对双抱磨茹的菌种利用和保护，W及功能基因的开发 具有重要的意义。目前，国外针对双抱磨茹的SSR分子标记只有33对，国内还没有针对双 抱磨茹遗传多样性和菌种鉴定的专用SSR分子标记。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决双抱磨茹同物异名、异物同名的问题，而提供一种双抱 磨茹SSR分子标记特异引物体系及其应用。
[000引双抱磨茹SSR分子标记特异引物体系，序列如下所示：
[0006] 本发明的又一个目的是提供一种双抱磨茹SSR分子标记特异引物体系在菌种鉴 定方面的应用。
[0007] 本发明提供了 8个新SSR分子标记和2个已有SSR分子标记的有效组合，并将它 们应用于菌种鉴定。W22个特异菌株的DNA为模板，分别利用10对SSR引物进行PCR扩 增，每对引物扩增后进行丙締酷胺凝胶电泳，根据22个样品扩增出的所有电泳条带进行带 型统计分析，从而确定每对引物的标准带型。然后将每个样品的10对引物的标准带型进行 组合，构建双抱磨茹22个不同菌株的分子身份证。本发明对于双抱磨茹的资源鉴定、保护 和开发利用具有重要意义。
【附图说明】
[0008]图 1AbSSR0：M和AbSSR035 产生的带型（AbSSR0：M泳道为菌株CCMJA3 ;AbSSR035 泳道为菌株CCMJA3); 图 2AbSSR005 产生的带型(泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA6、CCMJA41、CCMJA27、CCMJA43、CCMJA44、CCMJA47、CCMJA54、CCMJA57、CCMJA58); 图 3AbSSR013 产生的带型(泳道依次为菌株CCMJA17、CCMJA3、CCMJA14、CCMJA56、CCMJA21、CCMJA44、CCMJA39、CCMJA47、CCMJA58); 图 4AbSSR015 产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA4、CCMJA2、CCMJA15、CCMJA51、CCMJA44、CCMJA9、CCMJA47、CCMJA57); 图 5AbSSROie产生的带型(泳道依次为菌株CCMJA5、CCMJA48、CCMJA13、CCMJA29、CCMJA33、CCMJA43、CCMJA47、CCMJA57、CCMJA58、CCMJA59); 图 6AbSSRO18 产生的带型(泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA3、CCMJA47、CCMJA29、CCMJA54、CCMJA58); 图 7AbSSR084 产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA22、CCMJA29、CCMJA57、CCMJA58)； 图8AbSSR6产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA3、CCMJA7、CCMJA54、CCMJA29、CCMJA44、CCMJA47); 图9AbSSR36产生的带型（泳道依次为菌株CCMJA7、CCMJA18、CCMJA3、CCMJA32、CCMJA27、CCMJA47、CCMJA57)。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1双抱磨茹EST-SSR标记引物的开发 一、SSR引物设计和合成： 从JGI数据库中双抱磨茹H97基因组数据（version2. 0)化ttp://genome.jgi-psf.org/.)捜索并下载，利用MISA(ht1:p://pgrc.ipk-gatersleben.de/tools.php)捜索SSR, 捜索标准为：二、Ξ、四、五、六核巧酸的最少重复次数大于等于5次。
[0010] 利用引物设计软件Primer3. 0在含有SSR位点的序列中设计引物。SSR引物设定 参数为：（1)GC含量为45%-60% ; (2)退火溫度为60°C; (3)预期片段长度在150-300bp之 间；（4)引物长度在18-27bp之间。
[0011] 二、SSR引物的筛选 (1)利用康为世纪的基因组提取试剂盒提取待鉴定样品总DNA; 似利用随机的10个双抱磨茹菌株对设计的SSR分子标记引物进行初筛步骤（1) 提取的总DM为模板，利用上述设计的100对引物进行PCR扩增。PCR反应用BioRadPCR仪。PCR扩增条件如下：95°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s， 共计30个循环；72°C延伸10min。PCR采用20μL反应体系：DM20 -50ng，10X缓冲液 2.OuL，2. 5ml的dNTPs2. 0uL，Taq酶 0. 25μL，浓度为 10uM的上游引物溶液 0. 3μL，浓 度为10uM的下游引物0. 3μL，添加d地20至体系体积为20uL; (3) 将步骤（2)PCR扩增后的产物进行8%聚丙締酷胺凝胶，电泳后利用硝酸银进行银染 显影。具体步骤如下：将步骤（2)中PCR扩增后的产物与上样缓冲液混匀后，取0. 5μL点 样，进行电泳分离，电极缓冲液为1XΤΒΕ(TriS-棚酸），在25°C、240V恒压下电泳1-1.化。 电泳完毕后，用d地20先清洗胶板两次，然后用硝酸银溶液缓慢摇动并固定5-8分钟，然后 用d地2〇漂洗2次；将漂洗后的胶板用含有1. 5%氨氧化钢和0. 5%甲醒的溶液染色5-8分 钟；缓慢摇动，直到条带清晰，然后用d地2〇漂洗，惊干，照相记录。上述电泳在核酸电泳系 统度io-Rad，USA)中进行； (4) 然后观察记录成像结果，选取条带清晰稳定、多态性好的SSR引物进行复筛。复筛 利用全世界收集到的59个双抱磨茹菌株(表3)为基本群体，选取10对SSR分子标记引物 鉴定收集到的59个菌株中有多少个菌株是不同的，按照初筛的PCR条件和体系进行PCR和 电泳实验，根据电泳条带的观察记录成像结果，判定菌株的异同。最终从53个SSR分子标 记巧1)选取10对引物巧2)进行菌种身份证的构建。
[0012] 表1有多态性的53个SSR分子标记
表2 10个SSR分子标记特征
表3双抱磨茹菌种信息
实施例2双抱磨茹SSR标记引物在品种鉴定中的应用 选出多态性的和特异性好的10对SSR分子标记对上述筛选出的不同的菌株进行电子 分子身份证的构建。具体步骤如下： 1)每个引物59个菌株的PCR产物同样进行步骤（3)中的8%聚丙締酷胺凝胶电泳，然 后统计不同电泳带型，确定59个菌株是否为同一个菌株。结果表明59个菌株中有22个特 异菌株，其余分不开的37个菌株分成7类： 第一类：与CCMJA29相同的菌株为CCMJA9、CCMJA21 ; 第二类：与CCMJA33相同的菌