专利名称：爪哇根结线虫分子检测引物及其用法的制作方法
本申请为申请日2003年7月28日，申请号03131763.4，名称一种根结线虫快速分子检测引物及其用法的分案申请。
技术领域：
本发明爪哇根结线虫分子检测引物及其用法，专用于南方、爪哇和花生根结线虫快速分子检测和鉴定，属于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。
二、技术背景根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生物，是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物和世界各国的植物检疫对象。迄今已记载的根结线虫有约70种，其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)因其广分布性和多寄主性是最重要的种类(Jepson S B.Identification ofroot-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Sasser J N，Carter CC.Overview of the international Melodogyne project 1975-1984.InSasser J N，Carter CC，eds.An Advance Treatise on Meloidogyne.vol.1.Biology and Control.NorthCarolina State University GraphicsRaleigh，1985，19-24.)。在中国，这三种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15-25％，有时达70％以上(徐建华等.江苏省大棚蔬菜寄生线虫的种类和发生.南京农业大学学报，1994，1747-51.)，严重地制约了大棚蔬菜、果树、花卉等作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数亿元以上。
控制根结线虫病发生的主要途径有使用化学杀线虫剂、选种抗病作物品种、实施轮作、建立无病种苗生产基地和对进出口农作物进行严格的检疫。化学杀线虫剂虽防效显著，但因潜在的环境污染问题其使用范围已受到严格的限制；作物抗性的利用在蔬菜作物根结线虫病的治理上已得到广泛和有效的应用(Roberts P A.Current status of the availability，development and use of host plant resistance tonematodes.J.Nematol.，1992，24213-227.)；无病种苗生产基地的建设对于无病区农作物，尤其是果树等多年生木本作物根结线虫病的防治至关重要；至于植物检疫，不仅可及时堵截国外根结线虫群体的传入，而且也是确保国内经济作物安全出口的必要手段。由于主要根结线虫种类间存在显著的致病性差异，上述非化学性防治方法的成功应用依赖于对目标区域和对象上发生的根结线虫种类进行快速而准确的检测和诊断。
根结线虫的种类鉴定传统上依据虫体的形态特征或同工酶谱(Jepson S B.Identification of root-knot nematodes.CAB InternationalWallingford，1987，256 pp.；Esbenshade P R，Triantaphyllou A C.Isozyme phenotypes for the identification ofMeloidogyne species.J.Nematol.，1990，2210-15.)。但两种鉴定法均需要适宜雌虫的存在，因而不适用于生产上多数情况下出现的土壤样本中幼虫的检测和诊断，而且形态鉴定法因雌虫形态的种间近似性和种内变异性也常常不可靠。
为了克服形态和同工酶鉴定法的局限性，国际上自90年代兴起了根结线虫种类分子鉴定的研究。针对南方、爪哇、花生根结线虫等主要种类，最初的研究集中于基于分子杂交的线虫基因组限制性片段长度多态性(RFLP)分析(Piotte C et al.Molecular characterization of species and populations of Meloidogyne from variousgeographic origins with repeated-DNA homologous probes.Funda.Appl.Nematol.，1992，15271-276.)，但RFLP鉴定法不仅程序冗长繁琐，而且需要相对多量的高质量线虫DNA，显然不适用于田间线虫样本的日常诊断和检测。之后的研究均采用基于PCR的DNA分析法，包括对线虫基因组进行随机扩增的随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹法(Castagnone-Sereno P et al.Genetic polymorphism between and withinMeloidogyne species detected with RAPD markers.Genome，1994，37904-909.；Cenis JL.Identification of four major Meloidogyne spp.by random amplified polymorphic DNA(RAPD-PCR).Phytopathology，1993，8376-80.)，对线虫基因组线粒体DNA(mtDNA)进行特异扩增的PCR-RFLP分析法(Powers T O，Harris T S.A polymerase chainreaction method for identification of five major Meloidogyne species.J.Nematol.，1993，251-6.；Stanton J et al.Nucleotide polymorphisms and an improved PCR-based mtDNAdiagnostic for parthenogenetic root-knot nematodes(Meloidogyne spp.).Funda.Appl.Nematol.，1997，20261-268.)，和通过将RAPD标记转化为序列确定扩增区域(SCAR)标记的SCAR标记鉴定法(Zijlstra C et al.Identification of Meloidogyneincognita，M.javanica and M.arenaria using sequence characterized amplified region(SCAR)based PCR assays.Nematology，2000，2847-853.)。但目前这些已研制的南方、爪哇和花生根结线虫的分子鉴定法都存在着一定的缺陷。RAPD指纹法因使用短PCR引物而试验结果不稳定可靠；mtDNA-PCR-RFLP分析法虽结果可靠且灵敏度较高，但该方法需对PCR扩增产物用多种限制性内切酶进行酶切而使得诊断时间过长和费用昂贵；而已有的SCAR标记鉴定法则检测灵敏度只达1-10ng纯化的DNA，不能对生产上常见的土壤样本中的幼虫直接进行鉴定。
发明内容
技术问题本发明的目的是克服已有根结线虫分子鉴定法存在的缺陷，提供结果可靠、易于操作、灵敏度高的南方、爪哇和花生根结线虫的检测和诊断方法。该方法可以试剂盒的形式直接应用于生产实践，对于应用作物抗性、植物检疫、无病种苗生产基地的建设等手段治理我国农作物根结线虫病的发生，以及确保我国蔬菜、果树、花卉等经济作物的安全出口无疑具有切实重要的意义。
技术方案一种根结线虫快速分子检测引物，包括南方、爪哇和花生根结线虫高效特异扩增PCR引物三对，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，其引物及其序列为MI-F5’-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3’；MI-R5’-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3’；MJ-F5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’；MT-R5’-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3’其中MI-F/R引物对在南方根结线虫群体上特异性地扩增出955bp的产物；MJ-F/R引物对在爪哇根结线虫群体上特异性地扩增出517bp的产物；MI-F/MT-R引物对在南方、爪哇和花生根结线虫群体上特异性地扩增出799bp的产物。
上述根结线虫快速分子检测引物的用法，包括在大量根结线虫存在时，采用Miniprep DNA提取法提取线虫的DNA，按如下的PCR反应体系和条件分别用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物对对线虫样本进行PCR扩增，PCR反应体系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR缓冲液(含2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶；PCR条件为预变性94℃4min；35循环的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及终延伸72℃10min；然后将5μl PCR产物用1.5％(重量/体积，下文同)琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果；或者在单条根结线虫的条件下，用于土样和根样中南方、爪哇和花生根结线虫的快速检测和鉴定对于根样，在解剖镜下用解剖针自根结部位解剖出雌虫或雄虫；对于土样，用50％蔗糖液离心快速分离土壤中线虫，在解剖镜下用挑针挑取疑似的根结线虫二龄幼虫或雄虫。将单条的幼虫、雌虫或雄虫置于载玻片上6μl的含有10mMTris-HCl，pH 8.0，100μg/ml蛋白酶K的裂解液中，用细钢针压碎，然后将线虫裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min，冷冻后的线虫裂解液经60℃1h，95℃15min处理后作为线虫DNA模板直接用于PCR扩增；用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物对分别对2μl的线虫裂解液进行PCR扩增，PCR反应体系12.5μl，包括2μl的线虫裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR缓冲液(含2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶；PCR条件为预变性94℃4min；40循环的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及终延伸72℃10min。
然后将5μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
本发明的关键技术是南方、爪哇和花生根结线虫高效特异扩增的序列确定扩增区域(sequence characterized amplified region，SCAR)PCR引物。为了设计这些SCAR引物，应用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术对源于国内外的南方、爪哇、花生、北方(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)群体的基因组差异进行了分析。筛选得到南方根结线虫特异性的RAPD片段4个，分别为OPF-01600、OPF-01800、OPG-11740和OP26-011200；以及爪哇根结线虫特异性的RAPD片段3个，分别为OPF-12600、OPG-18850和OP26-12690。对这些RAPD标记分别进行回收、克隆后测定了它们的DNA序列。在RAPD片段序列的基础上设计了多对SCAR PCR引物，经对国内外的21个南方根结线虫群体、9个爪哇根结线虫群体、8个花生根结线虫群体、4个北方根结线虫群体和1个象耳豆根结线虫群体进行特异性测试后确定了3对高效扩增的SCAR引物，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，它们组合使用可正确地鉴定南方、爪哇和花生根结线虫其中MI-F/MI-R引物对在南方根结线虫群体上特异性地扩增出955bp的产物；MJ-F/R引物对在爪哇根结线虫群体上特异性地扩增出517bp的产物；MI-F/MT-R引物对在南方、爪哇和花生根结线虫群体上特异性地扩增出799bp的产物。三对PCR引物的扩增灵敏度达到1/3条的二龄幼虫、雄虫或雌虫。这表明这些引物可被用于生产实践中土样和根样中三种主要根结线虫的快速可靠的检测和鉴定。
有益效果本发明方法适用于土样和根样中南方、爪哇和花生根结线虫的快速可靠的检测和鉴定，检测灵敏度达1/3条二龄幼虫、雄虫或雌虫，对于集约化农业生产领域和植物检疫领域中根结线虫病害的防治和检疫措施的有效实施具有重要的实用价值。与国外现有其他方法相比，本发明具有以下的技术优势1.结果可靠本发明方法已经对源于中国、泰国、伊朗、澳大利亚、荷兰、比利时、意大利、波兰和美国的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫的43个群体进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证。
2.操作简便快速应用本发明方法，对线虫样本进行简单处理、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切。一般整个检测过程可在6小时内完成。
3.检测灵敏度高本发明的SCAR引物的扩增灵敏度达到1/3条的南方、爪哇和花生根结线虫的二龄幼虫、雄虫或雌虫。因此本方法的实用性强，可满足农作物种植前和植物检疫过程中对三种根结线虫快速可靠的检测和鉴定的需要。
四
图1引物MI-F/R对五种根结线虫的不同群体的基因组DNA的PCR扩增。MDNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-4南方根结线虫群体；5-8爪哇根结线虫群体；9-12花生根结线虫群体；13-15北方根结线虫群体；16象耳豆根结线虫群体图2引物MJ-F/R对五种根结线虫的不同群体的基因组DNA的PCR扩增。MDNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-4南方根结线虫群体；5-8爪哇根结线虫群体；9-12花生根结线虫群体；13-15北方根结线虫群体；16象耳豆根结线虫群体图3引物MI-F/MT-R对五种根结线虫的不同群体的基因组DNA的PCR扩增。MDNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-4南方根结线虫群体；5-8爪哇根结线虫群体；9-12花生根结线虫群体；13-15北方根结线虫群体；16象耳豆根结线虫群体图4引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R对单条二龄幼虫的PCR扩增。MDNA标记DL2000(Takara Biotech，大连，中国)；1-3引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分别对南方根结线虫单条二龄幼虫1/3裂解液的扩增；4-6引物MI-F/R、MJ-F/R和M1-F/MT-R分别对爪哇根结线虫单条二龄幼虫1/3裂解液的扩增；7-9引物MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分别对花生根结线虫单条二龄幼虫1/3裂解液的扩增五具体实施方式
本发明的技术内容包括南方、爪哇和花生根结线虫高效特异扩增SCAR PCR引物三对，即MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R，以及大量和单条根结线虫的鉴定方法。
1.SCAR引物及其序列为MI-F 5’-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3’；MI-R 5’-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3’；MJ-F 5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R 5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’；MT-R 5’-CAAGACCCAATGGCCATAGG-3’三对引物组合使用可准确地鉴定南方、爪哇和花生根结线虫其中MI-F/R引物对在南方根结线虫群体上特异性地扩增出955bp的产物；MJ-F/R引物对在爪哇根结线虫群体上特异性地扩增出517bp的产物；MI-F/MT-R引物对在南方、爪哇和花生根结线虫群体上特异性地扩增出799bp的产物。
2.大量根结线虫条件下的鉴定方法大量线虫存在时可采用适当的方法(如Miniprep DNA提取法；Xu，J et al.Amolecular marker correlated with selected virulence against the tomato resistance gene Miin Meloidogyne incognita，M.javanica and M.arenaria.Phytopathology，2001，91377-382.)提取线虫的DNA，按如下的PCR反应体系和条件分别用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物对对线虫DNA样本进行PCR扩增，然后将5μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。PCR反应体系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR缓冲液(包括2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶.PCR条件为预变性94℃4min；35循环的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及终延伸72℃10min。
3.单条根结线虫条件下的鉴定方法该方法适用于土样和根样中南方、爪哇和花生根结线虫的快速检测和鉴定。对于根样，在解剖镜下用解剖针自根结部位解剖出雌虫或雄虫；对于土样，用50％蔗糖液离心快速分离土壤中线虫，在解剖镜下用挑针挑取疑似的根结线虫二龄幼虫或雄虫。将单条的幼虫、雌虫或雄虫置于载玻片上6μl的裂解液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，100μg/ml蛋白酶K)中，用细钢针压碎，然后将线虫裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min。冷冻后的线虫裂解液经60℃1h，95℃15min处理后作为线虫DNA模板直接用于PCR扩增。用MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R引物对分别对2μl的线虫裂解液(1/3单条线虫量)进行PCR扩增，然后将5μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。PCR反应体系12.5μl，包括2μl的线虫裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，1×PCR缓冲液(包括2mM MgCl2)和1U Taq DNA聚合酶。PCR条件为预变性94℃4min；40循环的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及终延伸72℃10min。
以上方法无需对扩增产物进行限制性内切酶酶切，一般整个检测过程可在6小时内完成。以下实施例用本发明方法已经对源于中国、泰国、伊朗、澳大利亚、荷兰、比利时、意大利、波兰和美国的南方、爪哇、花生、北方和象耳豆根结线虫的43个群体进行了测试验证，因此结果的可靠性具有充分的保证。
实施例1引物MI-F/R对南方根结线虫的特异性扩增利用引物MI-F和MI-R对源于中国、泰国、伊朗、澳大利亚、荷兰、比利时、意大利、波兰和美国的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)的43个群体的基因组DNA进行PCR扩增，结果只在南方根结线虫群体上扩增出955bp的产物(表1；图1)。PCR反应体系12.5μl，包括5ng线虫DNA，0.4μM引物MI-F和MI-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR缓冲液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大连，中国)。PCR条件为预变性94℃4min；35循环的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及终延伸72℃10min。所用PCR仪为Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德国)。
实施例2引物MJ-F/R对爪哇根结线虫的特异性扩增利用引物MJ-F和MJ-R对源于中国、泰国、伊朗、澳大利亚、荷兰、比利时、意大利、波兰和美国的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)的43个群体的基因组DNA进行PCR扩增，结果只在爪哇根结线虫群体上扩增出517bp的产物(表1；图2)。PCR反应体系12.5μl，包括5ng线虫DNA，0.4μM引物MJ-F和MJ-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR缓冲液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大连，中国)。PCR条件为预变性94℃4min；35循环的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及终延伸72℃10min。所用PCR仪为Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德国)。
实施例3引物MI-F/MT-R对南方、爪哇和花生根结线虫的特异性扩增利用引物MI-F和MT-R对源于中国、泰国、伊朗、澳大利亚、荷兰、比利时、意大利、波兰和美国的南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)、花生(M.arenaria)、北方(M.hapla)和象耳豆根结线虫(M.enterolobii)的43个群体的基因组DNA进行PCR扩增，结果在南方、爪哇和花生根结线虫群体上扩增出779bp的产物，在北方和象耳豆根结线虫群体上无扩增产物(表1；图3)。PCR反应体系12.5μl，包括5ng线虫DNA，0.4μM引物MI-F和MT-R，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR缓冲液(包括2mM MgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大连，中国)。PCR条件为预变性94℃4min；35循环的94℃30s，62℃30s和72℃30s；以及终延伸72℃10min。所用PCR仪为Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德国)。
实施例4利用引物MI-F/R，MJ-F/R和MI-F/MT-R对南方、爪哇和花生根结线虫的单条二龄幼虫进行鉴定利用引物对MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R分别对南方(M.incognita)、爪哇(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)的单条二龄幼虫的1/3裂解液进行PCR扩增，结果引物MI-F/R只在南方根结线虫上扩增出955bp的产物，引物MJ-F/R只在爪哇根结线虫上扩增出517bp的产物，而引物MI-F/MT-R在南方、爪哇和花生根结线虫上扩增出779bp产物(图4)。PCR反应体系12.5μl，包括2μl二龄幼虫(1/3单条幼虫)裂解液，0.4μM各引物，0.2mM dNTPs，1×ExTaq PCR缓冲液(包括2mMMgCl2)和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Biotech，大连，中国)。PCR条件为预变性94℃4min；40循环的94℃30s，62℃30s和72℃45s；以及终延伸72℃10min。所用PCR仪为Eppendorf Mastercycler Personal(Eppendorf，德国)。
表1.SCAR引物对MI-F/R、MJ-F/R和MI-F/MT-R对国内外南方、爪哇和花生根结线虫群体的特异性扩增
权利要求
1.爪哇根结线虫分子检测引物，包括爪哇根结线虫高效特异扩增PCR引物对MJ-F和MJ-R，其引物序列为MJ-F 5’-ACGCTAGAATTCGACCCTGG-3’；MJ-R 5’-GGTACCAGAAGCAGCCATGC-3’上述MJ-F和MJ-R引物对在爪哇根结线虫群体上特异性地扩增出517bp的产物。
2.权利要求1所述爪哇根结线虫分子检测引物的用法，包括用于大量线虫存在时的爪哇根结线虫的检测采用Miniprep DNA提取法提取线虫的DNA，按如下的PCR反应体系和条件用MJ-F和MJ-R引物对线虫样本进行PCR扩增，PCR反应体系12.5μl，包括5ng模板DNA，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR缓冲液和1U Taq DNA聚合酶；PCR条件为预变性94℃ 4min；35循环的94℃ 30s，62℃ 30s和72℃ 30s；以及终延伸72℃ 10min；然后将5μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的有无和大小判定结果；或者用于在单条根结线虫条件下的土样和根样中爪哇根结线虫的检测对于根样，在解剖镜下用解剖针自根结部位解剖出雌虫或雄虫；对于土样，用50％蔗糖液离心快速分离土壤中线虫，在解剖镜下用挑针挑取疑似的根结线虫二龄幼虫或雄虫；将单条的幼虫、雌虫或雄虫置于载玻片上6μl的含有10mM Tris-HCl，pH8.0，100μg/ml蛋白酶K的裂解液中，用细钢针压碎，然后将线虫裂解液吸入200μl的PCR薄壁管中在-80℃放置30min，冷冻后的线虫裂解液经60℃ 1h，95℃ 15min处理后作为线虫DNA模板直接用于PCR扩增；用MJ-F和MJ-R引物对2μl的线虫裂解液进行PCR扩增，PCR反应体系12.5μl，包括2μl的线虫裂解液，0.4μM引物，0.2mM dNTPs，含2mM MgCl2的1×PCR缓冲液和1U Taq DNA聚合酶；PCR条件为预变性94℃ 4min；40循环的94℃ 30s，62℃ 30s和72℃ 45s；以及终延伸72℃ 10min；然后将5μl PCR产物用1.5％琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的有无和大小判定结果。
全文摘要
本发明爪哇根结线虫分子检测引物及其用法，专用于南方、爪哇和花生根结线虫快速分子检测和鉴定，属于农作物病害防治和植物检疫技术的领域。设计了三对PCR引物，即MI－F/R、MJ－F/R和MI－F/MT－R，其分别在南方根结线虫、爪哇根结线虫以及南方、爪哇和花生根结线虫群体上特异性地扩增出955bp、517bp和799bp的产物。三对引物的扩增灵敏度达到了1/3条二龄幼虫、雄虫或雌虫。这表明这些引物可被用于生产实践中土样和根样中三种主要根结线虫的快速可靠的检测和鉴定。附图为引物MI－F/R、MJ－F/R和MI－F/MT－R分别对南方、爪哇和花生根结线虫1/3条二龄幼虫裂解液的PCR扩增产物电泳图。
文档编号C12Q1/68GK1661108SQ20041010422
公开日2005年8月31日 申请日期2003年7月28日 优先权日2003年7月28日
发明者徐建华, 孟庆鹏 申请人:南京农业大学