一种银杏品种分子检测引物组合物及其品种检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物新品种鉴定技术领域，涉及一种银杏品种分子检测引物组合物及 其品种检测方法，专用于银杏果用品种的快速分子检测和鉴定。
【背景技术】
[0002] 银杏（GinkgobiIobaL)是现存的种子植物中最古老的物种，被誉为历 史和现实的珍稀纽带[Hui-LinL.Ginkgo-themaidenhairtree[J].Amer.Hort. Mag，1961，40:239-249.]。它具有树体高大挺拔、树形姿态多变优美、寿命极长等特点，同时 又集果、叶、材等用途于一身，具有较高的经济、生态和文化价值[曹福亮.中国银杏志[M]. 中国林业出版社，2007.]。中国作为世界银杏的分布中心，拥有世界银杏种质资源90%以 上。随着其价值的不断被发现，自20世纪80年代，银杏的良种选育与推广逐渐受到重视， 就目前为止银杏栽培品种可以分为核用品种、叶用品种、雄株品种、观赏品种和材用品种5 大类[刑世岩.中国银杏种质资源[M].中国林业出版社.2013]。其中，银杏核用品种较 多，其分类多依据其来源以及某些种子特征，未有一个较为系统的分类方法，且品种命名方 面也较为随意，存在同名异物或异名同物的现象，为银杏品种鉴定造成诸多不便。
[0003] 传统的植物品种鉴定是基于形态学水平的，主要通过植物的某些表型特征对其加 以区分与鉴定，该方法在品种较少、表型特征差异明显时较为可行。随着品种数目的不断增 加，品种间差异逐渐缩小，且表型特征有时会随着环境的改变而发生变化，单独依靠形态学 水平已很难达到对品种有效鉴定的目的了。我国银杏品种繁多且用途广泛，而近年来所选 育的品种也多为核用品种，且选育手段集中为选择育种和无性系育种[郝明灼，曹福亮， 汪贵斌，等.银杏杂交育种研究现状及展望[J].林业科技开发，2006, 19 (6) : 5-8.]，使得 各品种间的差异越来越小，为银杏品种区分增加了难度。此外，在栽培过程中也出现了不少 变异品种，银杏优良品种交易市场上也常有假冒伪劣品种滥竽充数。一系列问题的出现使 银杏优良品种有效鉴定方法的建立显得越发重要。因此，现急需一种快速、方便、可靠的银 杏品种分子鉴定技术。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种银杏品种分子 检测引物组合物，克服以往银杏果用品种鉴定方法存在的缺陷，提供结果高度准确可靠、易 于操作、灵敏度高的分子检测和诊断方法。本发明的另一目的是提供一种使用银杏品种分 子检测引物组合物快速检测银杏品种方法，该方法可以直接应用于生产实践，对于银杏果 用苗木的鉴定具有十分重要的意义。
[0005] 技术方案，为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种银杏品种分子检测引物组合物，包括8对引物，其引物序列如下表所示：
[0007]
[0011]。
[0012] 使用所述银杏品种分子检测引物组合物快速鉴定银杏品种的方法，包括以下步 骤：
[0013] 1)待测样品DNA提取；
[0014] 2)PCR扩增；使用相同的反应体系和反应程序，按权利要求1表格中的引物顺序依 次对银杏的样本进行PCR扩增，直至完成鉴定；
[0015] 10y1反应体系中包括：10Xbuffer1 ;0? 2mmol/l dNTP ;2. 5mmol/l MgC12 ; 0? 2ymol/1 SSR引物；IUTaq DNA聚合酶和40ng DNA模版。
[0016]PCR反应程序为：预变性94°C5min;30循环的94°C30s，最佳Tm55°C30s， 72°C40s;延伸 72°Clm，最终 10°C保存；
[0017] 3)对PCR产物用8%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对PCR扩增产 物进行检测，根据扩增产物的有无和扩增产物大小来判定结果。
[0018] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：
[0019] 1)结果高度准确、可靠：本发明所用银杏果用材料来自江苏、山东、广西、浙江等 银杏主要分布区，品种涵盖面较广，并利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100%准确，为 检测结果提供了高度的可靠性。
[0020] 2)操作简便快速：本实验方法对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰 胺凝胶电泳后即可以判断结果。一般整个检测过程可在6个小时内完成。
[0021] 3)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板DNA40ng即可准确鉴定其所 属种。
[0022] 4)取材方便、经济效益明显：本方法实验采样方便，叶片、冬芽、花等组织或器官 均可为实验材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点限制。通过对银杏苗木 进行分子鉴定可以避免苗木生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于银杏不同品种的 苗木生产与销售具有十分重要的经济效益。
【附图说明】
[0023] 图1为引物Gb_gSSR 150对48个银杏果用品种的基因组DNA样本的PCR扩增电 泳图。
[0024]图2为本发明中的8对SSR引物利用相同模板进行扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝 胶电泳图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0026] 实施例1
[0027] 采用454GSFLX高通量测序仪，分别对银杏的雌株花芽和幼叶的RNA及银杏DNA进 行测序得到银杏EST和基因组序列，利用MISA软件对所得序列进行SSR位点的寻找，利用 Primer5. 0软件进行引物设计。最后成功设计556对EST-SSR引物，有417对引物能够稳 定扩增；设计432对基因组SSR引物，随机合成200对引物，有132对可以稳定扩增。从银杏 果用品种材料中随机选取6个个体对可稳定扩增的549对SSR引物（417对EST-SSR引物和 132对基因组SSR引物）进行多态性检测，最后获得了 176对EST-SSR和82对基因组SSR多 态引物；随后，从中选取多态性表现良好，且条带清晰的40对SSR引物，包括30对EST-SSR 和10对基因组SSR引物，对48个银杏果用品种无性系进行PCR扩增。应用P0PGENE进行 相关遗传参数计算，依据PIC值（多态性信息含量）、Shannon多样性指数以及na*值，最终 选择8对多态性好、重复性高的引物进行排列组合，构建指纹代码。该8对SSR引物即为本 发明的银杏品种分子检测引物组合物，其引物序列及最佳退火温度如表1所示。
[0028] 表1银杏品种分子检测引物
[0029]
[0030] 实施例2
[0031] 应用实施例1的银杏品种分子检测引物组合物构建银杏品种