一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能够灵敏对甲癣进行分子诊断。在建立了灵敏、特异、稳定的甲癣病原菌检测体系的基础上，本发明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。本发明的引物和探针，其序列分别为SEQ?ID?NO:1-9。同时，本发明所提供的试剂盒包含改良过的真菌细胞裂解液，能快速而有效地完成DNA提取过程，使检测更为快捷方便。
【专利说明】一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物检测【技术领域】，具体涉及一种基于real time PCR的甲癣病原菌 的分子诊断引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 甲癣（俗称灰指甲），主要由皮肤癣菌（dermatophytes)引起，流行病学调查显示 通常在人群中约有5%的个体感染不同程度的甲癣。皮肤癣菌主要包括三个属：小孢子菌 属（Microsporum)、毛癣菌属（Trichophyton)和表皮癣菌属（Epidermophyton);临床上以 毛癣菌属的红色毛癣菌（Trichophyton rubrum)最为常见。
[0003] 与其他浅表真菌感染相比，甲癣以其低治愈率和高复发率而著称，通常需要较长 时间的系统性用药才能彻底治愈。由于系统抗真菌治疗不仅涉及治疗成本的上升，而且抗 真菌药物通常会有一定的不良反应，因此精准的甲癣诊断技术就显得非常重要。目前甲癣 的真菌学检查主要依赖于镜检和培养。虽然镜检结果较灵敏，但无法有效区分不同物种的 真菌，对检测人员的微生物学检测技能要求较高，因此不能满足临床的需要（特别是缺乏 有经验的检测人员时）；真菌培养的阳性率极低，有文献指出，大约有15 - 50%的镜检阳性 标本，会表现出阴性结果。因此，开发快速、灵敏、准确、稳定的甲癣分子诊断试剂盒就显得 极有意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种甲癣病原菌的分子诊断引物及试剂盒，能够快速、特 异、灵敏、稳定对甲癣进行分子诊断。在建立了可靠的甲癣病原菌检测体系的基础上，本发 明针对性地设计了竞争性内参，确保阴性结果的真实可信。同时，本发明所提供的试剂盒包 含改良过的真菌细胞裂解液，能快速而有效地完成DNA提取过程。
[0005] 本发明首先提供用于检测皮肤癣菌属的引物和探针，其序列信息如下：
[0006] 上游引物 Pan - DF :ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAG(SEQ ID NO: 1)、
[0007] 下游引物 Pan - DR :TAGTTGGTGGAGTGATTTGTC(SEQ ID N0:2)、
[0008] 探针 Pan - DP :AATTGCGATAACGAACGAGACCTT (SEQ ID NO: 3)。
[0009] 探针Pan - DP的5'用FAM修饰，3'用BHQ1修饰；
[0010] 本发明还提供用于检测红色毛癣菌的引物和探针，其序列信息如下：
[0011] 上游引物 Tr - F :TACCTCACCCGGTTGCCTC (SEQ ID N0:4)、
[0012] 下游引物 Tr - R :CTGATTGTGCTTGCTAAACGC(SEQ ID N0:5)、
[0013] 探针 Tr - P :CGGCTCGAGGCTCCCAGAAGG(SEQ ID N0:6)。
[0014] 探针Tr - P的5'用FAM修饰，3'用BHQ1修饰。
[0015] 另外，本发明还提供作为竞争性内参的模板和探针，其信息如下：
[0016] Pan 模板：Pan - IAC(SEQ ID N0:7):
[0017] ATAGTCCCTCTAAGAAGCCAGagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGACAAATCACTCCACCAA CTA
[0018] Tr 模板：Tr - IAC(SEQ ID N0:8):
[0019] TACCTCACCCGGTTGCCTCagctCTCAGACAGCCTCCAGCCCCGCagatGCGTTTAGCAAGCACAATCA G
[0020] 内参探针 IACP(SEQ ID N0:9):
[0021] CTCAGACAGCCTCCAGCCCCGC，探针 Y 用 TAMRA 修饰，3，用 BHQ1 修饰。
[0022] 本发明还提供一种包含上述引物、探针的试剂盒。
[0023] 本发明的引物、探针，以及试剂盒用于非疾病诊断目的的甲癣病菌的检测
[0024] 本发明还提供一种从标本中提取核酸的方法，具体如下：
[0025] 1)将待检测的样品加入到真菌细胞裂解液中，以珠磨法对真菌细胞进行裂解。其 中真菌细胞裂解液的配方如下：
[0026] 500mM Tris - HC1 ρΗ8· 8
[0027] 100mM EDTA ρΗ8· 0
[0028] lOOmM KC1
[0029] 2)将裂解液离心使样品收集到离心管底部，然后在95°C水浴处理；
[0030] 3)水浴结束后离心，收集上清作为检测的模板。
[0031] 本发明提供了一套基于分子方法的甲癣病原体快速诊断体系，能灵敏、特异、快 速、稳定、简便地检测甲癣。由于改进了煮沸法，能快速有效地提取临床标本中的皮肤癣菌 DNA;而由于采用了竞争性内参，能有效地分辨假阴性结果；由于对引物、探针进行了充分 的优化，因此能灵敏、特异而稳定地达到检测效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图1 :皮肤癣菌的18S rDNA序列保守区比对图；
[0033] 图2 :Pan检测引物扩增的标准曲线图；
[0034] 图3 :Tr检测引物扩增的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合实施例对本发明的引物及探针进行详细的描述。
[0036] 一、引物和探针的设计
[0037] 1、Pan检测引物探针的设计
[0038] 已报道的皮肤癣菌的通用型引物主要针对的几丁质合成酶1 (chitin synthase 1 gene，CHS1)，但由于CHS1为单拷贝基因，因此，本发明选择了在皮肤癣菌内更加保守，且为 多拷贝的18S rDNA。
[0039] 从NCBI下载到皮肤癣菌三个属（含毛癣菌属、小孢子球菌属、表皮癣菌属的11个 种）的18S rDNA序列，通过seqman软件比对，从中找出序列相对稳定的区域（如图1)，用 于作为检测的目标序列。利用primer select软件进行引物的选择后，选定不存在碱基变 异的区域作为扩增引物。
[0040] 初步选定引物后，通过采用浓度依赖的近似法（nearest-neighbor)的Tm估算公 式，由melitng软件完成。具体公式如下：
[0041]
【权利要求】
1. 一种用于检测皮肤癣菌属的引物和探针，其特征在于，所述的引物和探针的序列信 息如下： 上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1、 下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:2、 探针的核苷酸序列为SEQ ID N0:3。
2. -种用于检测红色毛癣菌的引物和探针，特征在于，所述的引物和探针的序列信息 如下： 上游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:4、 下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0:5、 探针的核苷酸序列为SEQ ID N0:6。
3. 如权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，所述的探针的5'端用FAM修饰， 3'端用BHQ1修饰。
4. 一种模板和探针，其特征在于，所述的模板和探针为权利要求1或2所述的引物和探 针的竞争性内参，其序列信息如下： Pan模板，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 7 : Tr模板，其核苷酸序列为SEQ ID NO:8 : 内参探针，其核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
5. 如权利要求4所述的模板和探针，其特征在于所述的内参探针的5'端用TAMRA修 饰，3'端用BHQ1修饰。
6. -种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1和/或2所述的引物和探 针。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求4所述的模 板和探针。
8. 权利要求7或8所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的甲癣病菌的检测。
9. 一种检测甲癣病菌的方法，其特征在于，所述的方法是采用权利要求1和/或2所述 的引物和探针，其中扩增样品核酸模板的提取方法如下： 1) 将待检测的样品加入到真菌细胞裂解液中，以珠磨法对真菌细胞进行裂解，其中真 菌细胞裂解液的配方如下： 500mM Tris-HCl pH 8.8 100mM EDTA pH8.0 lOOmM KC1 ； 2) 将裂解液离心使样品收集到离心管底部，然后在95°C水浴处理； 3) 水浴结束后离心，收集上清作为检测的模板。
【文档编号】C12Q1/04GK104087679SQ201410357403
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月24日 优先权日:2014年7月24日
【发明者】龚杰, 王晓雯, 李若瑜, 万喆, 张小梅, 陈伟 申请人:北京大学第一医院