人肾损伤分子1的检测试剂及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及新型的肾损伤检测试剂及试剂盒。本发明人从全长的肾脏损伤分子1(KIM-1)上分别鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得了特异性抗KIM-1的多克隆抗体。本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。
【专利说明】人肾损伤分子1的检测试剂及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和免疫性领域；更具体地，本发明涉及人肾损伤分子
I(KIM-1)的新型试剂和试剂盒。
【背景技术】
[0002]人肾脏损伤分子I(KIM-1)是一种跨膜蛋白，在正常肾脏中并不表达，而在肾脏损伤的动物模型中表达明显增加。动物研究表明，KIM-1的外功能区断裂后产物能够通过尿中排出，因此检测尿中KM-1水平可以评价肾脏损伤情况。已有研究表明，在所有肾脏疾病中肾组织KM-1的表达和尿中KM-1水平均明显增高。因此，KIM-1已经作为一种疾病发作的标记物被人们研究和应用。人KM-1共包括359个氨基酸，其中1-20位为信号肽，表达时被切除成为成熟状态；21-290位为胞外部分；291-311位为一段具有21个氨基酸的跨膜序列；最后48个氨基酸则构成了该蛋白的胞内域。
[0003]尽管KM-1作为疾病诊断的标志物已经为人们所了解，然而由于它们的全长蛋白本身免疫原性并不理想，免疫获得抗体的过程中还存在抗体效价差，不稳定的缺陷。
[0004]因此，本领域还有必要进一步优化针对KM-1标志物的抗体。并且，还有必要联合其它肾损伤相关的标志物的抗体来组合应用于肾损伤的监测，以期提高肾损伤诊断的准确率。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种监测肾损伤的新型试剂和试剂盒。
[0006]在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，它是如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于肾脏损伤分子I (KIM-1)。
[0007]在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它编码所述的多肽。
[0008]在本发明的另一方面，提供一种多肽混合物，其由SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽混合而成。
[0009]在一个优选例中，SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为1:5~5:1。
[0010]较佳地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为1:3~3:1 ;更佳地按照重量比为1:2~2:1。
[0011]在本发明的另一方面，提供所述的多肽混合物的用途，用于制备特异性抗肾脏损伤分子I的抗体。
[0012]在本发明的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的抗体，其是由所述的多肽混合物免疫动物而获得。
[0013]在一个优选例中，所述的抗体是多克隆抗体。
[0014]在本发明的另一方面，提供一种制备抗体的方法，所述方法包括:以所述的多肽混合物免疫动物，从免疫后的动物体内分离出特异性抗人肾损伤分子I(KIM-1)的抗体。
[0015]在本发明的另一方面，提供一种用于检测肾损伤的试剂盒，包括:
[0016]固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体,该多克隆抗体由所述的多肽混合物免疫动物而获得；或包括:容器，以及位于容器中的上述的多肽混合物免疫动物而获得的多克隆抗体。
[0017]在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括:固相载体，以及位于固相载体上的抗体(如多克隆抗体)，该抗体是特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)的抗体；或包括:容器，以及位于容器中的特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)的抗体。
[0018]在一个优选例中，所述的固相载体是包被板、试纸和/或微球。
[0019]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括:标记的检测抗体，显色剂，洗涤液，终止液和/或使用说明书。
[0020]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1、ELISA反应后，在A405nm测酶标板上各孔的吸光度，所获得的读数。其中A、B行微孔中包被SEQ ID NO:1多肽；在C、D行微孔中包被SEQ ID N0:2多肽。1、2列为#YZ2861号兔子1:1000稀释度的血清(多抗)；3、4列为#ΥΖ2861号兔子1:10,000稀释度的血清;5、6列为#ΥΖ2861号兔子1:100,000梯度稀释血清;7、8列为#YZ22862号兔子1:1000稀释度的血清；3、4列为#ΥΖ2862号兔子1:10，000稀释度的血清;5、6列为#ΥΖ2862号兔子1:100，000梯度稀释血清。A、C孔加入预免疫血清；B、D孔加入最终获得的血清。
[0022]图2、SEQ ID N0:1(上图)、SEQ ID NO: 2 (下图)分别免疫#YZ2861兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)测定结果。
[0023]图3、SEQ ID N0:1(上图)、SEQ ID NO: 2 (下图)分别免疫#YZ2862兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)测定结果。
[0024]图4、WESTERN BLOT结果显示本发明的多克隆抗体可以特异性地结合全长的KIM-1多肽片段。
【具体实施方式】
[0025]在本领域人员的实践中经常发现，由于蛋白的抗原决定簇易于被包埋在蛋白空间结构的内部，因此难以找到一种特异性高的抗体。针对上述技术难题，为了高效获得检测KIM-1肾损伤标志物的特异性抗体，本发明人经过深入的研究，从全长的KM-1上分别鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，分别获得了特异性抗KIM-1的多克隆抗体。本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。
[0026]本发明中， “分离的多肽”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质，本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该多肽，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主带。
[0027]本发明的SEQ ID NO: 1_2任一所述的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成多肽。本发明所述的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
[0028]编码所述的多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0029]编码本发明的多肽的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽的DNA序列。
[0030]本发明还提供了一种多肽混合物，其由SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽混合而成。
[0031]多肽制备成混合物联合用于作为免疫原进行动物免疫，可获得高效价的抗体，免疫的效果显著优于单条多肽的免疫。
[0032]本发明还提供了可特异性识别KM-1的抗体。这里，“特异性”是指抗体能识别和结合于KIM-1蛋白，但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
[0033]本发明更优选多克隆抗体，本发明中，所用的术语“多克隆抗体”(多抗)指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。
[0034]多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。本发明的多肽混合物，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。实施例中采用多肽混合物与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射，免疫新西兰兔；并进行加强免疫；最终获得高效价的多克隆抗体。
[0035]利用本发明的多肽混合物，也可以生产单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:511,1976 ；Kohler 等人，Eur.J.Tmmunol.6:292,1976 ；Hammerling 等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y., 1981)。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
[0036]本发明还提供了检测样品中是否存在KM-1的方法，是利用本发明制备的抗KIM-1的特异性多克隆抗体进行检测，它包括:将样品与抗KM-1的特异性多克隆抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在KIM-1。抗KIM-1的特异性多克隆抗体用于检测KIM-1蛋白，可以用本领域技术人员熟知的各种按照抗原抗体体外特异性结合的原理设计的方法来达到，例如蛋白免疫印迹实验，免疫共沉淀实验等。
[0037]本发明还提供了一种检测肾损伤试剂盒，其中含有本发明的抗体，较佳地是多克隆抗体。较佳地，所述的检测试剂盒包括:固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体，该多克隆抗体由所述的多肽混合物免疫动物而获得。
[0038]所述的固相载体可以是包被板、试纸和/或微球。从而通过免疫检测试纸，胶体金等技术来进行检测。
[0039]此外，所述的检测试剂盒还包括:标记的检测抗体，显色剂，洗涤液，终止液和/或使用说明书。可根据检测方法的不同来调整这些试剂。
[0040]本发明的主要优点在于:
[0041](I)本发明首次鉴定到了 KIM-1蛋白序列中的关键抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得的抗体效价高，识别抗原的特异性好。
[0042](2)利用短肽来制备多克隆抗体，短肽合成方法简单。
[0043](3)本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。
[0044]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0045]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0046]为了高效获得检测KM-1两种肾损伤标志物的特异性抗体，本发明人经过深入的研究，从全长的KM-1上分别鉴定出关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得了特异性抗抗KIM-1的多克隆抗体。本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。
[0047]本发明中，“分离的多肽”是指多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质，本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化该多肽，基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上产生单一的主带。
[0048]本发明的SEQ ID NO: 1_2任一所述的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成多肽。本发明所述的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
[0049]编码所述的多肽的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
[0050]编码本发明的多肽的多核苷酸通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽的DNA序列。
[0051]本发明还提供了一种多肽混合物，其由SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽混合而成。
[0052]多肽制备成混合物联合用于作为免疫原进行动物免疫，可获得高效价的抗体，免疫的效果显著由于单条多肽的免疫。
[0053]本发明还提供了可特异性识别KM-1的抗体。这里，“特异性”是指抗体能识别和结合于KIM-1蛋白，但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
[0054]本发明更优选多克隆抗体，本发明中，所用的术语“多克隆抗体”(多抗)指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。
[0055]多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。本发明的多肽混合物，可被施用于动物(如兔，小鼠，大鼠等；较佳地是兔)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明的多肽的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。实施例中采用多肽混合物与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射，免疫新西兰大耳兔；并进行加强免疫；最终获得高效价的多克隆抗体。
[0056]利用本发明的多肽混合物，也可以生产单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人,Nature256; 495, 1975; Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:511, 1976; Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:292, 1976; Hammerling 等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, Ν.Y.，1981)。
[0057]多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
[0058]本发明还提供了检测样品中是否存在KM-1的方法，是利用抗KM-1的特异性多克隆抗体进行检测，它包括:将样品与抗KIM-1的特异性多克隆抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在KIM-1。抗抗KIM-1的特异性多克隆抗体用于检测KIM-1蛋白，可以用本领域技术人员熟知的各种按照抗原抗体体外特异性结合的原理设计的方法来达到，例如蛋白免疫印迹实验，免疫共沉淀实验等。
[0059]本发明还提供了一种检测肾损伤试剂盒，其中含有本发明的抗体，较佳地是多克隆抗体。较佳地，所述的检测试剂盒包括:
[0060]容器I或包被板1，以及位于容器I中或包被板I上的多克隆抗体，该多克隆抗体由所述的多肽混合物免疫动物而获得。
[0061]为了进一步提高肾损伤检测的敏感性和准确性，所述试剂盒中还可包括检测其他肾损伤标志物的检测试剂。作为本发明的一个优选的方面，所述试剂盒中还可包括特异性检测NGAL的试剂。
[0062]为了便于本领域技术人员使用，所述的试剂盒中还可包括说明各试剂或工具的用法用量的使用说明书。
[0063]本发明的主要优点在于:
[0064](I)本发明首次鉴定到了 KM-1关键的抗原决定簇，以含有这些关键抗原决定簇的短肽混合物作为免疫原，获得的抗体效价高，识别抗原的特异性好。
[0065](2)利用短肽来制备多克隆抗体，短肽合成方法简单。
[0066](2)本发明提供的抗原片段及其多克隆抗体，制备方法简单，效价高，特异性强，灵敏度高。
[0067]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0068]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0069]实施例1、特异的KM-1氨基酸片段序列及其产物的混和物作为免疫原
[0070]KIM-1蛋白的全长氨基酸(人源，359个氨基酸)序列(SEQ ID NO: 3)如下:
[0071]MHPQVVILSLILHLADSVAGSVKVGGEAGPSVTLPCHYSGAVTSMCWNRGSCSLFTCQN
[0072]GIVWTNGTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRDVSLTIENTAVSDSGVYCCRVEHRGWFNDMKI
[0073]TVSLEIVPPKVTTTPIVTTVPTVTTVRTSTTVPTTTTVPTTTVPTTMSIPTTTTVLTTMTVS
[0074]TTTSVPTTTSIPTTTSVPVTTTVSTFVPPMPLPRQNHEPVATSPSSPQPAETHPTTLQGA
[0075]IRREPTSSPLYSYTTDGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTKGIYAGVCISVL
[0076]VLLALLGVIIAKKYFFKKEVQQLSVSFSSLQIKALQNAVEKEVQAEDNIYIENSLYATD
[0077]由于全长序列作为免疫原存在合成难且免疫原性不强的缺点，本发明人根据以上全长序列，采用常规方法人工合成各种长度的序列片段，以片段作为免疫原，反复测试各种免疫原的免疫效果。最终，获得了适合的免疫原，其包括来自KIM-1的两个多肽片段，序列(N — C端)如下:
[0078]CRREPTSSPLYSYTTD(SEQ ID NO:1)；
[0079]CTHVTYRKDTRYKLLGDLSRRD(SEQ ID NO:2)。
[0080]两条多肽片段以质量比1:1进行混合，获得多肽混合物。以该混合物作为生产特异性多克隆抗KIM-1抗体的特异免疫原。以这两个片段的混和物免疫动物后，可获得有高效价、高免疫原性(即高抗原性)的特异性多克隆抗体。
[0081]实施例2、特异性多克隆抗IQM-1抗体的产生
[0082]分别以上述实施例1制备的特异性多肽的混和物作为免疫原与血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫新西兰大白兔而产生免疫血清。动物免疫的方法和程序如下:
[0083]I)免疫两只新西兰雄兔(#ΥΖ2861 ;#ΥΖ2862)，采集免疫前血清并于_20°C存贮。
[0084]2)首次免疫取与血蓝蛋白(KLH)偶联好的免疫原与等量弗氏完全佐剂乳化抗原(抗原:弗氏完全佐剂=1 :1 (V/V))，背部多点注射。首次免疫的注射量是400 yg多肽混和物。
[0085]3) 14天后，用弗氏完全佐剂乳化抗原(抗原:弗氏完全佐剂=I:l(v/v))重复背部多点注射加强免疫。加强免疫的注射量是400 μ g多肽混和物。
[0086]4)28天后，使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，背部多点注射加强免疫。
[0087]5)42天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
[0088]6)70天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
[0089]7)77天后，颈动脉采血取血清，-70°C存放。获取特异性抗体后，进行ELISA以及WESTERN BLOT验证抗体的效价以及识别抗原的性能。
[0090]ELISA方法如下:
[0091]采用直接法，将合成多肽包被在96孔酶标板中，加入免疫后血清，对照为免疫前血清。
[0092]材料:
[0093]1、包被抗原:将多肽抗原包被在96孔酶标板中，0.1 μ g/100 μ I/孔；
[0094]其中在酶标板的A、B行微孔中包被SEQ ID NO:1多肽；在C、D行微孔中包被SEQID NO:2 多肽。
[0095]2、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体；
[0096]3、抗体或酶交联物的稀释:用含0.05%(v/v)吐温20的I XPBS溶液配制1.0%(v/V)BSA溶液，其中含有正常山羊IgG，浓度为0.lmg/ml ；
[0097]4、洗脱液:含0.05% (v/v)吐温20的PBS溶液；
[0098]5、ABTS 底物。
[0099]方法:
[0100]1、在酶标板每孔加入100 μ 110倍比稀释的本实施例上述制备的多克隆抗体，在37°C下孵育30分钟；
[0101]2、洗脱:用缓冲液加入96孔酶标板内，300-360 μ I/孔，3min后，将洗液轻轻甩出，
倒置于纸上拍干，重复二次；
[0102]3、每孔加入100μ I辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1:2000)，在37°C下孵育30分钟；
[0103]4、洗脱，将洗脱液加入96孔酶标板内，300-360 μ I/孔，3min后，将洗脱液轻轻甩出，倒置于纸上拍干，重复二次；
[0104]5、每孔加入100 μ I ABTS底物溶液，在室温下孵育10-20分钟；
[0105]6、酶标仪分析:在405nm波长下读数。
[0106]图1为酶标板上各孔的读数。
[0107]ELISA结果显示，所获得的多克隆抗体可以特异性地识别KIM-1的两个多肽片段。图2为SEQ ID N0:1(上图)、SEQ ID NO: 2 (下图)分别免疫#YZ2861兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)实验结果。图3为SEQ ID NO:1 (上图)、SEQ ID NO: 2 (下图)分别免疫#￥22862兔子后不同稀释度的抗体的滴度(效价)实验结果。结果显示，免疫后血清中抗体滴度均非常高。也即，该多克隆抗体效价可达到1:100,000。
[0108]实施例3、本发明的多克隆抗体结合全长KM-1多肽或片段的能力
[0109]进行WESTERN BLOT检测，WESTERN BLOT是用抗体检测蛋白的重要方法之一。WESTERN BLOT通过如下步骤进行操作:
[0110]1.收集蛋白样品
[0111]小鼠缺血再灌注肾脏匀浆的制备:雄性C57BL/6小鼠，采用夹闭双侧肾蒂30min后开放30min的方法制作急性肾损伤(AKI)鼠模型，挖眼取血，即刻取舣侧肾脏皮质，称重后在超净台中剪碎肾皮质，以PBS为匀浆剂，在玻璃浆器中制成匀浆，终浓度为20g/L，匀浆操作在冰浴中进行。制成的匀浆液以20000r/min低温高速离心15min，吸取上清液，用30 μ m孔径的一次性无菌滤器过滤，所得滤液分装后，_70°C冷冻保存备用。
[0112]2.电泳(Electrophoresis)
[0113](I) SDS-PAGE 凝胶配制
[0114]SDS-PAGE凝胶配制为5%浓度。
[0115](2)样品处理
[0116]在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
[0117](3)上样与电泳
[0118]把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。
[0119]3.转膜(Transfer)
[0120]选用PVDF膜。使用B1-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。
[0121]4.封闭(Blocking)
[0122]转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1_2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
[0123]用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。
[0124]5.一抗孵育
[0125]按照适当比例稀释一抗(即:本发明的多抗)。
[0126]用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育I小时效果不佳，可以在4°C缓慢摇动孵育过夜。
[0127]回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5_10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
[0128]6.二抗孵育
[0129]按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(山羊抗兔多克隆抗体)。
[0130]用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4°C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
[0131]回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。
[0132]7.蛋白检测
[0133]使用Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。
[0134]WESTERN BLOT结果显示(图4)，所获得的多克隆抗体可以特异性地结合全长的KIM-1多肽，急性肾损伤(AKI)鼠模型与对照正常鼠可以非常清楚地区分。
[0135]实施例4、试剂盒
[0136](I)试剂盒 I
[0137]所述的试剂盒I包括:
[0138]容器1，以及装于容器的前述实施例2制备的多克隆抗体；
[0139]容器2，以及装于容器的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体。
[0140](2)试剂盒 2
[0141]所述的试剂盒2包括:
[0142]容器1，以及装于容器的前述实施例2制备的多克隆抗体；
[0143]容器2，以及装于容器的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体。
[0144]所述的试剂盒2还包括检测NGAL的检测试剂，如下:
[0145]容器3，以及装于容器的抗NGAL抗体；
[0146]容器4，以及装于容器的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG多克隆抗体。
[0147]所述的抗NGAL抗体制备方法如下:
[0148]根据NGAL的全长序列，获得来自NGAL的两个多肽片段，序列(N — C端)如下:CREDKDPQKMYATIYELKEDKS(SEQ ID NO:4)和 CYNQHAMVFFKKVSQNREY(SEQ ID NO:5)。两条多肽片段以质量比1:1进行混合。以该多肽片段混和物作为免疫原与血蓝蛋白(KLH)偶联，免疫新西兰大白兔而产生的免疫血清。动物免疫的方法和程序如下:
[0149]I)免疫两只新西兰雄兔，采集免疫前血清并_20°C存贮。
[0150]2)首次免疫取与血蓝蛋白(KLH)偶联好的免疫原与等量弗氏完全佐剂乳化抗原(抗原:弗氏完全佐剂=1:1 (V/V))，背部多点注射。首次免疫的注射量是400 yg多肽混和物。
[0151]3) 14天后，用弗氏完全佐剂乳化抗原(抗原:弗氏完全佐剂=I:l(v/v))重复背部多点注射加强免疫。加强免疫的注射量是400 μ g多肽混和物。
[0152]4)28天后，使用同样剂量多肽与等体积的不完全弗氏佐剂混合，背部多点注射加强免疫。
[0153]5)42天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
[0154]6)70天后，同步骤4)背部多点注射加强免疫。
[0155]7)77天后，颈动脉采血取血清，_70°C存放。
[0156]获取特异性抗NGAL抗体。WESTERN BLOT结果显示，所获得的抗NGAL多克隆抗体可以特异性地结合全长的NGAL多肽。
[0157]嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白(NGAL)共包括198个氨基酸，以往已被报导可作为尿生物标记，用来检测肾小管细胞损伤的早期发作。检测KM-1多肽以及检测NGAL多肽的抗体联合应用，用于临床诊断肾脏损伤状况，诊断的敏感性和准确性均有显著提高。
[0158]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，15本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种分离的多肽，其特征在于，它是如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽，所述的多肽来源于肾脏损伤分子I。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
3.一种多肽混合物，其特征在于，其由SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽混合而成。
4.如权利要求3所述的多肽混合物，其特征在于，SEQID NO:1和SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多肽混合的比例按照重量比为1:5~5:1。
5.如权利要求3或4所述的多肽混合物的用途，用于制备特异性抗肾脏损伤分子I的抗体。
6.一种用于检测肾损伤的抗体，其是由权利要求3或4所述的多肽混合物免疫动物而获得。
7.如权利要求6所述的抗体，其特征在于，所述的抗体是多克隆抗体。
8.一种用于检测肾损伤的试剂盒，其特征在于，包括: 固相载体，以及位于固相载体上的多克隆抗体，该多克隆抗体由权利要求3或4所述的多肽混合物免疫动物而获得； 或包括: 容器，以及位于容器中的权利要求3或4所述的多肽混合物免疫动物而获得的多克隆抗体。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括: 固相载体，以及位于固相载体上的抗体，该抗体是特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白的抗体； 或包括: 容器，以及位于容器中的特异性抗嗜中性粒细胞明胶酶相关性脂运蛋白的抗体。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的固相载体是包被板、试纸和/或微球。
【文档编号】C12N15/12GK104072586SQ201310109245
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】蔡逸强, 闵洪中, 李锐 申请人:李锐