标记试剂,合成该试剂的方法以及检测生物分子的方法

专利名称：标记试剂,合成该试剂的方法以及检测生物分子的方法
背景技术：
本发明涉及用来标记生物分子的新型试剂，涉及合成所述标记的方法以及涉及标记生物分子的应用，尤其在用核酸探针诊断的领域。
现有技术的描述现有技术显示了各种用于标记核苷酸、寡核苷酸或核酸的方法。
第一种方法包括将标记附到碱基上，无论后者是天然的碱基或是经修饰的碱基。第二种方法将标记附到糖上，同样，无论后者是天然的糖或是经修饰的糖。第三种方法将标记附到磷酸上。
在碱基上标记特别用于通过直接掺入标记的核苷酸来标记核酸。
在糖上标记通常在用化学合成制备核探针的情况下使用。
在磷酸上标记也被用于在化学合成寡核苷酸时引入已被功能化的臂和标记。
事实上，精通此领域的技术人员能够标记核苷酸、核苷酸类似物或核酸，倾向于在碱基或糖上进行这种附着，这样更加方便且更利于选择。这也是为什么许多文献，如EP-A-0,329,198，EP-A-0,302,175，EP-A-0,097,373，EP-A-0,063,879，US-A-5,449,767，US-A-5,328,824，WO-A-93/16094，DE-A-3,910,151，EP-A-0,567,841都把研究放在碱基上，而EP-A-0,286,898研究了糖。
与使碱基或糖功能化的技术相比，将标记附到磷酸上是一项比较复杂的技术，尤其是由于磷酸的低反应性它已较少使用(参见，例如，Jencks W.P.等，J.Amer.Chem.Soc.，82，1778-1785，1960)。同时，可参见O’Donnel和McLaughlin的综述(“用于核酸结构分析的报道基因”，216-243页，收录在《生物有机化学核酸》(“Bioorganic ChemistryNucleic Acids”)，Hecht S.M.编，牛津大学出版社，1996)涉及将探针引入寡核苷酸片段的方法，核苷酸间磷酸二酯的有效烷基化被认为是不可能的。
专利申请WO 99/65926描述了标记合成的或天然的核糖核酸(RNA)的方法，它包括片段化RNA和在末端磷酸的水平上进行标记。该文献描述了许多可与片段化一起用于标记的官能团，如羟基、胺、肼、烷氧基胺、烷基卤和苄基型的烷基卤官能团，尤其是5’-(溴甲基)荧光素衍生物。这些官能团能够标记核酸，但必需与片段化步骤结合以进行有效标记，因为这种标记发生在片段化时释放的磷酸上。此外，必需加入相对于RNA的大量过量的标记试剂以获得有效的标记，这就导致了过量标记产生的背景噪音的问题。最后，该方法对双链DNA不能有效工作。
因此需要有新的标记试剂，从标记领域的观点来看这种试剂是有效的，它在标记位点的水平上是特异的，且特别地，它不会影响通过氢键形成双螺旋时所涉及的碱基的杂交特性，它可用于DNA和RNA，最后，它可用来标记天然来源的或通过酶扩增制备的核苷酸，寡核苷酸或核酸。
发明概述本发明描述了新型标记，所述标记可满足上述情况，且可将重氮甲基官能团用作标记的反应官能团。
所述重氮甲基官能团(式-C(N2)-)已被用于磷酸基团的烷基化，但存在许多问题。一方面，所述重氮衍生物本身通常是不稳定的，故将这些标记试剂用于标记试剂盒就会产生问题，另一方面，偶合产物是不稳定的，因此，如果标记产物被用来检测任何样品中靶生物分子的存在情况，就不能使用这种方法。
最后，带有重氮甲基官能团的衍生物不溶于水，因此在和仅溶于水或含水缓冲液且在水或含水缓冲液中稳定的生物分子偶合时就要采用两相条件，但这些条件会降低反应速度从而影响偶合效率。
本发明的新型标记试剂可解决这些问题。
根据第一个实施方案，本发明描述了对温度稳定的式(0)的标记试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和
●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
根据第二个实施方案，本发明描述了对温度稳定的式(1)的标记试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●-Y-X表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
有利地是，根据第二个实施方案的第一个变化，所述对温度稳定的试剂如式(2)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根据第二个实施方案的第二个变化，所述对温度稳定的试剂如式(3)所示
其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根据第二个实施方案的第三个变化，所述对温度稳定的试剂如式(4)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根据第一个实施方案的第一个变化，所述对温度稳定的试剂如式(21)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，是0-2之间的整数，优选等于0或1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根据第一个实施方案的第二个变化，所述对温度稳定的试剂如式(22)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是0-2之间的整数，优选等于0或1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
有利地是，根据第一个实施方案的第三个变化，所述对温度稳定的试剂如式(23)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是0-2之间的整数，优选等于0或1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
在上述结构式(0)-(4)和(21)-(23)中，R3和R4分别表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2是有利的。
因此，按照如第二个实施方案的第三个变化(式(4))优选地化合物如式(4’)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
类似地，优选地如第二个实施方案的第一个变化(式(2))所述的化合物如式(2’)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。有利地是，在式(2’)中，带有重氮甲基官能团的取代基在邻位或间位。类似地，按照第一个实施方案的第一个变化(式(21))优选地化合物如式(24)所示 其中
●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是0-2之间的整数，优选等于0或1。
表述“多聚体结构”是指由化学或生物合成子的重复单位形成的聚合物。一个例子如下面实施例34.2所述。许多可用于本发明的这种结构的变体是已知的，例如●线性聚合物(EP-A-0,561,722，EP-A-0,669,991)，●支链聚合物(WO-A-01/92361)。
●颗粒(EP-A-0 827 552)，●树状聚体(dendrimer)(US-A-4,507,466；US-A-4,568,737；US-A-6,083,708)，●多核苷酸，和●多肽。
表述“可检测标记”是指至少一种能够直接或间接产生可检测信号的标记。这些标记的非限制性例子有●产生例如可通过比色法、荧光、发光检测的信号的酶，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，●生色团，如荧光、发光或着色化合物，●具有电子密度的基团，所述电子密度可通过电子显微镜检测，或通过其电学特性，如电导率、电流分析、电量法、阻抗检测，●可检测基团，例如，其分子大小足以使其物理和/或化学特性产生可检测的修饰，这种检测可通过光学方法如衍射、表面胞质基因组共振、表面变异、接触角变化进行，或通过物理方法如原子力光谱、隧道效应进行，●放射性分子，如32P，35S或125I。
优选地，所述标记标记不是放射性标记以避免表面与这些标记有关的安全问题。
在本发明一个特别的实施方案中，所述标记可通过电化学方法检测，特别地，所述标记是铁络合物如二茂铁的衍生物。
也可使用间接系统，如，例如能够和抗配体反应的配体。所述配体/抗配体对是精通此领域的技术人员熟知的，例如，有以下的对生物素/链霉抗生物素蛋白，半抗原/抗体，抗原/抗体，肽/抗体，糖/凝集素，多核苷酸/多核苷酸的互补链。在此情况中，它是带有重氮甲基反应官能团的配体。所述抗配体可通过上述标记直接检测，或者其自身可通过其它配体/抗配体对检测。这种叠加系统(stackingsystem)在实施例中例举。
间接系统的另一个例子利用了配体和抗配体之间的特定的共价键，例如甲基酮和烷氧基胺。这种系统的例子描述在专利申请WO-A-00/40590和WO-A-98/05766中。某些情况下，这些间接检测系统会导致信号放大，如可参看在先专利申请WO-A-00/07982，WO-A-01/92361和WO-A-95/08000以了解用聚合物进行化学放大的例子，或参阅专利申请WO-A-01/44506以了解叠加化学放大系统(stackingchemical amplification system)。
在信号放大的特别实施方案中，标记试剂上至少有两个标记。
特别地，可按照本发明进行信号放大的试剂有以下式(5)的R2-(L)n-结构 其中●R2表示可检测标记，●m是1-100之间的整数，优选1-20之间，和●p是1-10之间的整数，优选2-6之间，最优选是4。
采用结构R2-(L)n与采用上述式(0)-(4)和(21)-(23)没有差别。
另一个优选地用于信号放大的标记试剂如式(6)所示 其中●R2表示可检测标记，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
有利地是，用于信号放大的试剂如式(7)所示 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，优选R3表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2或-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。再一个优选地用于信号放大的标记试剂如式(25)所示 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
在本发明优选地实施方案中，所述示踪剂是低位阻的荧光化合物，如荧光素，丹酰，IR类型的生色团(Li-COR Inc.，Lincoln NE，USA)，花青衍生物如Cy5和Cy3(Randolph J.B.等，Nucleic Acid Res.，25(14)，2923-2929页，1997)，尤其是Cy5衍生物，或者所述示踪剂是低位阻的半抗原，如生物素或枞烯(abietane)衍生物(参见申请WO-A-00/07982)。术语低位阻是指分子量小于1000g/mol。
就荧光团而论，优选使用激发波长大于450nm的荧光团，优选大于600nm。
如果所述示踪剂是不会通过其自身产生信号的半抗原，如生物素，则检测是通过识别如上述标记的抗配体进行的。在与荧光化合物如荧光素偶合的生物素、链霉抗生物素蛋白或抗-生物素抗体的情况下，则优选使用Cy5或藻红蛋白。就枞烯而论，则可使用专利申请WO-A-00/07982所述的单克隆抗体。
特别地，本发明的标记试剂溶于极性溶剂如DMF，DMSO，CH3CN，THF，DMA(二甲基乙酰胺)，NMP(N-甲基吡咯酮)，DME(二甲氧基乙烷)。
优选地，所述标记试剂溶于DMSO或水。
表述水-可混溶的溶剂是指可与体积比至少为5％的水或含有盐的含水缓冲液混溶的溶剂。
有利地是，在上式中，臂L包含乙二醇或聚乙二醇基元(motif)以增加试剂在水中的溶解度。
A是包含至少一个乙烯型的双键的连接臂，它能使重氮甲基官能团和芳环共轭。连接臂A的作用是将重氮甲基官能团与该环隔离以降低位阻，从而保持重氮甲基官能团的稳定性。表述“共轭”是指芳环上的电子沿着连接臂A的碳链离域.例如，臂A可有以下结构 或 或 其中●v是1-10之间的整数，优选v是1或2，和●R10是H或烷基，优选R10是H，甲基或乙基。
因此，这些试剂可结合在生物分子的均匀相中，所述均匀相主要包括含水溶液，即含有至少50％的水。
表述“生物分子”是指含有至少一个能够与感兴趣的靶生物分子反应的识别位点的化合物。生物分子的例子有核酸、抗原、抗体、多肽、蛋白质和半抗原。
术语“核酸”是指一系列至少有两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它任选含有至少一个经修饰的核苷酸，如至少一个含有经修饰的碱基、如肌苷、5-甲基脱氧胞苷、5-二甲基氨基脱氧尿苷、脱氧尿苷、2、6-二氨基嘌呤、5-溴脱氧尿苷、或其它经修饰的可进行杂交的碱基的核苷酸。也可在核苷酸间连键水平如硫代磷酸，H-磷酸，烷基磷酸；主链水平如α-寡核苷酸(FR 2 607 507)或PNAs(M.Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2’-O-烷基核糖上修饰这种多核苷酸。所述核酸可以是天然或合成的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA，用酶扩增技术获得的核酸，如●PCR(聚合酶链式反应)，描述在专利US-A-4,683,195，US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中，及其RT-PCR(逆转录PCR)衍生物，尤其是如专利EP-B-0,569,272所述的一步模式，●LCR(连接酶链式反应)，描述在如专利申请EP-A-0,201,184中，●RCR(修复链式反应)，描述在专利申请WO-A-90/01069，●3SR(自动维持序列复制)，见专利申请WO-A-90/06995，●NASBA(基于核酸序列的扩增)，见专利申请WO-A-91/02818，和●TMA(转录介导的扩增)，见专利US-A-5,399,491。
因此，术语扩增子被用来定义用酶扩增技术产生的核酸。
这些修饰可以相互结合，只要核酸中至少有一个磷酸。
表述“多肽”是指一系列至少两个氨基酸。
表述“氨基酸”是指●编码蛋白质的一级氨基酸，●酶作用后产生的氨基酸，如反-4-羟脯氨酸，●天然的但不存在于蛋白质中的氨基酸，如正缬氨酸，N-甲基-L-亮氨酸，staline(参见Hunt S.，《氨基酸的化学和生物化学》(Chemistry和Biochemistry of the amino acids)，Barett G.C.编，Chapman和Hall，London，1985)，和●用化学官能团保护的氨基酸，所述官能团可用于在固相支持物或在液相中合成，以及非天然的氨基酸。
术语“半抗原”是指非免疫原性化合物，即其自身无法通过产生抗体促进免疫反应，但能够被通过在已知条件下免疫动物，尤其是用半抗原-蛋白质共轭物进行免疫而得到的抗体识别的化合物。这些化合物的分子量通常小于3000Da，更多情况下小于2000Da，例如，可以是糖基化的肽、代谢物、维生素、激素、前列腺、毒素或各种药物、核苷和核苷酸。
术语“抗体”包括多克隆或单克隆抗体，通过遗传重组获得的抗体以及抗体片段，如Fab或F(ab’)2片段。
术语“抗原”是指能够产生抗体的化合物。
术语“蛋白质”包括全蛋白质和杂蛋白，如核蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白和糖蛋白，纤维状或球状的，以其特有的构象形式。
有利地是，所述生物分子含有磷酸基团，即至少具有以下一种基元的基团
或 它可以天然存在于生物分子中，或者可通过化学修饰或酶修饰将其引入生物分子。化学修饰蛋白质的例子表示在《蛋白质共轭和交联的化学》(“Chemistry ofprotein conjugation和cross linking”)，S.S.Wong，CRC Press，1991。
优选地，所述生物分子是核酸。
本发明的一些有利的试剂是a)式(8)的试剂 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是含有至少两个共价键的线性连续的连接臂，和●n是等于0或1的整数。
b)式(9)的试剂 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是含有至少两个共价键的线性连续的连接臂，和●n等于0或1的整数。
c)式(10)的试剂
其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是含有至少两个共价键的线性连续的连接臂，和●n等于0或1的整数。
优选地，所述标记试剂有以下结构a)式(11) 其中R1表示甲基或苯基，b)式(12) 其中R1表示甲基或苯基，c)式(13) 其中R1表示甲基或苯基。
本发明其它优选地试剂具有以下结构a)式(14)
其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是含有至少两个共价键的线性连续的连接臂，和●n等于0或1的整数，b)式(26) 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
c)式(15) 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是含有至少两个共价键的线性连续的连接臂，和●n是等于0或1的整数。
d)式(27)
其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
不考虑试剂的变体或实施例，L可包含单元-(O-CH2-CH2)-，该单元重复1-10次，优选重复1-10次，更优选重复2-5次。
本发明的另一个目的是描述用来合成一种标记试剂以及几种标记试剂的方法，这些试剂对温度稳定，且能够用所述方法获得，该方法包括以下步骤a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于0或1的整数，b)得到具有与R6互补的反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的互补官能团与式(16a)的衍生物的官能团R6反应以形成共价键，d)使肼或肼衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
如果官能团R6是COOH或COOM，互补官能团R7是NH2。
如果官能团R6是NH2，互补官能团R7是COOH。
如果官能团R6是OH，互补官能团R7选自烷基卤，磺酸盐，甲苯磺酸盐。
如果官能团R6是SH，互补官能团R7选自烷基卤，马来酰亚胺。
所述合成方法的一个变体包括以下步骤a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于0或1的整数，b)得到具有至少两个相同或不同的反应官能团R8的连接臂L，第一个官能团R8与R6互补，第二个官能团R8与R7互补，此外，得到具有反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使连接臂L的第一个反应官能团R8与式(16a)的衍生物反应以形成共价键，然后在至少一种偶联剂存在时，使连接臂L的第二个反应官能团R8与标记或标记前体反应以形成共价键，d)使肼或肼衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
在这个特例中，所述方法包括一个额外步骤，该步骤中，连接臂L是在与标记或标记前体反应之前加到化合物(16a)上的。此时，连接臂L至少带有与R6互补的第一个反应官能团R8，以与化合物(16a)的臂L偶合，和至少带有第二个官能团R8，以使标记或标记前体与连接臂L偶合，根据偶合策略和化合物(16a)和标记或标记前体各自携带的反应官能团R6和R7，臂L所带的两个官能团可以是相同或不同的。
如果官能团R6和/或官能团R7是COOH或COOM，则第一个和/或第二个互补官能团R8是NH2。
如果官能团R6和/或官能团R7是NH2，则第一个和/或第二个互补官能团R8是COOH。
如果官能团R6和/或官能团R7是OH，则第一个和/或第二个互补官能团R8独立选自烷基卤、磺酸盐、甲苯磺酸盐。
如果官能团R6和/或官能团R7是SH，则第一个和/或第二个互补官能团R8独立选自烷基卤、马来酰亚胺。
如果R6是OH或SH，则所述偶联剂是碱，如氢氧化钾或碳酸钾或有机碱。
如果R6是COOH或NH2，则偶联剂选自，例如用于肽合成的偶联剂。可参考M.Bodansky的《肽化学-实用教科书》“Peptide Chemistry，a practicaltextbook”)，Springer Verlag出版，柏林，1988，第5章，55-73页。
表述“肼衍生物”是指具有NH2-NH-官能团的分子。这种衍生物的例子有甲苯磺酰肼。
腙到重氮甲基的转化是用常规方法进行的，尤其是用MnO2氧化。
其它可用的方法如X.Creary，《有机合成》(Organic Syntheses)，Wiley纽约，Coll.第7卷，438-443页，1990；H.Zollinger，《重氮基化学II》(DiazoChemistry II)，VCH，Weinheim，34-47页，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995所述。
就使用甲苯磺酰肼衍生物而论，该方法描述在X.Creary，《有机合成》(Organic Synthesis)；Wiley纽约，Coll.第7卷，438-443页，1990。
在任何方法的一个特别实施例中，所述方法包括●保护化合物(16a)的酮或醛官能团的额外步骤(如果R1是H)，和●将所述酮或醛官能团去保护的额外的后续步骤。
例如，这种保护是用缩醛基团实现的。去保护是通过合适的方法进行的，如对缩醛基团可在酸性介质中进行。精通此领域的技术人员可根据化合物确定在合成的那个阶段进行保护和去保护步骤。
根据本发明的另一个实施方案，描述了合成一种和几种标记试剂的方法，所述标记试剂对温度稳定，且能够用所述方法获得，该方法包括以下步骤a)得到式(16)的衍生物
其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●R6表示COOH，NH2，OH或SH。
b)得到具有与R6互补的反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的互补官能团与式(16a)的衍生物的官能团R6反应以形成共价键，d)使肼或它的一个衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
如果官能团R6是COOH，则互补官能团R7是NH2。
如果官能团R6是NH2，则互补官能团R7是COOH。
如果官能团R6是OH，则互补官能团R7选自烷基卤、磺酸盐、甲苯磺酸盐。
如果官能团R6是SH，则互补官能团R7选自烷基卤，马来酰亚胺。
如果R6是OH或SH，则偶联剂是碱，如氢氧化钾或碳酸钾。
如果R6是COOH或NH2，则偶联剂选自，例如用于肽合成的偶联剂。可参考M.Bodansky的《肽化学-实用教科书》，Springer Verlag出版，柏林，1988，第5章，55-73页。
表述“肼衍生物”是指具有NH2-NH-官能团的分子。这种衍生物的例子有甲苯磺酰肼。
腙到重氮甲基的转化是用常规方法进行的，尤其是用MnO2氧化。
其它可用的方法如X.Creary，《有机合成，Wiley纽约，Coll.第7卷，438-443页，1990；H.Zollinger，《重氮基化学II》，VCH，Weinheim，34-47页，1995；T.L.Holton和H.Shechter，J.Org.Chem.，60，4725-4729，1995所述。
就使用甲苯磺酰肼衍生物而论，该方法描述在X.Creary，《有机合成》Wiley纽约，Coll.第7卷，438-443页，1990。
本发明优选地方法包括以下步骤a)得到式(17)的衍生物
其中R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，b)得到具有羧酸官能团的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的羧基官能团与式(17)的衍生物的伯胺官能团反应以形成酰胺键，d)使肼与式(17)的衍生物的酮或醛官能团反应以形成腙，和e)在MnO2存在时将所述腙氧化成重氮甲基官能团。
在所有上述方法中，有利地是，烷基是直链或支链C1-C4基团，芳基是任选取代的苯基。
优选地，R4是甲基或苯基，这就是说，式(17)的衍生物是在邻、间或对位被胺取代的乙酰苯或二苯甲酮。
根据所需的最终产物，衍生物(17)的胺官能团位于邻、间或对位，优选在邻位或间位。
如上所述，所述偶联剂特别选自用于肽合成的偶联剂，例如，当碱如N-甲基吗啉存在时为iBuOCOCl。
表述“标记前体”是指至少有一个被任选保护的反应官能团的化合物，所述反应官能团不同于重氮甲基官能团且与所述随后可被附上标记的官能团相容，即在该方法的任一步骤后尤其是在MnO2的氧化步骤之前。特别地，所述标记前体可包含连接臂L。下面给出了在信号放大中使用标记前体的方法，但采用精通此领域的技术人员熟知的各种保护基团其它变体是可能的。
就是信号放大而论，合成方法是类似的。所述标记前体具有下式(18)所示的结构。
其中，GP1和GP2表示两个保护胺官能团的基团，它们是相同或不同的，且p是1-10之间的整数，优选2-6，最好是4。有利地是，GP1和GP2是不同的以便能加入一些基元，解释如下。
可用于本发明的保护基团GP1或GP2的例子表示在T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第二版，John Wiley和Sons，纽约，1991，优选通常用于肽合成的那些，如Boc(叔-丁氧基羰基)，Fmoc(9-芴基亚甲氧基羰基)，Cbz(羧苄基)或Alloc(烯丙氧基羰基)。
特别地，GP1和GP2分别是保护基团Boc和Fmoc。
这种是有羧基官能团的前体和式(17)的衍生物之间的反应是在偶联剂存在下进行的以形成酰胺键。在常规条件下将这两个保护基团之一去保护后，例如用碱如哌啶将Fmoc去保护，释放的胺官能团被用来偶合另一个式(18)的分子。如必要该过程被重复多次以得到多个被保护基团(如Boc官能团)保护的NH2官能团。加入的基元在1和100之间，优选在1-20之间。
使肼与苯基酮衍生物的酮官能团反应以形成腙，然后在MnO2存在时将其氧化以形成重氮甲基残基。然后，将带有Boc基团的胺官能团去保护后，将示踪剂，如用N-羟基琥珀酰亚胺基活化的生物素，与胺官能团偶合以得到具有如式(5)所示单元R2-(L)n-的试剂。
本发明的另一个目的是描述标记生物分子，尤其是核酸的方法，以及用该方法获得的产物，所述方法包括使生物分子和本发明的标记试剂在基本上为含水均匀溶液的溶液中接触。
表述“基本上为含水溶液”是指至少含50％水的溶液。该溶液优选含有像缓冲溶液那样的盐。
表述“均匀溶液”是指单相溶液，如水/DMSO溶液，而不是两相溶液，如水/氯仿溶液。
标记反应的特定条件根据生物分子和标记而不同。就核酸而言，则pH在5-8之间可有效进行标记。特别地，pH在5.5-7.0之间对本发明的所有试剂都是优选地。用式(11)的试剂，则标记的pH范围就较宽。对该试剂，pH在3-8之间就足以得到良好的标记。
特别地，标记和片段化单链或双链核酸的方法包括以任何次序的以下步骤-将所述核酸片段化，-通过选自式(19)的化合物将一个标记附到至少一个片段上 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，和●Z包括一个可检测标记，所述试剂主要和所述片段的至少一个磷酸共价偶合。
选择根Z和/或R1以稳定重氮甲基官能团，这就是说Z或R1这两个基团中至少有一个具有苯基核。
标记试剂和核酸之间的键是共价的，但前面已描述过，尤其在叠加系统或者在标记是间接可检测的情况下可使用非共价相互作用。因此，术语“附着”包括这些不同的可能性。
优选地，所述标记试剂选自式(20)的化合物 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●Z选自 或 或 或 其中■R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和■-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
在按照式(19)的特定实施方案中，Z具有以下结构 此时，如果R1是H，标记试剂是1-芘基重氮甲烷(PDAM)。
尽管这种标记是荧光的，其激发波长与核酸的激发波长很接近。用直接抗芘基元的单克隆抗体进行间接检测是优选地。产生这种抗体的方法是精通此领域的技术人员熟知的(参见，如专利申请WO-A-00/07982)。
本发明的其它新型试剂由式(1)-(27)描述，能够用本发明的合成方法获得的试剂也是优选地用于上述片段化和标记方法的试剂。
所述标记和片段化方法特别适用于被标记的核酸要与许多核酸，尤其是寡核苷酸杂交的情况，所述核酸附着在固相支持物的预定位置上以形成DNA芯片。表述“DNA芯片”是指小的固相支持物，其上在预定的位置上附有许多捕获探针。实际上，附到固相支持物上的核酸的密度在杂交时可造成高的空间约束，且所述片段化可改进这种杂交步骤。这些DNA芯片的例子表示在以下出版物中，例如，G.Ramsay，Nature Biotechnology，16，40-44页，1998；F.Ginot，Human Mutation，10，1-10页1997；J.Cheng等，Molecular diagnosis，1(3)，183-200页，1996；T.Livache等，Nucleic Acid Research，22(15)，2915-2921页，1994；J.Cheng等，Nature Biotechnology，16，541-546页，1998。
所述片段化和标记是在一个步骤或在两个步骤中进行的，且标记可在片段化之前、之后或与其同时进行。
优选地，标记和片段化是同时进行的，即这两个步骤必需的试剂和，例如核酸，被同时放在基本上含水的均匀溶液中。尤其是在化学或酶片段化的情况下。在用物理方法进行机械片段化时，标记和片段化可同时进行，意指物理方法被同时用于至少含有核酸和标记试剂的基本上含水的均匀溶液。
核酸的片段化是用酶、化学或物理途径进行的。
例如，通过酶途径片段化核酸是通过核酸酶进行的。
例如，通过物理途径片段化核酸是通过超声处理解法或放射法进行的。
如果核酸是RNA，通过化学途径片段化是通过常规的方法进行的(参见，如Oivanen M.等，Chem.Rev.，98，961-990，1998)。
G.Pratviel等在Adv.Org.Chem.，45，251-312页，1998或G.Pratviel等在Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，34，746-769页，1995综述中描述了金属络合物可用于DNA或RNA的片段化。
在第一个实施方案中，RNA的化学片段化是用组合的金属阳离子或用化学催化剂进行的。此时，金属阳离子是Mg2+，Sr2+，Ba2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Ru3+，Ce3+，Eu3+，Tb3+，Tm3+，Yb3+或Lu3+离子，化学催化剂包括咪唑，或取代的类似物，如N-甲基咪唑，或任何与RNA亲合的化学分子且带有咪唑核或取代的类似物。采用金属的片段化条件描述在专利申请WO-A-99/65926中。有利地是，金属是Mg2+，Mn2+，Zn2+，Tb3+或Ce3+，优选Mg2+，Mn2+，Zn2+。
用浓度在2-100mM之间的金属阳离子如Mn++，浓度在2-100mM之间的咪唑可得到有效的片段化条件。
用浓度在3-15mM之间的金属阳离子如Mn++和浓度在20-50mM之间，尤其是30mM的咪唑可得到特别有效的片段化条件。
反应pH应在5和8之间。有利地是，pH在5.5和6.5之间，优选pH为6。因此，pH为6对用RNA进行标记和片段化非常有利(参见上面对标记的讨论)。
在第二个实施方案中， RNA的化学片段化是通过聚胺如精胺、腐胺或尸胺的作用进行的。浓度为5-100mM可进行片段化。后者完全来自10mM聚胺。
在第三个实施方案中，RNA的化学片段化是通过人工核酸酶的作用进行的(参见G.Pratviel等，Adv.Inorg.Chem.，45，251-312页，1998；D.S.Sigman等Chem.Rev.，93，2295-2316页，1993)，如和金属阳离子如铁、铜或锌结合的1，10-菲咯啉。这些阳离子分别获自FeSO4或CuCl2或ZnCl2溶液。浓度在2-50mM之间，尤其是4-10mM之间的1，10-菲咯啉被用于RNA的片段化。
通过化学途径片段化DNA是通过使核酸与产生脱碱基位点的化学方法接触的。脱碱基位点的形成来自连接2-脱氧核糖和核碱基的N-糖苷键的切割。它包括对嘌呤(鸟嘌呤，腺嘌呤)损失的或对嘧啶(胞嘧啶，胸腺嘧啶)的脱嘧啶作用。
这种脱嘌呤作用是在生理条件(pH7.4，37℃)下自发产生的，但反应速度非常低，为每秒3×10-11脱嘌呤作用，即不足以进行片段化。为增加反应速度，使用了烷基化剂，它使N-糖苷键脆弱，或使用酶如DNA糖基化酶，尤其是尿嘧啶DNA糖基化酶。
通过脱嘌呤或脱嘧啶作用获得的脱碱基位点很不稳定。室温下，在碱性介质中获得了在这一位点水平上的片段化。在酸性介质中，高温也可加速这种片段化。用能够引发β-消除现象的分子也能加速片段化。
片段化的优选实施例是用酸性pH获得的，即pH小于5。优选地pH是3。
pH3的甲酸钠缓冲液可有效片段化本发明的片段。这种缓冲液适合于一步标记条件，这将在实施例中证实。更加有利的是，可用酸性介质(HCl，碳酸盐，H2SO4)。
在本发明特别地实施方案中，出于进一步提高片段化的目的，所述脱氧核糖核酸含有至少一个经修饰的更易于产生脱碱基位点的碱基。
可使用各种经修饰的碱基、如N7-烷基嘌呤、N3-烷基嘌呤、O6-烷基嘌呤、8-溴代嘌呤、8-硫代嘌呤、8-烷基硫代嘌呤、8-叠氮嘌呤或8-烷基磺酰嘌呤。
当要标记的核酸是通过酶扩增技术如PCR产生时，使用8-溴代嘌呤可在扩增时进行有效的掺入，相对而言，这可简化本发明的片段化和标记的方法，同时保持酶扩增步骤极好的敏感性。
本发明描述了标记的生物分子，尤其是能够用本发明任一方法获得的标记的核酸。
本发明还涉及用来检测生物分子，尤其是含有本发明标记试剂的靶核酸的试剂盒。根据试剂盒的应用，可在试剂盒中加入其它成分，如溶胞方法(微生物和/或细胞)和/或浓缩方法(如二氧化硅或磁性颗粒)和/或酶催化扩增方法。
本发明涉及如上定义的标记的生物分子，尤其是标记的核酸的应用，它被作为探针以检测靶生物分子，尤其是靶核酸。
本发明还涉及上述核酸的应用，它被作为可与捕获探针结合的标记的靶。
为检测和/或量化和/或纯化靶生物分子，所述标记的生物分子能够与靶生物分子形成复合物。例如，为检测核酸类型的靶分子，标记的核酸应与靶充分互补，以根据反应条件，尤其是温度或反应介质的盐度，进行特异地杂交。
出于研究和在制药工业中筛选药物、诊断传染性疾病或遗传疾病或食品或工业控制的目的，所述检测方法被用于测序、信使RNA表达序型分析或突变的筛选。
诊断领域，尤其是传染性疾病(例如AIDS或肺结核)的趋势是降低灵敏度水平以检测样品中的单个分子，血液或尿液或脑脊液类型的液体样品可以有几个毫升。只有当所有步骤，从取样到得出结果都是最优化的，才可得到此灵敏度水平。本发明的各种方法可以没有困难地实现这种最优化，因为本发明的试剂、方法和过程可广泛用于各种生物分子。特别地，当需要采用酶扩增步骤以得到必需的灵敏度时(病毒或细菌感染，如HIV，HCV或肺结核)，本发明所述的标记和/或片段化方法不会影响扩增技术的灵敏度，因为它不必替代酶扩增技术中所用的脱氧核糖核苷酸，或者因为掺入的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸不会改变灵敏度。
本发明所述的化学移植方法的特征在于其反应性和特异性，描述如下●在第一个实施方案中，所述化学移植方法被用于核酸共价附着于固相支持物上。
●在该方法的第一个变化中，重氮甲基官能团的前体，如上述酮或肼，在化学合成时被引入，且重氮甲基官能团在第二步中被引入核酸上。
●在该方法第二个优选地变化中，重氮甲基官能团被引入所述固相支持物，且核酸通过核酸的磷酸，尤其是末端(5’或3’)磷酸，附到固相支持物上。
在核酸的3’或5’端引入磷酸是熟知的(参见《寡核苷酸和类似物的方案、合成和特性》(“Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis andProperties”)由S.Agrawal出版，Humana Press，Totowa，New Jersey)。
在这种固相支持物的一个特实施例中，带有配体，尤其是半抗原如生物素或枞烯的标记试剂被附到固相支持物上，该固相支持物上已经共价附着或吸附了抗配体，如链霉抗生物素蛋白或如抗体。这些固相支持物是精通此领域的技术人员熟知的，且可在商业上获得(例如微量滴定平板-链霉抗生物素蛋白或乳胶-链霉抗生物素蛋白)。此时，标记的作用不再是进行检测，而且要使标记试剂附到固相支持物上。然后重氮甲基官能团就可与核酸反应。这种试剂的例子是式(11)、(12)、(13)的衍生物或PDAM衍生物，它们可被用来制造这种固相支持物。可用单克隆抗体技术来制备抗大量标记如荧光素或Cy5的衍生物的抗体。利用制备固相支持物的间接模式，不必太困难，精通此领域的技术人员就可使用带有本发明标记试剂的固相支持物，其中配体/抗配体反应被用来使重氮甲基官能团附到固相支持物上。
固相支持物的第二个实施方案涉及特殊的支持物如乳胶。可用不同的聚合反应模式从带有重氮甲基官能团或优选一个官能团的可聚合官能团单体制备带有重氮甲基官能团的颗粒，优选一个官能团是在重氮甲基官能团的前体，如醛或酮，尤其是●在间歇反应器中进行的聚合反应在与其它成分反应开始之前将单体引入此反应器，随后不必再加入。由于单体反应性差异，该方法通常会导致成分漂变。产生成分与转化率函数大不相同的大分子可证明这一点。该方法对于在表面引入不是非常有效，因为大部分功能性单体都有在颗粒内部或以水溶性聚合物形式流失的危险。当用具有极性性质的单体分批进行共聚反应时，可得到较大量的小颗粒，但转化率有限。这种行为与高水溶性单体有关，并且是由于均相成核机制占优势造成的。
●半连续聚合至少部分单体是在反应开始和结束之间被引入反应器的。此添加可以固定速度或根据给定分布进行。目的是控制单体混合物的加入以得到有受控组成(控制界面的组成)的共聚物；因此常有添加条件，这样聚合反应的速度高于添加的速度。
●喷射加成聚合(Shot addition polymerization)一旦聚合反应在进行中，或在碱性单体存在时，只有功能性单体以受模的方式引入受控的系统。因此，操作的成功取决于共聚动力学的现有知识。这是促进表面掺入的有效方法。实验条件(添加时的转化程度，组成以及单体混合物的浓度)的选择能够使表面产率最优化。
●接种聚合(Seed polymerization)它包括在含有乳胶的已经构成并完全定性的系统中加入功能性单体。所述功能性单体可单独加入或与作为种子的碱性单体的混合物加入，加入可一步或半连续进行。
接种聚合、喷射加成聚合和半连续聚合技术是优选地，因为它们在表面最大限度地引入了带有重氮甲基官能团前体的衍生物。带有醛官能团的颗粒的例子如B.Charleux等，Die Makromolecular Chem.，193，187页和205页，1992或在专利EP-B-0,350,407中所述。
本发明的另一个目的是描述式(30)的对温度稳定的结合中间体 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R15表示亲核或亲电子的反应官能团，尤其是COOH，NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，异氰酸盐，异硫氰酸盐，马来酰亚胺，烷基卤，活化的酯，甲苯磺酸盐，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R15-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
本发明优选地结合中间体如式(30a)所示 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R15表示亲核或亲电子的反应官能团，尤其是COOH，NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，异氰酸盐，异硫氰酸盐，马来酰亚胺，烷基卤，N-羟基琥珀酰亚胺酯，甲苯磺酸盐，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，
●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
固相支持物的第三个实施方案包括得到带有第一亲核或亲电子反应官能团的固相支持物，如NH2，SH，OH，O-NH2，烷基酮，醛，异氰酸盐，异硫氰酸盐，马来酰亚胺，烷基卤，N-羟基琥珀酰亚胺酯，甲苯磺酸盐，然后与上述式(30)或(30a)的结合中间体反应，其官能团R15与固相支持物的第一反应官能团互补。固相支持物和结合中间体之间的反应任选发生在偶联剂存在时以形成共价键。
根据上述不同的实施方案，这种固相支持物至少含有重氮甲基官能团，尤其是间接附有本发明标记试剂的固相支持物，这也是本发明的一个主题，以及含有核酸的固相支持物，所述核酸通过重氮甲基官能团附到固相支持物上。
这种固相支持物的第一个应用是制造DNA芯片。已有固相支持物上不连续位置和预定位置分布核酸的方法。
专利US-A-6,110,426提出了用毛细管生产这些DNA芯片的方法，所述毛细管与固体表面接触以输送受控体积的液体。在毛细管末端和固相支持物之间发生有效接触，这样滴液就可由毛细管存放。同样，专利US-A-6,083,763描述了一套在装置中滑行的毛细管以补偿其高度的差异。它们与由特定寡核苷酸的毛细管放置的平整表面接触。
专利US-A-6,083,762涉及分布滴液的系统，所述滴液含有与压电换能器偶联的微分配器，以将体积小于1纳升的滴液射到固体表面。对毛细管臂施加热源以形成喷射出预定体积溶液的泡也可得到类似的结果(见T.Okamoto等，NatureBiotechnology，18，438-441页，2000)。
重氮甲基官能团可将核酸共价移植到支持物上。尤其与吸附相比，移植是简单的，连接是稳定的，且与末端磷酸有关的反应的选择性使得能够将核酸定向偶合到固相支持物上，这样就减小了位阻以利于随后的杂交步骤。
本发明固相支持物的第二个应用是核酸纯化。
就纯化而论，纯化是直接(带有重氮甲基官能团的固相支持物与待纯化的核酸反应)或间接的(将捕获的核酸附到固相支持物上。)。这些捕获的核酸与将被捕获以便以所需的特异性程度与其杂交的靶充分互补，且“捕获的核酸/固相支持物”复合物使靶核酸纯化。
固相支持物优选为分散形式以作为乳胶颗粒用于纯化，如磁性颗粒。
表述“纯化步骤”是指将微生物的核酸和在溶胞阶段释放的细胞组分分离，所述溶胞发生在核酸纯化之前。这些溶胞阶段是熟知的。例如，作为指导可用专利申请中描述的溶胞方法-WO-A-00/60049，关于超声溶胞，-WO-A-00/05338，关于磁性溶胞和机械溶胞相结合，-WO-A-99/53304，关于电溶胞，以及-WO-A-99/15621，关于机械溶胞。
精通此领域的技术人员能够用其它熟知的溶胞方法，如热休克或渗透休克(osmotic shock)或用离液剂如胍盐处理(专利US-A-5,234,809)。
这个步骤通常可浓缩核酸。例如，可用使用磁性颗粒(见关于此主题的专利US-A-4,672,040和US-A-5,750,338)，并通过洗涤步骤纯化核酸，所述核酸已经附到这些磁性颗粒上。如果还需要随后扩增所述核酸，这种纯化核酸的步骤特别有利。关于这些磁性颗粒的一个特别有利的实施方案描述在专利申请WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。
这里使用的术语“固相支持物”包括所有可附着核酸的物质。可将合成材料或天然材料任选地化学修饰，作为固相支持物，尤其是以多糖如纤维素为基质的材料，如纸、纤维素衍生物如醋酸纤维素和硝基纤维素或葡聚糖；聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯型单体的，天然纤维如棉花，以及合成纤维如尼龙；无机物质，如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；乳胶；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等。固相支持体的形式可以是微量滴定平板、膜、颗粒或用玻璃或硅或衍生物制成的基本上呈平面的板。
本发明最后涉及捕获核酸的方法，所述方法包括以下步骤●得到其上直接或间接附有至少一种含有重氮甲基官能团的分子的固相支持物，●将可能含有游离核酸的生物样品与其接触，和●洗涤分子共价附着到至少一种核酸上的固相支持物。
在申请人于2001年5月4日提交的注册号为FR01/06039号的另一项专利申请以及与本发明同日提交的其国际延期申请中可找到其它信息。
附图简述附图和实施例代表了特定的实施方案，而不是要限制本发明的范围。


图1表示本发明所用各种试剂的结构式及其缩写(o-表示邻位，m-表示间位，p-表示对位)。
图2A-2I表示通过毛细管电泳分析得到的作为各种试剂的共价偶合与时间函数的分布图，所述试剂在尿苷3’-单磷酸(3’-UMP)上带有重氮甲基官能团，如实施例6.1所述●图2A，PDAM，●图2B，2毫摩每升(mM)DPDAM，●图2C，20mM DPDAM，●图2D，PMDAM，●图2E，NPDAM，●图2F，BioDPDAM，●图2G，间-BioPMDAM，●图2H，对-BioPMDAM，●图2I，邻-BioPMDAM。
图3A-3D表示通过毛细管电泳分析得到的作为时间的函数的间-BioPMDAM与四种(4)核苷酸3’-磷酸反应的分布图，如实施例6.2所述●图3A，核糖核苷酸序列中的3’-CMP，●图3B，核糖核苷酸序列中的3’-AMP，●图3C，核糖核苷酸序列中的3’-GMP，和●图3D，脱氧核糖核苷酸序列中的3’-TMP。
图4表示通过毛细管电泳分析得到的作为时间函数的间-BioPMDAM与二核苷酸5’-ApUp反应的分布图，如实施例6.3所述。
图5A-5D表示间-BioPMDAM试剂和四种(4)核糖核苷酸3’-单磷酸间各种结合物的D2O的质子NMR谱，如实施例6.4所述●图5A，3’-GMP，●图5B，3’-AMP，●图5C，3’-CMP，和●图5D，3’-UMP。
图6表示合成标记试剂的流程，所述标记试剂带有两种(2)生物素，用于信号的化学放大。
图7表示酸介质中通过形成脱碱基位点的片段化机制。
图8显示，根据实施例16.1，酸性pH时各种修饰的核苷，核苷(8-溴-2’-脱氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脱氧胞苷(5-BrdC)以及四种(4)天然核苷(dA，dC，dG和dT)的降解动力学。结果是以相对于以分钟表示的反应时间(x-轴)，起始核苷的百分水解(y-轴)形式表示的。
图9表示，根据实施例19.2，在60℃，作为时间函数的PDAM试剂对合成的寡脱氧核苷酸(ODN)5’-磷酸的标记动力学。结果是以相对于以分钟(min)表示的反应时间(x-轴)的百分标记形式表示的。。
图10表示，根据实施例19.3，作为反应温度函数的百分标记。结果如图10所示，y-轴表示百分标记，x-轴表示以℃的反应温度。
图11表示用商业试剂5-硝基香草醛合成式(4’)的试剂的途径。通过形成腙然后腙与MnO2氧化使醛官能团能得到重氮甲基官能团。
优选实施方案的描述实施例1用生物素合成试剂一般合成流程 实施例1.1间-BioPMDAM的合成●化合物生物素间-乙酰苯1a将D-生物素(1.0克(g)，4.1毫摩尔(mmol)溶于45毫升(ml)热的无水DMF。将混合物在氩气下冷却至0℃，然后连续加入N-甲基吗啉(590微升(μl)，5.33mmol)和异丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。将混合物搅拌30分钟(min)，然后加入溶于10ml DMF的3-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)和N-甲基吗啉(480μl，4.35mmol)。将溶液在0℃搅拌2小时(h)，然后蒸发至干。x将残余物溶于3ml MeOH，然后加入50ml水。过滤所得沉淀，用水、CH2Cl2和醚洗涤以得到1.2g(80％)粗产品1a。从MeOH-H2O对中重结晶得到白色粉末状的1a(1.01g，70％)。
熔点145℃。-IR(KBr)3280，2931，2857，1691，1590，1540，1487，1434，1298，1266cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.33(t，J＝8Hz，2H)；2.55(s，3H)；2.58；(d，J＝12Hz，1H)；2.83(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.13(m，1H)；4.15(m，1H)；4.31(m，1H)；6.34(s，1H)；6.41(s，1H)；7.44(t，J＝8Hz，1H)；7.64(d，J＝8Hz，1H)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.17(s，1H)；10.05(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z362[M+H]+。
●化合物间-腙2a将1a溶液(500mg，1.38mmol)和溶于无水乙醇(8ml)的肼一水合物溶液(200μl，4.15mmol)加热回流2h。冷却至室温后，滤出白色沉淀，用水洗涤，然后用醚洗涤并干燥。由此得到385mg(74％)白色粉末状的产物2a。
熔点185℃。-IR(KBr)3298，2931，2857，1698，1665，1626，1541，1494，1470，1446，1330，1265cm-1.-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝1.3-1.7(m，6H)；1.98(s，3H)；2.26(t，J＝8Hz，2H)；2.56(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.39(s，3H)；6.42(s，1H)；7.22(m，2H)；7.50(d，J＝8Hz，1H)；7.84(s，1H)；9.82(s，1H).-MS(FAB/甘油)，m/z376[M+H]+。
●化合物间-重氮甲烷3a将2a(180mg，0.48mmol)溶于2ml DMF。然后加入MnO2(340mg，3.9mmol)。在室温搅拌30分钟后，将此混合物通过烧结的漏斗过滤，漏斗中装有硅藻土(厚度0.5cm)和3粉状分子筛(0.5cm)。将反应混合物浓缩至体积约为0.5ml，然后加入5ml醚。过滤所得沉淀，用水洗涤然后干燥。得到粉红色粉末状的化合物3a(170mg，95％)。
熔点160℃。-IR(KBr)3278，2935，2859，2038，1704，1666，1605，1577，1536，1458，1430，1263cm-1.-1H NMR(300MHz)δ＝1.3-1.7(m，6H)；2.11(s，3H)；2.28(t，J＝8Hz，2H)；2.57(d，J＝12Hz，1H)；2.81(dd，J＝12和5Hz，1H)；3.11(m，1H)；4.13(m，1H)；4.29(m，1H)；6.33(s，1H)；6.41(s，1H)；6.60(m，1H)；7.25(m，3H)；9.84(s，1H)。
实施例1.2对-BioPMDAM的合成●化合物生物素对-乙酰苯1b
将D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于45ml热的无水DMF。将混合物在氩气下冷却至0℃，然后连续加入N-甲基吗啉(590μl，5.33mmol)和异丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。将混合物搅拌30min，然后加入4-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。将溶液在0℃搅拌2h，然后蒸发至干。将残余物溶于50ml水。过滤所得沉淀，用水洗涤，然后用50ml热MeOH洗涤。在加热的同时将白色沉淀溶于DMF，然后过滤所得溶液并用MeOH洗涤。回收滤液并蒸发至干得到888mg1b(2.46mmol，60％)。
熔点260℃。-IR(KBr)3260，2930，2358，1706，1673，1610，1526，1401，1380，1322，1257，1150cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝8.82(s，1H，NH-CO)；7.57(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.83(d，2H，J＝9Hz，Ar-H)；6.40(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.32(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.10(s，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)。
●化合物对-腙2b将化合物1b(870mg，2.4 mmol)溶于热的乙醇(99％，8ml)，然后加入肼一水合物(995μl，19.5mmol)。将此溶液加热回流3h。过滤所得白色沉淀并用冰水洗涤。由此得到820mg(90％)白色粉末状的产物2b。
熔点305℃。-IR(KBr)3281，3183，2930，2857，1698，1658，1593，1521，1459，1401，1325，1263，1187cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.68(s，1H，NH-CO)；7.52(s，4H，J＝9Hz，Ar-H)；6.43(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.21(s，2H，NH2)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.81和2.56(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.32(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.97(s，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物对-重氮甲烷3b将2b(200mg，0.53mmol)溶于10ml DMF。然后加入800mg MnO2。搅拌10分钟后将混合物通过硅藻土(0.5cm)-分子筛(0.5cm，粉末状)混合层过滤。将反应混合物蒸发至干，然后用醚洗涤并干燥。得到粉色粉末状的化合物3b(190mg，96％)。
熔点180℃(dec.).-IR(KBr)3257，2930，2857，2032，1698，1597，1524，1510，1455，1404，1307，1259，1180cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.18(s，1H，NH-CO)；7.88(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；7.7(d，2H，J＝6Hz，Ar-H)；6.41(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.34(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.12(m，1H，CH-CH-NH)；3.11(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.35(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.10(s，3H，CH3)；1.60-1.34(m，6H，(CH2)3)。
实施例1.3邻-BioPMDAM的合成●化合物生物素邻-乙酰苯1c将D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于45ml热的无水DMF。将混合物在氩气下冷却至0℃，然后连续加入N-甲基吗啉(590μl，5.33mmol)和异丁基氯甲酸酯(840μl，6.60mmol)。将混合物搅拌30min，然后加入2-氨基乙酰苯(824mg，6.10mmol)。将溶液在室温搅拌3小时30分钟，然后蒸发至于。将残余物溶于50ml水。过滤所得沉淀，用水洗涤，然后用50ml热MeOH洗涤。过滤所得沉淀并用水洗涤。将产物溶于热的MeOH并加水再沉淀以进行重结晶。将沉淀物过滤，用水洗涤，然后用醚洗涤以得到1.1g(2.95 mmol，72％)粗产品1c。
熔点150℃。-IR(KBr)3248，2930，2857，2359，1691，1669，1651，1582，1528，1448，1354，1310，1245，1161cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.24(s，1H，NH-CO)；8.33(d，1H，J＝8.5Hz，Ar-H)；7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H)；7.57(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；7.18(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；6.44(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.80和2.55(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.61(s，3H，CH3)；2.37(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.62-1.38(m，6H，(CH2)3)。
●化合物邻-腙2c将化合物1c(500mg，1.38mmol)溶于热的乙醇(99％，8ml)，然后加入肼一水合物(572μl，11.1mmol)。将溶液加热回流50分钟。将溶液蒸发至干。过滤所得白色沉淀，用水洗涤然后用醚干燥。由此得到416mg(11.1mmol，80％)白色粉末状的产物2c。
熔点161℃。-IR(KBr)3412，3240，2930，2857，2351，1706，1677，1604，1590，1531，1463，1444，1372，1303，1270，1169cm-1.-1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝11.97(s，1H，NH-CO)；8.35(d，1H，J＝8Hz，Ar-H)；7.45(d，1H，J＝7Hz，Ar-H)；7.19(t，1H，J＝7.5Hz，Ar-H)；7.04(t，1H，J＝7Hz，Ar-H)；6.61(s，2H，NH2)；6.42(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.32(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.81和2.56(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.09(s，3H，CH3)；1.63-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物邻-重氮甲烷3c将2c(200mg，0.53mmol)溶于10ml DMF。然后加入800mg MnO2。搅拌15分钟后将混合物通过硅藻土(0.5cm)-分子筛(0.5cm，粉末状)混合层过滤。将反应混合物蒸发至干，然后用醚洗涤并干燥。得到粉红色粉末状的化合物3c(130mg，65％)。
熔点110℃。-IR(KBr)3248，2930，2857，2367，2342，2038，1699，1521，1456cm-1.-1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝9.37(s，1H，NH-CO)；7.26-7.00(m，4H，Ar-H)；6.43(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.30(m，1H，CH2-CH-NH)；4.15(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.82和2.54(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.24(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；2.12(s，3H，CH3)；1.63-1.37(m，6H，(CH2)3)。
实施例1.4间-BioDPDAM的合成●化合物间-偶合物1d将D-生物素(500mg，2.05mmol)溶于23ml热的无水DMF。将混合物在氩气下冷却至0℃，然后连续加入N-甲基吗啉(295μl，2.67mmol)和异丁基氯甲酸酯(420μl，3.28mmol)。将混合物搅拌30min，然后加入溶于7ml DMF的3-氨基二苯甲酮(605mg，3.07mmol)和N-甲基吗啉(240μl，2.17mmol)。将溶液在0℃搅拌2h，然后蒸发至干。将残余物溶于1mlMeOH，然后加入25ml水。过滤所得沉淀，用水洗涤，然后用醚洗涤，得到810mg(93％)粗产品1d。从MeOH-H2O对重结晶得到白色粉末状的1d(630mg，72％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.10(s，1H，NH-CO)；8-7.39(m，9H，Ar-H)；6.43(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.27(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.55(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.31(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.59-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物间-腙2d将1d(350mg，0.83mmol)溶于5.5ml无水乙醇，然后加入肼一水合物(140μl，2.48mmol)。将溶液加热回流过夜。蒸发后将产物溶于1ml乙醇和水。将白色沉淀重结晶将其溶于最小量的热乙醇，然后加入水直至有轻微混浊出现。冷却后，用水洗涤所得沉淀然后用醚干燥。得到264mg(73％)白色粉末状的产物2d。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.99(s，1H，NH-CO)；9.80(s，2H，NH2)；7.54-6.88(m，9H，Ar-H)；6.26(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.21(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.78和2.59(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.57-1.36(m，6H，(CH2)3)。
●化合物间-重氮二苯基3d将3d(500mg，0.53mmol)溶于1ml THE。然后加入80mg活化的MnO2。在室温搅拌5分钟后，将混合物通过硅藻土(0.5cm)-分子筛(0.5cm，粉末状)混合层过滤。将反应混合物蒸发至干。得到紫色油状的化合物3d(47mg，100％)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝9.95(s，1H，NH-CO)；7.60-6.9(m，9H，Ar-H)；6.42(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.83和2.59(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.27(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.58-1.35(m，6H，(CH2)3)。
实施例2用Cy5标记的试剂Cy5PMDAM
●化合物2-[4-(N-乙酰基-N-苯基氨基)丁-1，3-二烯基]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物(indolium iodide)6将乙酸酐(75ml)中的丙醛二(苯基亚胺)单盐酸5(18.3g，70.0mmol)，NaOAc(9.0g，110mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物4(4.25g；14.1mmol)的混合物在110℃加热20分钟。冷却后，加入醚(350ml)，然后将沉淀的棕色固体过滤，用醚洗涤(3×100ml)。将固体溶于150ml CH2Cl2，过滤(除去无机盐)然后蒸发得到棕色固体(6.0g，90％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.64(d，1H，J＝12Hz，1-H)；8.14(t，1H，J＝16，12Hz，3-H)；7.63-7.19(m，9H)；6.90(d，1H，J＝15Hz，4-H)；5.82(t，1H，J＝12，13Hz，2-H)；4.06(s，3H，NCH3)；2.16(s，3H，-COCH3)；1.74(s，6H，CH3)。
●化合物1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯溴化物92，3，3-三甲基吲哚7(10.0g，62.8mmol)和6-溴己酸8(12.3g，62.8mmol)在没有溶剂时混合并于110℃在氩气下加热12小时。用乙酸乙酯洗涤紫红色糊状反应混合物(2×60ml，用刮刀将此糊状物捣碎并倒出上清液)，然后用丙酮洗涤(50ml，糊状物凝固)。滤出粉红色固体然后在真空下干燥(16.0g；73％)。
●化合物Cy5COOH 10将乙酸酐(35ml)中所述碘化物6(6.0g，12.7mmol)，溴化物9(4.5g，12.7mmol)和NaOAc(2.6g，32mmol)的混合物在110℃加热20分钟。冷却后，加入醚(150ml)，过滤沉淀物并用醚洗涤(3×50ml)。将固体溶于100ml CH2Cl2，过滤并在SiO2柱(洗脱液MeOH 5-10％/CH2Cl2)上通过层析纯化。得到3.4g(44％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.03(t，2H，J＝10，11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m，9H，Ar-H，3-H)；6.41(d，1H，J＝14Hz，1-H)；6.31(d，1H，J＝13Hz，5-H)；4.07(t，2H，J＝7，7Hz，α-CH2)；3.68(s，3H，NCH3)；2.47(t，2H，J＝7，7Hz，ε-CH2)；1.71(m，18H，CH3，β，γ和δ-CH2)。
●3-氨基乙酰苯与Cy5COOH 10(产物11)偶合的化合物在溶于12mlCH2Cl2的Cy5COOH 10(1.19g，1.9mmol)溶液中加入N-甲基吗啉(360μl，3.2mmol)。用冰浴冷却此溶液，然后加入异丁基氯甲酸酯(480μl，3.7mmol)。搅拌5分钟后，加入3-氨基乙酰苯(488mg，3.6mmol)。将混合物在室温搅拌3h。加入250ml醚，得到糊状固体。搅拌后，将固体至于圆底烧瓶底部并倒去上清液。再加入50ml醚并用刮刀将介质捣碎以得到固体。将后者过滤，用水、醚洗涤，然后在真空下干燥。然后将产物(碘化物)溶于乙醇，通过安珀莱特(amberlite)IRA900(Cl-；15g)柱。将回收的乙醇溶液蒸发至干，然后通过SiO2柱。得到0.93g(77％)蓝色固体。
●化合物Cy5-腙12在溶于5ml无水乙醇的乙酰苯11溶液(0.93g，1.46mmol)中加入肼一水合物(180μl，3.1mmol)并在室温搅拌7h。加入50ml醚，将沉淀过滤并用醚洗涤。将粗产品溶于50ml CH2Cl2，将溶液过滤然后浓缩至10ml。加入100ml醚沉淀产物，过滤，用醚洗涤然后在真空下干燥。得到540mg产物12(57％)。
●化合物Cy5PMDAM 12a在溶于2ml DMF的100mg腙12溶液中加入300mg MnO2，然后将混合物剧烈搅拌10min。将上清液通过硅藻土层过滤并用DMF(3×500μl)洗涤。加入50ml醚，用刮刀将沉积的油状物捣碎，然后倒去上清液。用25ml醚重复洗涤三次并将所得所得固体过滤并干燥。得到65mg(65％)产物12a。产物的纯度约为80-85％(1H NMR)。
实施例3合成其它试剂实施例3.1对-硝基苯基重氮甲烷(NPDAM)的合成4-硝基苯甲醛腙是在商业上获得的(参考目录28，118-2，Aldrich，France)。
将600mg(3.64mmol)这种产物溶于9ml THF。溶液持续搅拌5分钟，然后小心加入1.26g(4当量，14.56mmol)MnO2。将混合物搅拌10分钟，然后过滤。将滤液回收并蒸发至干。用戊烷洗涤后，得到亮橙色粉末状的化合物对-硝基苯基重氮甲烷，产率为79％(468mg，2.87mmol)。
熔点80-82℃。-1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.11(d，2H，J＝9Hz，Ar-H3)；7.18(d，2H，J＝9Hz，Ar-H2)；6.06(s，1H，CH1-N2)。
实施例3.2苯基甲基重氮甲烷(PMDAM)的合成乙酰苯腙将乙酰苯(2.0g，16mmol)稀释在16ml无水乙醇中，然后加入肼(2.3ml，48mmol)。将混合物加热至回流温度。2h后，将溶剂蒸发并将残余物溶于醚(150ml)。用水(100ml)洗涤介质。在Na2SO4上干燥后，蒸发去醚。得到淡黄色油状物(1.5g，11mmol，69％)。
苯基甲基重氮甲烷(PMDAM)将腙(150mg，1.1mmol)溶于3ml THF。加入MnO2(480mg，5.5mmol)。介质在室温搅拌30min。介质变为红色。过滤并蒸发去溶剂。得到红色油状物(145mg，100％)。该试剂无需纯化即可使用。
实施例3.3二苯基重氮甲烷(DPDAM)的合成二苯甲酮腙是从商业上获得的(参考目录B 960-2 Aldrich，France)。
将196mg(1.0mmol)物质溶于5ml THF。加入435mg(5当量，5.0mmol)MnO2，混合物搅拌10分钟，然后过滤。将回收的滤液蒸发至干。得到193mg(0.99mmol)。该试剂无需纯化即可使用。
实施例3.4NVDAM的合成 按照上述步骤从6-硝基藜芦醛(Aldrich，reference 27，960-9)进行合成。
实施例4从NPDAM合成生物素化的衍生物 按照上述ME Wall等的方法制备2-氨基-4-硝基苯甲醛衍生物。
重氮甲烷NPDAM的制备与上述实施例3.1是相同的。
实施例5制备DNA和RNA核酸实施例5.1制备DNA扩增子采用罗氏(Roche)的Fast Start Kit，0.2mM脱氧核糖核苷酸(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，0.3μM引物和0.4μl酶，通过PCR从16S结核分枝杆菌(分枝杆菌bacterium tuberculosis)基因组DNA靶标(以10E+4份拷贝作为起始靶标)产生了DNA扩增子。
PCR参数如下-95℃4分钟，然后循环35次(95℃30秒；55℃30秒；72℃30秒)，然后4℃。
通过琼脂糖凝胶电泳(1.5％，TBE 0.5X)定性分析扩增子。加样体积为5μl，在100伏(V)下迁移20min。用溴化乙锭染色后在UV灯下观察PCR产物。
培养条件、分枝杆菌的提取和引物的扩增专利WO-A-99/65926中描述。
实施例5.2制备转录的RNAs用Ambion的MEGAscript试剂盒从PCR靶标(结核分枝杆菌16S RNA片段)进行转录7.5mM核苷酸(ATP，CTP，GTP和UTP)和2μl酶(RNA聚合酶)。在37℃温育3小时(h)。PCR的扩增引物带有T3或T7聚合酶启动子，该启动子如申请WO-A-99/65926中所述或如J.Clin.Microbiol.37(1)，49-55页，1999文章中所述，可进行转录。
用琼脂糖凝胶电泳(1.5％，TBE 0.5X)分析转录物。加样体积为5μl并在100V下迁移20min。用溴化乙锭染色后在UV灯下观察PCR产物。
用其它扩增技术如NASBA或TMA可得到与本发明观点相同的结果，这些技术可直接产生RNA扩增子。
实施例6标记试剂在样品核苷酸上的反应性标记试剂的合成描述在实施例1-4中。本发明所述的PDAM是商业上获得的(参考目录P1405，Molecular Probes，Eugene，OR)。
实施例6.1单体UMP3’-磷酸的标记研究带有重氮甲基官能团的标记试剂的反应性以控制反应的特异性。
开发的方法包括在以下标准条件下在典型化合物3’-UMP(尿苷3’-单磷酸，参考目录U1126 Sigma)上通过毛细管电泳来研究这种反应性3’-UMP 0.04mM；H3BO32.0mM；2.0mM标记[和合适的有机溶剂(THF，AcOEt或DMSO)一起加入]；溶剂H2O-CH3CN-有机溶剂(比例1/3/1)。
将此溶液分成250μl的十份，加热至60℃。一定时间后，用250μl二氯甲烷处理每份溶液。搅拌后，除去有机相(下相)。重复该操作两次以上。离心(5min，每分钟5000转)后，通过毛细管电泳分析含水相。毛细管电泳(CE)条件如下用Beckman P/ACE 5000设备进行CE分析。使用未经处理的熔融二氧化硅毛细管(75μm×50cm)。施加电压为30kV(正极)，且毛细管的温度保持在23℃。在254nm记录电泳图。用NaOH溶液调节硼酸的pH并通过0.2μm滤器过滤以制备硼酸盐缓冲液(0.1M，pH8.3)。在压力(0.5psi，5sec)下注射样品。每次分析前在压力下(20psi)连续通入NaOH溶液(0.1M，2min)，水(2min)和硼酸盐缓冲液(2min)以使毛细管再生。
如图所示，通过在0-4小时之间改变反应时间来进行反应，结果表示所用试剂浓度的图2A-2I中所测试的各个试剂。
在各幅电泳图上都标出了反应时间。
对所有测试的试剂，只得到了单烷基化产物，这证明了反应的特异性。
因此可比较峰高度以计算反应性，即试剂和3’-UMP的发生一半反应的时间，结果列在下面的表1中(标准条件如上所述) *对o-BioPMDAM估计了反应性，因为在标记试剂浓度为2mM的条件下，反应在5分钟内完成。因此图2I使用的浓度为0.2mM。
表1试剂的反应性(半反应时间)需要注意的是，由于对于所有被测试剂反应是非常特异的且不会产生副产品。因此可增加标记试剂的浓度而不会影响标记的选择性。
因此，对于DPDAM试剂，如果浓度增加至20mM(见图2C)，则反应性(半反应时间)为2小时。用BioDPDAM(图2F)得到了相同的结果，当浓度为30mM时反应性为45分钟。
实施例6.2各种核苷酸3’-单磷酸的测试为避免任何解释错误，用其它核苷酸3’-单磷酸对作为重要例子的间-BioPMDAM标记进行了额外的研究。
测试的核苷酸如下3’-AMP(参考目录85，194-9 Aldrich)，3’-GMP(参考目录151214，ICN)，3’-CMP(参考目录C1133，Sigma)，3’-TMP(脱氧核糖系列)(参考目录T1008，Sigma)。用不同核苷酸获得的电泳图显示在图3A-3D中。图3A中显示的反应时间与图3B-3D中的反应时间是相同的。
无论起始核苷酸是(核糖或脱氧核糖系列)，在60℃130分钟时只形成且完全形成了烷基化产物。值得注意的是，在鸟嘌呤(最容易和常规的烷基化剂反应的碱基)的情况下，只观察到被磷酸烷基化的产物，这证明了该反应的很高选择性。
该研究还可证明反应速度不取决于作为底物的核苷酸的性质。
实施例6.3二核苷酸的研究用间-BioPMDAM进行二核苷酸ApUp(参考目录A4298，Sigma)的烷基化以证实朝相于对苷酸核间磷酸的末端磷酸反应的选择性。如图4所示，通过电泳监控反应。电泳条件是实施例6.1已经描述的标准条件。
观察到只形成了一种产物，这显示了朝相对于核苷酸间磷酸的末端磷酸的间-BioPMDAM试剂有良好的选择性。
实施例6.44具有核苷酸3′-单磷酸的加合物的鉴定为确保所得产物确由磷酸的烷基化产生，用间-BioPMDAM试剂合成了单磷酸3’-UMP，3’-CMP，3’-GMP和3’-AMP的加合物。所述烷基化反应是在下述制备规模上进行的。所得加合物的产率为70％，是纯的，然后通过质子或磷NMR研究。
制备方法将3’-UMP(二钠盐形式，9.3mg，21.1μmol)溶于2ml 0.1M H3BO3水溶液，然后连续加入2ml CH3CN，6ml MeOH和间-BioPMDAM试剂(75mg；0.20mmol)。反应在室温下进行2.5h。通过毛细管电泳监控反应。加入3ml水，然后用CH2Cl2萃取除去多余的试剂。蒸发去含水相。将残余物溶于小量的水并通过反相硅胶柱(Lichroprep RP-18，Merck；洗脱液MeOH/H2O(20/80))纯化。得到10g(69％)3’-UMP的加合物。
图5A-5D显示了3’-NMP(N＝G，U，C，A)加合物的质子NMR谱。通过二维1H/1HNMR实验(COSY)鉴定加合物。对每个加合物得到了比例为1/1的两种非对映异构体。
在0ppm(300MHz，D2O)附近磷NMR只有一个峰。
这些实验证明该反应确实是特异的，因为只观察到一种加合物且标记确实是对磷进行的。这些碱基没有发生烷基化副反应。因此，标记产物特别适合杂交步骤。
实施例7稳定性研究实施例7.1标记试剂对温度的稳定性上述实施例6.1的表中所描述的所有重氮甲烷衍生物以固体状态在-20℃冰箱中保存至少3个月其反应性不会丧失。
两种试剂NPDAM和间-BioPMDAM在室温放置于实验台上的稳定性用1H NMR确定。我们发现将NPDAM放置于无特别预防的实验台上1个月也不会分解。而间-BioPMDAM在实验台上放置25天就会分解约50％。
标记试剂对温度的稳定性是一个基本特征。事实上，这种试剂在工业应用上的最终目的是标记试剂盒。在-20℃至少15天内，最好是1个月内就不稳定的试剂是没有市场前景的。即使在-110℃下储存和运输，-110℃和-20℃的稳定性存在相互关系，这就是为什么在-20℃下要稳定15天，最好是1个月是工业上的最低限度。在-110℃以上，从使用者和制造商的角度看实验室缺乏必要的冷冻设备(冰箱)，并且从制造商的角度看也没有一种简单的干冰方法运输这些试剂。
至于室温下的稳定性，稳定数小时，最好是1天就足以使使用者进行标记。
实施例7.2各种核苷酸3′-UMP标记结合物的水解我们测试了[3’-UMP-标记]结合物在碱性介质中的稳定性。水解机制可用以下方式表示
用以下方法合成使用的各种结合物，以通过间-BioPMDAM对单磷酸3’-UMP(核糖核苷酸序列)的烷基化。
用3’-UMP测试的各种标记试剂是●间-BioPMDAM，●邻-BioPMDAM，●对-BioPMDAM，●DPDAM，和●PDAM。
步骤在DMSO中制备20mM标记试剂溶液。
为进行反应，加入以下物质-20μl该溶液，-40μl 1N NaOH，-10μl浓度为40mM的参照产物，和-130μl H2O。
将此溶液加热至60℃并在精确时间取样。
对样品进行以下处理-10μl加热溶液，-40μl 0.5M H3BO3，和-150μl H2O。
对每种样品，取15μl这种最终溶液进行毛细管电泳。
通过毛细管电泳测定水解反应的速度，研究结合物数量的减少作为时间的函数(测量峰的表面积，与内标物3，5-二氨基苯甲酸或萘甲酸相比)。
用这种方法，我们可比较各种结合物的稳定性。
结果如表2所示
表2反应性(与核苷酸3’-UMP-标记结合的试剂的半反应期)因此，我们发现与间-BioPMDAM结合的半衰期为197min，这比对-BioPMDAM衍生物高25倍，比DPDAM衍生物高7倍，比邻-BioPMDAM衍生物高4倍。
邻位和对位衍生物比结合物更稳定，在诊断测试时可进行更好的检测。
实施例8用间-bioPMDAM衍生物(3a)标记转录的RNA标记 间-bioPMDAM(3a)间-bioPMDAM衍生物(3a)是按实施例1.1所述的反应流程得到的。RNA靶是按照实施例5.2所述的方法通过PCR后转录(post-PCR transcription)制得的。
在50μl含有RNA转录物的溶液中加入9μl纯水(Sigma)，9μl 0.1M咪唑和9μl 1M MnCl2。咪唑和MnCl2的浓度分别为6mM和60mM。加入含有RNA靶的溶液和片段化所需的缓冲液，以及3μl间-bioPMDAM(3a)(100mM，溶于DMSO)，然后温育。间-bioPMDAM标记的最终浓度为2mM。用纯水将此溶液调至150μl后，将反应混合物匀浆并在60℃温育30分钟。温育30分钟并加入EDTA后(最终为100mM)，用供应商提供的缓冲液和方法，在QIAVACTM柱(Qiagen，Hilden，Germany)上纯化以除去过量的标记。
杂交经过片段化期间的标记步骤后，将得到的片段在DNA芯片上杂交，该芯片是设计用于分析结核分枝杆菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-215区域。这种DNA芯片在A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999中有描述。
杂交步骤是在流体站(Affymetrix，Santa Clara，CA)上进行的，所用的杂交方法和缓冲液见A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999。需附加步骤以使生物素显色(间接检测)。
引入用藻红蛋白和Cy5标记的链霉抗生物素蛋白(激发波长分别为488nm和650nm)以显示在DNA芯片表面与捕获探针杂交的生物素化的片段。如下条件300μl纯水；300μl 100mM的Tris缓冲液(pH7/1 M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡剂)；6μl BSA(50 mg/ml)；6μl标记的链霉抗生物素蛋白(200μg/ml)。采用的组分的参考目录是·链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白参考目录R0438，Dako，Denmark，·链霉抗生物素蛋白-CY5参考目录C0050，Dako，Denmark，·消泡剂参考目录M5-575，Ultra Additives Inc.，以及·Tween参见P-7949，Sigma。
DNA芯片的阅读标记和杂交后，DNA芯片表面发射的荧光以及信号强度和同源性百分数的数据用Affymetrix所提供的阅读系统及软件(GeneChipInstrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)进行阅读。
阅读系统所提供的信号强度和背景噪音强度用rfu(相对荧光单位)表示。同源性百分数以参考序列为基准，在此情况中是指结核分枝杆菌序列。
以平均强度所表示的信号(I)、背景噪音(B)和同源性百分数(％)的结果列于表2。
一般来说，同源性百分数大于90％被认为是满意的结果，虽然大于95％的结果也常常出现。在95％以上，值就不再指明，因为这在分枝杆菌DNA芯片的例子中是没有意义的。高强度、低背景噪音是在下面的例子中所看到的第二个结果。在所有的结果中，背景噪音B是由平均强度I推算出来的。
表3标记和杂交后DNA芯片表面发射的荧光读数用两种标记，同源性比例大于95％。以rfu表示的信号强度大于那些用标准标记技术得到的值。
这些结果显示，在片段化RNA转录物时用间-bioPMDAM衍生物进行标记反应可在DNA芯片上产生可检测的足够标记的片段。因此，重氮甲基官能团可使生物素标记引入RNA转录物的序列。这一反应没有改变生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用的性质。实际上，无论是用荧光团藻红蛋白或是Cy5，强度水平和信噪比(I/B)都很好。采用这一技术可根据用途使用不同的荧光团，甚至在两种不同波长下进行检测(参见，如Nature Genetics 14卷，441-447页，1996)。
实施例9用间-bioPMDAM衍生物进行标记的条件的最佳化实施例9.1片段化盐(MnCl2)浓度的最佳化用不同浓度的MnCl2按实施例8所述的方法标记RNA转录物。
杂交和阅读按实施例8所描述的方法进行。
标记结果显示，用低浓度的MnCl2得到了高的强度。
MnCl20mM，强度I3857rfu，同源性93.5％，MnCl25mM，强度I3031rfu，同源性93.5％，和MnCl210mM，强度I2471rfu，同源性94.1％。
在不同MnCl2浓度下分析RNA转录物的片段化显示，对于金属来说，通过在60℃温育，5mM时片段化总是有效的。
这显示，在最佳的标记和片段化条件下用标记试剂可得到非常好的标记结果。
实施例9.2咪唑浓度的最佳化在4个含有50μl RNA转录物(16S分枝杆菌)溶液的试管中加入4.5μl或18μl或36μl咪唑(1M，溶于纯水)，以使最终浓度分别为30，120和240mM。然后加入3μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)，并用纯水将总体积调至150μl。
在60℃将4个试管中的溶液涡漩搅拌且温育10分钟。
纯化将四种标记反应溶液在QIAVACTM柱上纯化以除去多余的标记。
杂交和阅读步骤如实施例8所述(链霉抗生物素蛋白藻红蛋白检测)。
以信号强度表示的结果如下咪唑30mM 强度3600rfu，咪唑120mM 强度1600rfu，和咪唑240mM 强度1400rfu。
从标记强度看，用30mM咪唑得到了最好的结果。可能高浓度(120和240mM)产生过量的片段化，因此，产生较短的片段。
该结果还显示，基于重氮甲基官能团的标记的化学机理可最优化，并使其适合标记条件和要标记的靶。
实施例9.3间-bioPMDAM标记浓度的影响在6个含有50μ RNA转录物(实施例5.2)溶液的试管中加入4.5μl咪唑(1M，溶于纯水)和体积分别为0.38；0.75；1.5；3；4.5和7.5μl的间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。用纯水将总体积调至150μl。
在60℃将溶液涡漩搅拌且温育10分钟。
杂交和阅读步骤如实施例8所述。
结果列于表4
表4标记结果的总结，它是bioPMDAM标记浓度的函数。在DNA芯片上用链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白(PE)和链霉抗生物素蛋白-Cy5(Cy5)进行观察。
从2mM间-bioPMDAM可见，同源性百分数和标记强度好。这和用生物素和用带有藻红蛋白的链霉抗生物素蛋白，以及用与Cy5连接的链霉抗生物素蛋白观察到的结果是一样的。超过此浓度，信号的增强和同源性百分数不受影响。
实施例9.4标记后纯化步骤的省略为省去纯化步骤，在DNA芯片上用不同的标记反应体积进行杂交，未事先纯化。
在片段化时，在50μl RNA转录物(实施例5.2)溶液中加入标记缓冲液，然后将混合物在60℃温育30分钟。片段化时的标记条件为30mM咪唑(4.5μl咪唑溶液，1M，溶于纯水)，10mM MnCl2(1.5μl氯化锰溶液，1M，溶于纯水)和2mM间-BioPMDAM(3μl 100mM溶液，溶于无水DMSO)。
温育后，将不同体积的标记溶液在DNA芯片上杂交，事先未进行任何纯化。杂交方法如上所述。引入用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白以显示在DNA芯片表面与捕获探针杂交的生物素化的片段(激发波长488nm)，条件如实施例8所述。
还按照Affymetrix提供的方法检测藻红蛋白标记并分析结果，该方法描述在实施例8中。
结果列于表5。
注*标记后将标记反应物的总体积在柱上纯化表5标记后纯化步骤的省略这些结果显示，如果所有反应物体积没有杂交，使用2mM间-BioPMDAM可省略纯化步骤。使用20μl在DNA芯片上杂交，从同源性百分数和信号强度看，所得结果可与用采用纯化步骤的标准方法获得的结果相比。
用没有金属(MnCl2)的标记方法获得了相同的结果，列于表6。信号较强。
表6在没有MnCl2时标记后纯化步骤的省略这些结果显示，使用片段化试剂而不是金属可避免沉淀问题和高背景噪音。
在实施例9.4中，所用RNA转录物被降解了，这解释了信号的减弱，但用参照物可进行比较。
实施例10可用来标记RNA的其它片段化试剂实施例10.1使用多胺链为解决盐存在时标记产量的减少问题，我们使用了“生源的”多胺，精胺作为片段化试剂。实际上，已知这种多胺链用于其与核酸的磷酸相互作用。
将50μl RNA转录物(实施例5.2)和各种浓度的精胺(参考目录13275-0010，Acros，FR，0.5M储备溶液pH7.5)以及2mM间-BioPMDAM(3μl 100mM BioPMDAM溶液，溶于无水DMSO)在60℃温育30分钟，最终体积为150μl。
按照实施例8所述的方法在DNA芯片上进行纯化、杂交和检测(链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白检测)。
标记结果列于表7
表7精胺用作片段化试剂以精胺作为片段化试剂在片段化时进行标记，同源性百分数和信号强度是令人满意的。因此可在用带有重氮甲基官能团的标记试剂进行标记时，多胺链可用来片段化RNA靶。
实施例10.2使用菲咯啉衍生物实验1在5μl RNA转录物中加入20μl菲咯啉-FeSO4(参考目录P1929，Sigma，25mM)和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。将体积调至100μl。试管在95℃温育60min。
实验2在5μl RNA转录物中加入3μl咪唑pH9.5(1M，溶于纯水)，0.5μlMnCl2和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。将体积调至100μl。试管在60℃温育10min。
两种情况下，都在DNA芯片上对样品进行杂交、检测和分析。
如上所述，引入与荧光团、藻红蛋白偶合的链霉抗生物素蛋白以显示在DNA芯片表面与捕获探针杂交的生物素化的片段(激发波长488nm)。
表8使用菲咯啉衍生物以菲咯啉作为片段化试剂获得的结果，如表8所示，高于用使用金属和咪唑的标准方法获得的结果。
还可使用与Fe++之外其它金属络合的其它菲咯啉衍生物，如Cu++，Zn++等。
实施例11在两个步骤中用间-bioPMDAM标记并片段化RNA在片段化缓冲液30mM咪唑和10mM MnCl2存在时，将按实施例5.2所述方法获得的50μlRNA转录物溶液在60℃温育30分钟。然后加入间-bioPMDAM衍生物，时最终浓度为2mM，并在60℃再温育5min。
在杂交前，按照上述方法(实施例8)将标记的RNA片段在柱上纯化。
表9在两个步骤中用间-bioPMDAM标记并片段化RNA这里，按照表9，在进行比较时应考虑强度和I/B比，因为用方法1(片段化，然后标记)所得信号太强。观察到阅读器的饱和现象，这会导致较低的同源性百分数(81％)，而用参照方法获得的同源性百分数为91.9％。
然而，该实施例显示，片段化和标记步骤是可以分离的。
实施例12放大信号以用间-bioPMDAM试剂标记RNA此方法的目的是放大荧光信号，这是通过在每个间-bioPMDAM分子中引入几个荧光团实现的。
标记反应在5μl转录物(分枝杆菌16S)中加入89μl纯水(Sigma)，30μl咪唑(1M，溶于纯水)，1μl MnCl2(1M，溶于纯水)和2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO)。
试管涡漩搅拌，然后在60℃温育10分钟。
然后按照实施例8所述的方法进行柱纯化并在DNA芯片上进行杂交。
未放大信号将链霉抗生物素蛋白(用藻红蛋白PE标记)和标记试剂间-bioPMDAM相互作用以显示生物素化的片段。在DNA芯片上加入链霉抗生物素蛋白时方法如实施例8所述。
放大信号第一步附上链霉抗生物素蛋白(300μl纯水，300μl 100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡剂；6μlBSA，50mg/ml；4μl链霉抗生物素蛋白，1.5mg/ml)。
第二步附上生物素化的抗-链霉抗生物素蛋白抗体(300μl纯水，300μl100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡剂；6μlBSA，50mg/ml；3μl生物素化的抗-链霉抗生物素蛋白抗体，1mg/ml)。
第三步附上用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白(300μl纯水，300μl100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡剂；6μlBSA，50mg/ml；6μl用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白，300μg/ml)。
然后在上述步骤中使用生物素化的抗-链霉抗生物素蛋白参考目录216-065-084，Jackson Immuno Research。
按照实施例8所述的方法阅读DNA芯片上的信号。结果以同源性百分数和标记强度表示，列于表10
表10放大信号以用间-bioPMDAM试剂标记RNA信号的放大显著地改善了检测的灵敏度。
实施例13用对-bioPMDAM(3b)和邻-bioPMDAM(3c)衍生物标记RNA在片段化RNA转录物时，在标记方法中评价两种按实施例1.2和1.3所述方法制备的试剂。
按实施例5.2所述方法获得RNA转录物。
标记、杂交、引入用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白以及纯化方法如实施例8所述。
结果列于表11
表11用对-bioPMDAM和邻-bioPMDAM标记RNA这些结果显示，邻位和对位的取代对标记强度和同源性百分数也有有用的效果。
实施例14用BioDPDAM衍生物(3d)标记RNA转录物按实施例1.4所述的方法制备BioDPDAM衍生物(3d)。
按实施例5.2所述的方法获得RNA转录物。
与间-BioPMDAM试剂相比，标记和片段化方法是在表12所述的条件下(反应体积100μl)在一个步骤中完成的。
杂交、引入用藻红蛋白标记的链霉抗生物素蛋白以及纯化方法如实施例8所述。
结果列于表所
Im＝咪唑表12用BioDPDAM(3d)标记RNA转录物衍生物3d对在磷酸上标记RNA有良好的结果。这一结果显示，取代基(如苯基)可用来调节带有重氮甲基官能团的标记的反应性和稳定性。
实施例15用Cy5-PMDAM衍生物(12a)标记RNA
Cy5-PMDAM(12a)按实施例2所述的方法制备标记Cy5-PMDAM(12a)。
在各种片段化和标记条件下，用Cy5-PMDAM标记5μl RNA转录物(实施例5.2)。常规条件如下●最终反应体积100μl，●30mM咪唑pH8(3μl 1M储备溶液)，●5mM MnCl2(6μl 0.1M储备溶液)，和●3mM Cy5-PMDAM(3μl 100mM储备溶液溶于无水DMSO)。
在第一个实验中，在片段化期间在一个步骤中进行标记。
在第二个实验中，标记和片段化是在两个步骤中完成的片段化之后进行标记。
与MnCl2一起温育后，加入20μl 0.5M EDTA溶液以中和盐。
若在一个步骤中进行标记和片段化，则在60℃温育30min。对于第二个实验，其中标记和片段化是在两个步骤中进行的，对每个步骤使用15min温育。
按实施例8所述的方法将标记的片段纯化、杂交并检测。不同之处仅在于，在杂交步骤中不需要加入标记的链霉抗生物素蛋白，因为标记是通过合适的阅读器(GMS 418阵列扫描仪，Affymetrix，Santa Clara，CA)直接检测的。
标记结果列于表13
表13用Cy5-PMDAM衍生物标记RNA转录物从标记强度和同源性百分数来看，用标记试剂(12a)在RNA转录物的磷酸上标记有非常满意的结果。
值得一提的是，用这种标记得到的信号背景噪声比非常令人满意。实际上，花青衍生物的激发和发射波长远不同于那些生物分子。
这些结果还显示，重氮甲基官能团可在核酸的磷酸水平引入生物素以外的标记。
实施例16DNA片段化的研究实施例16.1各种核苷在酸性介质中的水解研究的目的是证明天然核苷、修饰核苷以及嘌呤核苷和嘧啶核苷之间在酸性pH条件下稳定性的差异。此研究也可以使我们通过考虑DNA的碱基组成而更好地控制其片段化。
2种修饰核苷，8-溴-2’-脱氧腺苷(8-BrdA)和5-溴-2’-脱氧胞苷(5-BrdC)以及4种天然核苷(dA，dC，dG和dT)用于此研究中。
每种核苷取50nmol在95℃、pH为3的50mM甲酸盐中温育，温育时间从0到45min。真空干燥后加入20μl纯水，取10nmol样品用反相HPLC分析。结果以起始核苷的水解百分率(y轴)与以分钟计的温育时间(x轴)的关系表示，见图8。
图8的曲线显示，腺苷在8位上用溴原子修饰使此核苷没有天然核苷稳定。然而，结果显示在使用的条件下，去嘌呤作用要远大于去嘧啶作用。
此研究表明去嘌呤作用或去嘧啶作用使DNA片段化可以通过优化水解的条件或通过掺入比天然碱基稳定性低的修饰碱基或者在掺入后可以被修饰和水解的碱基来控制。
实施例16.2掺入修饰核苷酸或其他物质的双链DNA的片段化以16S结核分枝杆菌基因组DNA靶(10+4个起始拷贝)，用Roche的Fast Start试剂盒，加入0.2mM 4种脱氧核糖核苷酸(d-ATP，d-CTP，d-GTP，d-TTP)，0.3μM引物和0.4μl酶平行进行3组PCR扩增。
PCR参数与实施例5相同。
第一组PCR所用的条件为所谓的天然PCR。
第二组PCR所用的条件加以修改，以得到加入30％8Br-dATP后的PCR产物。这可以通过引0.2mM d-CTP，d-GTP和d-TTP来实现。还引入0.14mM d-ATP和0.06mM的8-BrdATP。(8-BrdATP是市场上买到的(参考目录N-2005-1，TriLinkBiotechnologies，San Diego CA)。
第三组PCR所用的条件加以修改，人得到加入50％8Br-dATP后的PCR产物。这可以通过引入0.2mM d-CTP，d-GTP和d-TTP来实现。还引入0.1mM d-ATP和0.1mM 8-BrdATP。
这些扩增子的单独片段化研究在上述条件下进行50mM甲酸钠，pH为3，95℃。
PCR产物的分析用溴化乙啶染色的变性聚丙烯酰胺凝胶(8％聚丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE)进行。
在pH3的50mM甲酸钠中95℃温育15min后，没有观察到三个PCR产物之间有差异。在所有情况下观察到PCR扩增子的完全片段化。
PCR扩增子的去嘌呤作用也可以在不同的pH值、不同的温度和不同的温育时间下进行。在上述的条件下进行凝胶分析表明，pH3时仅在95℃温育10min后片段化就完成了。在此pH条件下，60℃温育30min也可以完成片段化。
在pH4时，即使在95℃也需要30min的温育才能完成DNA扩增子的片段化。这一结果非常重要，说明在酸性pH条件下产生的脱碱基位点是不稳定的，因而不经过特别的处理也会导致DNA链的片段化。
实施例17以两个步骤用间-bioPMDAM衍生物(3a)标记和片段化DNA按照实施例1.1描述的反应流程获得间-bioPMDAM衍生物(3a)。
按照实施例5.1描述的方案用PCR扩增制备DNA扩增子。
标记将10μl PCR产物，38μl纯水(Sigma)和50μl甲酸钠(100mM，溶于纯水中)在pH3时混和，混合物60℃温育30min。然后加入2μl间-bioPMDAM(100mM溶于DMSO中)。溶液旋涡搅拌，然后60℃再温育15min。
试验作两份进行以便能在凝胶上分析DNA的片段化，并通过DNA芯片的杂交和阅读来分析标记的效率。
纯化纯化用QIAQUICKTM柱(核苷酸去除试剂盒，Qiagen，Hilden，Germany)进行。所用的纯化方案是厂家推荐的。
纯化后，洗脱物转到一个含有400μl杂交缓冲液(1.75ml 20×SSPE；2.9ml5M甜莱碱；290μl 0.1M DTAB；10μl消泡剂30％)的干净试管中。这些物质的参考目录如下·甜菜碱参考目录B-2754 Sigma，和·DTAB参考目录D-5047 Sigma。
溶液旋涡搅拌，95℃温育10min以分离在片段化期间的标记步骤(变性步骤)中没有分开的DNA双链分开。然后在DNA芯片上杂交前将试管浸在0℃的冰-水中。
在DNA芯片上杂交经过片段化期间的标记步骤后，将得到的片段在DNA芯片上杂交，该芯片是设计用于分析结核分枝杆菌16S RNA的“Genbank”M20940序列的213-215区域的。这种DNA芯片在A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999中有描述。
杂交步骤是在流体站(Affymetrix，Santa Clara，CA)上进行的，所用的杂交方法和缓冲液见A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999。需附加步骤以使生物素显色(间接检测)。
杂交是通过结合标记藻红蛋白(PE)的链霉抗生物素蛋白显示的，PE与间-BioPMDAM上的生物素相互作用，反应条件如下300μl纯水；300μl的100mM Tris缓冲液(pH7/1M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡剂)；6μl BSA(50mg/ml)；6μl链霉抗生物素蛋白-PE(300μg/ml)。这些物质的参考目录·链霉抗生物素蛋白-藻红蛋白参考目录R0438，Dako，Denmark，·链霉抗生物素蛋白-CY5参考目录C0050，Dako，Denmark，·消泡剂参考目录M5-575，Ultra Additives Inc.，以及·Tween参考目录P-7949，Sigma。
DNA芯片的阅读标记和杂交后，DNA芯片表面发射的荧光以及信号强度和同源性百分数的数据用Affymetrix所提供的阅读系统及其软件(GeneChipInstrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)进行阅读。
阅读系统所提供的信号强度和背景噪音强度用rfu(相对荧光单位)表示。同源性百分数以参考序列为基准，在此情况中是指结核分枝杆菌序列。
以平均强度所表示的信号(I)、背景噪音(B)和同源性百分数(％)的结果列于表2。
一般来说，同源性百分数大于90％被认为是满意的结果，虽然大于95％的结果也常常出现。在95％以上，值就不再指明，因为这在分支枝杆菌DNA芯片的例子中是没有意义的。高强度、低背景噪音是在下面的例子中所看到的第二个结果。在所有的结果中，背景噪音B是由平均强度I推算出来的。
聚丙烯凝胶分析打算在凝胶上分析的样品在真空下干燥，加入10μl纯水和10μl 2×蓝甲酰胺。
电泳是用8％丙烯酰胺凝胶，缓冲液是1×TBE，150V迁移1小时。
酸性pH用于DNA的片段化。事实上，在此pH下，去嘌呤现象会产生极不稳定的脱碱基位点，导致DNA序列在高温下迅速片段化。这种类型的片段化产生DNA-5’磷酸片段。
凝胶分析表明，PCR扩增子在60℃的甲酸盐缓冲液(50mM，pH3)中温育30min可以使这些扩增子完全片段化。这就使我们可以评价在间-bioPMDAM标记存在的情况下DNA扩增子片段化期间的标记效果。
DNA扩增子片段化期间的标记结果以同源性百分数、信号及背景噪音的强度表示列于表14中。
表14以同源性百分数、信号(I)及背景噪音(B)的强度表示的DNA扩增子的标记和片段化本实施例说明本发明的试剂可用于标记以两步法酶扩增产生的DNA片段。也可用于标记非扩增的天然DNA。
实施例18用Cy5-PMDAM衍生物(12a)的标记DNA用合成的DNA片段评估具有新型标记物的DNA标记效果，这种新型标记物携带重氮甲基功能基团。
标记试剂Cy5-PMDAM(12a)是根据实施例2所描述的方法制备的。
按照所谓的亚磷酰胺方法制备一种20mer的寡脱氧核糖核苷酸(ODN)。用标准磷酸化试剂将一个磷酸引入到5’末端，该磷酸化试剂与亚磷酰胺化学一致。这种ODN的序列包括DNA的所有天然碱基(ODN的序列5’-CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3’)。这个序列与所谓的“模型”DNA芯片的捕获序列互补，DNA芯片的捕获序列是根据Affymetirx的技术合成的。这种DNA芯片含有捕获探针，该探针在序列上是一致的，并显示芯片表面上的方格式。读取此DNA芯片可以，根据强度而不是同源性的结果得到标记性能的信息。
标记将10μl的Cy5-PMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到50pmol的ODN中。最终的体积是100μl。均浆后60℃温育30min。
纯化和阅读为了去除多余的标记试剂，按照实施例17的方法进行纯化。DNA芯片的阅读是按照实施例17的方法进行的。
结果在DNA芯片上读取的平均标记强度(I)是16644rfu，背景噪音(B)是450rfu。
这一强度水平是很高的，说明标记试剂Cy5-PMDAM(12a)完全适合于标记磷酸基团上的DNA片段。
实施例19用PDAM试剂标记和片段化DNA实施例19.1用1-芘基叠氮甲烷(PDAM)标记 1-芘基叠氮甲烷PDAM从Molecular Probes(Eugene，OR)获得，并溶于无水DMSO中。
两种20mer的ODN用作DNA模型一种20mer的ODN含有5’-羟基，同样的20mer的ODN在5’末端带有一个磷酸。ODN的序列在实施例10中描述。标记反应在含有50％DMSO和1.5mM 1-芘基叠氮甲烷(PDAM)的混合物中进行，60℃反应30min或1h。
标记效率用薄层色谱(正相)评价，洗脱液为异丙醇/氨/水(60/10/30)。30min后，在ODN 5’-磷酸上的偶合反应完成。获得部分偶合到ODN 5’-羟基上的时间需要1h，就是说大约50％。
实施例6的结果在20个碱基的模型序列上得到证实，即末端磷酸上携带叠氮甲基功能基团的试剂最优先标记。在核苷酸内磷酸上标记是方便的，因为通过在核酸片段上引入多个标记物可导致敏感性升高。这就使核酸与互补序列杂交时具有良好的敏感性，同时保持良好的杂交特异性。
本领域的普通技术人员可以通过优化反应的条件来控制标记的特异性，例如通过改变标记试剂的种类，反应时间和温度以达到只在末端磷酸上标记的目的。
实施例19.2用PDAM进行标记反应的动力学研究
本研究用20mer ODN 5’-磷酸在上述条件下进行，反应时间加以改变。标记效率通过反相高效液相色谱(HPLC)进行分析，条件如下5μm，220×4.6mm的反相色谱柱Spheri-5 RP-18(Perkin Elmer)。缓冲液和洗脱梯度如下·缓冲液A0.1M TEAA；缓冲液B＝50％缓冲液A+50％CH3CN，以及·梯度从10％到50％的缓冲液B，30min，1ml/min，室温。
结果见图9，其中x轴是以分钟表示的反应时间，y轴是标记百分数。
60℃仅温育10min产率就接近90％。
实施例11.3温度对PDAM标记的影响用20mer ODN 5’-磷酸在上述条件下进行标记，温育温度加以改变，温育时间都是10min。
标记产率通过反相HPLC进行分析。
结果见图10，其中y轴是标记百分数，x轴是以℃表示的反应温度。
非常重要的是，即使在室温(25℃)也观察到有ODN的标记。25℃温育10分钟后，标记的产率大约为25％。温度高于50℃，得到的产率大于80％。
这说明用携带叠氮甲基功能基团的试剂标记DNA是有效的和灵活的。
实施例20用标记试剂间-bioPMDAM(3a)标记和片段化PCR扩增得到的DNA扩增子间-bioPMDAM(3a)衍生物是按照实施例1.1描述的反应流程制备的。
DNA扩增子是按照实施例5.1描述的方法通过PCR扩增制备的。
实施例20.1经片段化和未经片段化标记效果的比较a在片段化条件下的标记将50μl甲酸钠(pH3，50mM)和2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl。溶液在60℃温育30min。
b未经片段化的标记将2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl。溶液在60℃温育30min。
其他方法与实施例17相同。
结果
表15经片段化和未经片段化标记效果的比较表15中的结果说明未片段化的平均强度与背景噪音处于同一水平(500rfu)。而片段化后得到的标记效果(大约4000rfu)大大高于未片段化的，并且具有很好的同源性百分数。因此两个步骤结合确实可以明显改善大于100核苷酸长的核酸的检测。
实施例20.2在DNA芯片上杂交前变性的影响分别在两个试管中平行进行两个标记反应，方法如下将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)和2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。总体积调整到100μl，溶液在60℃温育30min。
在色谱柱上纯化后(实施例17)，第一管所得到的溶液在95℃温育10min(为了使开DNA双链不成对)，然后将试管浸在0℃的冰-水中直到在DNA芯片上杂交。
第二管所得到的溶液不预先变性而直接在DNA芯片上杂交。
与DNA芯片表面的捕获探针杂交的生物素化的片段通过引入标记PE的链霉抗生物素蛋白显示，反应条件如实施例17所描述。
结果
表16在DNA芯片上杂交前变性的影响所得到的结果列在表16中，杂交前变性所得到的结果要高于未变性的。这说明DNA变性是必需的，以得到良好的强度水平。通过脱碱基位点进行片段化是一种促进双链DNA变性的方式，可以增强DNA与捕获探针杂交的能力。
为了检验其他标记试剂和考虑到用上述各种条件所得到的结果，我们设计了一个参考试验方案，采用甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)片段化以及杂交前变性步骤。
实施例21以一步方案用生物素化的试剂标记和片段化PCR扩增子按照实施例1.1，1.2和1.3描述的方案制备间-bioPMDAM、邻-bioPMDAM和对-bioPMDAM。它们都溶于无水DMSO中，浓度为100mM。
方案与上述实施例20.2所描述的相同(经过杂交前变性后一步标记和片段化)。
结果
表17以一步方案用生物素化的试剂标记和片段化PCR扩增子用优化的方案以一个步骤进行片段化和标记得到极佳的结果，含有活性叠氮甲基功能基团的各种标记试剂所得到的结果都很好，如表17中所示。
实施例22用BioDPDAM标记和片段化DNA按照实施例5.1所描述的方法通过PCR扩增制备DNA扩增子。
标记试剂的合成见实施例1的描述。
方案与实施例20.2所述的相同，包括在杂交前95℃变性。
结果
表18用BioDPDAM标记和片段化DNA表18描述的结果说明，用与苯基同样重要的基团取代也可优化携带叠氮甲烷功能基团标记试剂的反应性。
实施例23用5-(溴甲基)荧光素标记和片段化DNA按照实施例5.1所描述的方法通过PCR扩增制备DNA扩增子。
将50μl甲酸钠(pH3，50mM)和2μl 5-(溴甲基)荧光素(Molecular probes，Eugene，OR)(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl，溶液在60℃温育30min。
纯化条件与实施例17的相同。变性步骤按实施例20.2描述的方案进行。
杂交和阅读的其他条件与文献A.Troesch等，J.Clin.Microbiol.，37(1)49-55，1999描述的相同。荧光素可以在阅读器上直接检测。
表19用5-(溴甲基)荧光素标记和片段化DNA表19中的结果说明，通过产生脱碱基位点的DNA片段化完全适合于携带活性卤烷基功能基团的标记试剂。试验以一个步骤进行(片段化和标记)，但是标记的强度比用携带叠氮甲基功能基团的标记物要低。
实施例24在另一种衍生于菲咯啉的化学片段化试剂存在的情况下标记和片段化DNA扩增子按照实施例5.1所描述的方法通过PCR扩增制备DNA扩增子。使用的两种类型的条件条件a将20μl菲咯啉-FeSO4和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。总体积调整到100μl，混合物在95℃温育60min。
条件b将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，100mM溶于纯水中)和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。总体积调整到100μl，混合物在95℃温育60min。
其他条件与实施例17相同。
表20在菲咯啉存在的情况下标记和片段化DNA扩增两种片段化的条件都得到了满意的结果，如表20所示。
最好的结果是用酸性pH下片段化的条件(b)得到的。
实施例25通过掺入d-UTP-荧光素标记的PCR扩增子的片段化标记核苷酸的掺入按照下面的方案进行PCR扩增以产生有荧光素标记的PCR扩增子(标记在碱基上)。
以16S结核分枝杆菌基因组DNA靶(10+4拷贝)为起始，用Roche的Fast Start试剂盒，加入0.2mM的脱氧核糖核苷酸d-ATP、d-CTP和d-GTP，以及0.14mM d-TTP和0.06mM dUTP-12-荧光素，0.3μM的引物和0.4μl的酶。标记核苷酸占其天然同源物d-UTP的30％。这个比例一般用于通过掺入标记核苷来标记扩增子的反应。
dUTP-12-荧光素是从Roche Diagnostics购买的，参考目录1373242，Mannheim，Germany。
PCR的参数与实施例5相同。
a.用30％dUTP-12-荧光素标记的PCR扩增子的片段化将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl，溶液在60℃温育30min。
b.含30％dUTP-12-荧光素的PCR扩增子片段化期间的标记将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl，然后将溶液在60℃温育30min。这个试验与参考方案一致，因此有可能通过省去由于扩增步骤造成的易差性来比较各种标记策略。
所有试验组在色谱柱上的纯化步骤和变性步骤都在95℃进行，如实施例17所述。
方案(a1)d-UTP-12-荧光素标记的扩增子经片段化得到的核酸(条件a)在DNA芯片上杂交，首先通过直接读取荧光素发射的荧光信号检测，如实施例15所描述的。
方案(a2)信号放大步骤用于提高标记的敏感性。信号的放大通过在杂交步骤期间掺入生物素活化的抗荧光素抗体(参考目录216-065-084，Jackson ImmunoResearch)进行，然后加入PE标记的链霉抗生物素蛋白，所用的连续条件如下·300μl纯水，·300μl 100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％Tween/0.005％消泡剂，2.4μlBSA(50mg/ml)，1.2μl生物素化的抗荧光素抗体(1mg/ml)，·300μl纯水，以及·300μl 100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡剂；6μlBSA(50mg/ml)；6μl链霉抗生物素蛋白-PE(300μg/ml)。
在本方案中，荧光素是作为半抗原(可用标记抗体间接检测的示踪剂)而不是荧光团。
方案(b)
在DNA芯片上杂交的生物素化的片段(条件b)通过引入标记PE的链霉抗生物素蛋白显示，所用条件如下·300μl纯水，和·300μl 100mM Tris缓冲液pH7/1M NaCl/0.05％ Tween/0.005％消泡剂；6μlBSA(50mg/ml)，6μl标记的链霉抗生物素蛋白(300μg/ml)。
标记和杂交后DNA芯片表面发射的荧光以及信号强度和同源性百分数的数据用Affymetrix所提供的阅读系统及软件(GeneChip Instrument System和GeneChipInformation System，Santa Clara CA)进行阅读。在此需要注意的是，所用的阅读系统含有两个过滤装置，因此可以直接检测·按照方案a1或其他方法仅标记d-UTP-荧光素的扩增子检测荧光素·如果扩增子按照下列方法标记则检测PE—按照方案a2用d-UTP-荧光素标记信号的放大，或—按照方案b在片段化期间用间-bioPMDAM标记。
在两种情况下显示都是用PE进行的，使用过滤器可以省去荧光素产生的信号，确保被检测到的是PE信号。
结果
*Flu＝荧光素，PE＝藻红蛋白表21通过掺入d-UTP-荧光素标记的PCR扩增子的片段化上面表21所显示的结果表明，利用产生脱碱基位点的方法进行的化学片段化适合于DNA扩增子的酶促标记，标记可在片段化前进行。
通过酶促掺入荧光团得到的信号强度水平和同源性百分数要低于在片段化期间用含有叠氮甲基功能基团的标记试剂如间-bioPMDAM(条件b)标记得到的信号强度水平和同源性百分数。
为到与用-bioPMDAM衍生物标记得到的信号强度水平就需要信号放大步骤(条件a2)。这表明叠氮甲基活性功能基团的效率确实与传统的掺入修饰碱基如d-UTP-荧光素(参见方案(b))所达到的效率相对应。
实施例26用超声法使双链DNA片段化用实施例5.1所描述的方法得到DNA扩增子。在标记物存在和缺失的情况下用超声法将这些扩增子片段化。
a.超声期间标记DNA扩增子将2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。用纯水将体积调整到100μl，pH调节到6.5。混合物在超声容器(频率35kHz，型号T460-H，Bioblock，France)浴中6O℃温育30min。
b.在PCR扩增子的化学片段化期间标记(一步法参考方案)将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)和2μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。体积调整到100μl，溶液在60℃温育30min。
试验从两份平行进行以便能在凝胶上分析DNA的片段化，并通过DNA芯片的杂交和阅读来分析标记的效率，如上面所描述的(实施例17有关PE的检测)。
凝胶分析分析采用溴化乙啶染色的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％聚丙烯酰胺，7 M尿素，1×TBE)。
凝胶分析表明经过60℃超声处理后DNA扩增子已经被片段化。
结果
表22用超声法便双链DNA片段化表22的结果说明，在超声期间的标记(条件a)是令人满意的。这说明通过超声将DNA进行物理片段化适合于用携带叠氮甲基功能基团的标记试剂标记。
本试验中出现弱的标记结果可能是由于超声的作用下导致标记物降解。而通过酸性pH的作用产生脱碱基位点的片段化则结果更好。
实施例27以一步法标记、片段化及变性DNA按照实施例5.1所描述的方法通过PCR扩增制备DNA扩增子。
两种标记反应如下a.在95℃下以一步法标记、片段化和变性将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)和2μl间-BioPMDAM标记物(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。终体积调整到100μl，溶液在95℃温育30min。本试验中反应混合液不经过预先纯化就在DNA芯片上杂交。
b.60℃下标记和片段化将50μl甲酸钠缓冲液(pH3，50mM)和2μl间-BioPMDAM标记物(3d)(100mM，溶于DMSO中)加入到10μl PCR产物中。终体积调整到100μl，溶液在60℃温育30min。然后反应混和液按照上面所描述的方法纯化。本试验中在DNA芯片上杂交前，按照实施例20.2描述的方法使片段变性。
结果
表23以一步法标记、片段化及变性DNA实施例20.2证明了变性对于双链DNA检测敏感性的重要性。表23中的结果表明，用通过产生脱碱基位点的片段化方法，DNA的标记、片段化和变性可以在一步中完成，从简易性及节约操作者时间的观点来看这是一个值得注意的改进，并且不会影响检测的敏感性。
4-羧基苯甲醛的保护4-羧基苯甲醛是从市场上购买的。将其(3g；20mmol)溶于含有三甲基甲硅烷基氯(10g；92mmol)的100ml MeOH溶液中。混合物在室温搅拌40h。蒸发后分离白色固体为4-甲氧基羧基苯甲醛24，用NMR鉴定，然后用于下一步的反应。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.07(s，1H，-CHO)；8.17(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)，7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.93(s，3H，CO-O-CH2)。
4-甲氧基羰基苯甲醛的保护在有Dowex 50WX8-100(1g)的情况下，4-甲氧基羰基苯甲醛(3.35g；20mmol)用三甲基原甲酸酯(4.8g；40mmol)溶解。混合物在回流下加热2h，然后过滤并蒸发。经过重结晶试验后，NMR分析表明反应是不完全的，因此重新在30ml MeOH，30ml CH(Ome)3和1g Dowex 50WX8-100中室温下反应。然后过滤和蒸发得到3.55g(16.89mmol，84％)的产物25。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.01(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.41(s，1H，CH)；3.93(s，3H，-CO-O-CH3)；3.29(s，6H，-O-CH3)。
化合物26化合物25(3.1g；14.8mmol)溶于16ml(73mmol)4，7，10-三噁-1，13-三癸二胺中。溶液在140-150℃加热2h。然后将混合物溶于100ml DCM(二氯甲烷或CH2Cl2)，用10ml水洗涤6次。有机相通过MgSO2干燥，然后蒸发直到获得油性物。将这种油性物用倾泻法连续用戊烷洗涤3次，然后用DCM和水抽提。经过MgSO2干燥和蒸发后分离出产物26，产率为63％(9.27mmol)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.78(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；5.39(s，1H，CH)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5‘，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(宽s，2H，NH2)。
生物素化的化合物27将生物素(500mg；2.05mmol)悬浮于10ml DMF中，然后加入365mg(2.25mmol)CDI。溶液在室温下持续搅拌30min。将化合物26(900mg；2.26mmol)溶于1ml DMF中，然后一点一点地加到上述溶液中。混合物在室温持续搅拌1h。蒸发后通过急骤层析纯化，所用的色谱柱为20mm直径，洗脱液为250ml MeOH-DCM 6％，然后是200ml MeOH-DCM 7％，最后是200ml MeOH-DCM 8％。产物27的相应组分混和后蒸发至干，得到1.00g油性物，产率约为50％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝9.50(宽s，1H，NH咪唑)；7.80(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.64(s，1H，H咪唑)；7.46(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5和1H，NH2‘)；7.05(S，2H，H咪唑)；6.76(t，1H，NH16)，6.20(宽s，1H，NHB1)；5.44(宽s，1H，NHB3)；5.37(s.1H，CH)；4.42(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，H14’)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8， B9)。
醛化合物28乙缩醛27溶于50ml氯仿中，然后加入20ml 2N HCl。两相混和物剧烈搅拌15min。有机相回收，用无水NaHCO3干燥。过滤并蒸发后得到膏状化合物28(495mg；0.855mmol)，根据生物素计算总产率为42％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.05(s，1H，CHO)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.92(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.58(t，1H，NH2)；6.46(t，1H，NH16)，6.02(宽s，1H，NHB1)；5.19(宽s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。
腙化合物29将醛化合物18(495mg；0.855mmol)溶于10ml无水乙醇中。加入肼(350μl；7.20mmol)，然后将反应混合物在回流下加热1h。蒸发后得到的油性物溶于无水乙醇中以便再次蒸发。用戊烷研磨后得到泡状物。膏状产物29(511mg；0.862mmol)的产率为100％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.72(s，1H，CH)；7.56(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.34(t.1H，NH2’)；6.45(t，1H，NH16)；5.98(宽s，1H，NHB1)；5.78(宽s，2H，NH2)；5.18(宽s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
重氮基化合物30将腙化合物29(357mg；0.602mmol)溶于17.5ml DMF中，然后加入MnO2(700mg；7.7mmol)。室温下搅拌12min后，将混合物用含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉状分子筛的微孔过滤。反应混合物蒸发到干燥。得到的残留油性物用乙醚连续洗三次。得到淡粉红色固体化合物30(290mg，0.491mmol)，产率为82％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.28(t，1H，NH2’)；7.77(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.74(t，1H，NH16’)；7.00(d，2H.J＝8HZ，Ar-H3，5)；6.38(宽S，1H，NHB1)，6.32(宽s，1H，NHB3)；5.80(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3a)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15’)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8HZ，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)。
化合物30的反应性用尿嘧啶3’-单磷酸测试，用毛细管电泳监测。分析条件与实施例6.1相同。结果显示化合物的半衰期是45分钟。试剂在-20℃下至少可以稳定1个月。
实施例29用标记试剂对-Bio-EG3-PDAM标记和片段化DNA扩增子这种类型的分子，也就是携带基于聚乙二醇连接臂的PDAM衍生物的主要优点是其可以使叠氮功能基团和生物素保持分离，因而增加了溶解性，并且在最后的分析中这些分子的反应性得到提高。
对-Bio-EG3-PDAM衍生物30是按照实施例28描述的反应流程得到的。DNA扩增子是按照实施例5.1描述的方法制备的。两种标记反应方法如下。
a.用对-Bio-EG3-PDAM试剂标记将10μl对-Bio-EG3-PDAM(100 mM，溶于DMSO中)和77μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液是均匀的，没有沉淀。将溶液在95℃温育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育10min。
其余方法与实施例8相同。
b.用间-BioPMDAM试剂标记将10μl间-Bio-EG3-PDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。这种产物的合成在实施例1.1中已经提及。溶液出现轻微沉淀。将溶液在95℃温育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育10min。
其余方法与实施例8相同。
结果
表24用对-Bio-EG3-PDAM和间-BioPMDAM标记和片段化DNA扩增子的比较研究表24中得到的信号强度是很满意的，同源性百分数是高的。结果说明将聚乙二醇臂引入到叠氮标记分子上可以增加试剂的水相溶解度。因此试验均一。而且溶解度的增加可以提高标记物的反应性。
实施例30其他含有基于聚乙二醇连接臂的PDAM衍生物的合成实施例30.1间-Bio-EG3-PDAM的合成
合成流程 化合物683-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶于50ml无水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室温下通氩气持续搅拌。6h后将溶液抽真空浓缩，加入50ml甲醇。得到的沉淀物过滤并用甲醇和乙醚洗涤。得到粉末状的19.4g(81％)产物68，其颜色为米色。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(S，1H)；12.12(s，1H)。
化合物69在氩气下将5.07g(22 mmol)化合物68溶于10ml无水DMF中。混合物置于冰上，加入5.00g(32mmol)羰基二咪唑。20min后，缓慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三噁十三烷二胺(EG3)。室温反应3小时后，将DMF蒸发掉，残留物收集到100mlCH2Cl2中。用饱和NaHCO3和水抽提，然后用无水Na2SO4干燥有机相，蒸发溶剂。由此得到4.34g(46％)产物69。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(S，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)。
生物素化的化合物70在氩气下将D-生物素(1.0g，4.1mmol)溶于10ml无水DMF中。混合物在冰上冷却，加入溶于10ml无水DMF中的羧基二咪唑(CDI)(0.665g，4.1mmol)。15min后，加入溶于2ml无水DMF中的化合物69(1.8g，4.1mmol)。在35℃反应3h，然后蒸发DMF，残留物收集到100ml CH2Cl2中。用饱和NaHCO3和水抽提，然后用无水Na2SO4干燥有机相，蒸发溶剂。产物的NMR特征表明所得到的是产物70和游离EG3的混合物。在继续合成前进行另一纯化步骤。
按照实施例1描述的方法两个合成步骤后得到最终的化合物间-Bio-EG3-PMDAM。
本合成方法的优点有两个。其一，只需两步就得到产物69；这个产物可用作叠氮基的前体通过末端的胺基连接到不同性质的可检测分子上。这个基团也可以将化合物69嫁接到固相支持物上。其二，化合物71与间-Bio-PMDAM(我们的参照分子)具有相同的活性中心，这有利于分析优先连接于乙烯甘油(EG3)臂的内含物。
本试剂在-20℃下至少稳定1个月。
实施例30.2间-Bio-EG4-PMDAM的合成合成流程
3-硝基苯乙酮13的保护将33g(0.20mol)3-硝基苯乙酮溶于400ml甲苯中，然后加入40ml(0.717mol)乙二醇和600mg(3.15mmol)对-甲苯磺酸(PTSA)。置于Dean Stark系统中。溶液在130℃加热3h。溶液的温度降到室温后，加入400ml乙酸乙酯，然后用8ml饱和NaHCO3溶液洗涤。有机相用MgSO4干燥。蒸发后得到浅黄色固体13(39.72g；0.190mol)，产率为95％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.11(t，1H，J＝8Hz.Ar-H)；6.87-6.78(m，2H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2c乙缩醛)；3.79(m，2H，H2c乙缩醛)；1.61(S，3H，CH3)。
胺14的制备将化合物13(39.7g；0.190mol)溶于500ml乙醇中，然后加入1g 10％的附在碳上的钯。混合物加热以使其完全溶解，然后使溶液降到室温。抽真空后将溶液置于H2下，持续剧烈搅拌5h。然后将溶液在热的状态下过滤并蒸发。产物14用戊烷洗涤，分离出固体形式的产物(34g；0.189mol)，产率为99％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.14(t，1H，J＝8Hz，Ar-H)；6.85(m，2H，J＝7.5Hz，Ar-H)；6.79(s，1H，Ar-H)；6.59(dd，1H，J＝6.5Hz，Ar-H)；4.00(m，2H，H2c乙缩醛)；3.77(m，2H，H2c乙缩醛)；1.61(S.3H，CH3)。
溴化的化合物15胺14(12.3g；68.7mmol)和三乙胺(7g；69mmol)在氩气下溶于150ml DCM。在-5℃下滴加溶于150ml DCM中的13.8g(60mmol)溴乙酰溴溶液。在添加结束时加入100ml 1N NaHCO3水溶液。有机相用NaHCO3水溶液连续洗涤两次并用MgSO4干燥。蒸发至干后得到22.6g褐色油性物就是化合物15，用于下一步的反应。1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.29(宽s，1H，NH)；7.62(dt，1H4，J＝5Hz，Ar-H)；7.47(s，1H，Ar-H2)；7.38-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.00(m，2H，Br-CH2)；3.75(m.4H，H2C-H2c乙缩醛)；1.61(s，3H，CH3)。
乙醇化合物16氢化钠(3.3g；82.5mmol)用戊烷洗涤三次，然后悬浮于150ml THF中，在室温下加入四乙二醇(50ml；0.29mol)。溶液持续搅拌15min，然后冷却到-5℃。
将化合物15预先滴加稀释到25ml THF中。混合物持续搅拌30min以使其降到室温。将溶液浓缩到100ml，然后用500ml CHCl3中稀释。有机相用250ml 1N的NaHCO3水溶液连续洗涤三次，然后蒸发前用MgSO4干燥。产物在二氧化硅柱(柱直径65mm)上通过急骤层析纯化，洗脱液为1.5 1 MeOH-DCM 5％，然后是500ml MeOH-DCM 7％，最后是500ml MeOH-DCM 10％。化合物16相应的组分混和在一起蒸发至干，得到17.4g(42.1mmol)产物，产率为61％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.86(宽s，1H，NH)；7.71(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.29-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；4.09(m，2H，CO-CH2-O)；3.99(m，2H，H2c乙缩醛)；3.72-3.53(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙缩醛和HO-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
甲苯磺酸盐化合物17将乙醇16(4.13g；10.0mmol)溶于5ml吡啶中。然后在室温下加入2.0g(10.5mmol)甲苯磺酰氯。混和物在氩气下搅拌10h。溶液用100ml DCM稀释，有机相用20ml 1N的NaHCO3水溶液洗涤三次，然后在与甲苯共蒸发前用MgSO4干燥。产物通过急骤层析纯化，色谱柱直径50mm，洗脱液为500ml MeOH-DCM 2％，然后是500mlMeOH-DCM 3％，最后是500ml MeOH-DCM 4％。产物17的相应组分混和后蒸发至干，得到3.68g(6.48mmol)油性物，产率约为65％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.86(宽s，1H，NH)；7.76(d，4H，J＝5.5Hz，Ar-H甲苯磺酰)；7.60(d，1H，J＝7.5Hz，Ar-H4)；7.50(s，1H，Ar-H2)；7.32-7.22(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2C乙缩醛)；3.73-3.54(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙缩醛和HO-CH2)；2.42(s，3H，Ar-CH3)；1.61(s，3H，CH3)。
邻苯二甲酰亚胺化合物18甲苯磺酸盐化合物17(3.68g；6.48mmol)用1.52g(10.0mmol)DBU(1，8-叠氮二环[5.4，0]十一碳烯)溶解，然后加入邻苯二甲酰亚胺(1.47g；10mmol)。所得到的溶液在85-90℃加热17h，然后蒸发。产物在二氧化硅柱(柱直径65mm)上通过急骤层析纯化，洗脱液为11丙酮-DCM 15％，然后是1l丙酮-DCM 20％。化合物18相应的组分混和在一起蒸发至干，得到3.15g(5.8mmol)产物，产率为90％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.73(宽S，1H，NH)；7.79(m，2H，Ar-H邻苯(phtha))；7.99(m，2H，Ar-H邻苯(phtha)和Ar-H4)；7.49(s，1H，Ar-H2)；7.27-7.18(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2c乙缩醛)；3.69-3.56(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙缩醛和N邻苯(phtha)-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
胺化合物19产物18在75-80℃回流下加热溶于20ml无水乙醇中。然后加入肼(1.07ml；22.1mmol)，混合物持续搅拌1h 15min。沉淀物在烧结玻璃上过滤并蒸发掉乙醇相。然后用DCM洗涤白色沉淀物并蒸发掉DCM相。得到的黄色油性物(2.3g；5.57mmol)直接用于下一步的反应，即使含有咪唑也可以在随后的乙缩醛去保护步骤中去除。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.83(宽s，1H，NH)；7.69(d，1H，J＝7.5HZ，Ar-H4)；7.51(s，1H，Ar-H2)；7.30-7.19(m，2H，Ar-H5，6)；4.10(m，2H，CO-CH2-O)；4.00(m，2H，H2c乙缩醛)；3.69-3.56(m，20H，O-CH2-CH2-O，H2c乙缩醛和H2N-CH2)；1.61(s，3H，CH3)。
生物素化的化合物20将D-生物素(1.05g；4.32mmol)溶于10ml无水DMF中。在氩气下加入790mg(4.87mmol)羰基二咪唑(CDI)。搅拌10min后加入稀释在5ml DMF中的胺19。溶液持续搅拌40min，然后在通过急骤层析纯化前蒸发。
所用色谱柱直径为50mm，洗脱液为500ml MeOH-DCM 5％，然后是500ml MeOH-DCM10％，最后是500ml MeOH-DCM 15％。化合物20相应的组分混和在一起蒸发至于，得到黄色油性物(1.66g；2.6mmol)。
根据NMR谱可知，得到的黄色油性物(2.4g)含有重量约为30％的咪唑。由此可以推断出产物20的产率相对于起始生物素约60％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.80(宽s，1H，NH)；7.66(m，3H，Ar-H4和H咪唑)；7.54(s，1H，Ar-H2)；7.28-7.24(m，2H，Ar-H5，6)；7.07(s，2H，H咪唑)，6.59(t，1H，NH15’)；6.06(宽s，1H，NHB1)；5.19(宽s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；4.10(s，2H，H3’)，4.00(m，2H，H2c乙缩醛)；3.75-3.49(m，18H，O-CH2-CH2-O和H2c乙缩醛)；3.36(m，2H，H14’)；3.09(m，1H，HB4)；2.85和2.66(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.16(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.61(S，3H，CH3)；1.59-1.3(m，6H，HB9，B8，B7)。
酮化合物21将乙缩醛化合物20溶于80ml氯仿中，然后加入30ml 2N HCl。混合物持续剧烈搅拌45min。有机相回收然后用无水NaHCO3干燥。过滤后将溶液蒸发，得到的油性物用戊烷洗涤，得到产物21(1.48g；2.48mmol)，产率为99％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.99(宽s，1H，NH)；8.07(s，1H，Ar-H2)；7.98(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.66(d，2H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，2H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.38(t，1H，NH15’)；5.78(宽s，1H，NHB1)；4.96(宽s，1H，NHB3)；4.47(m，1H，HB6a)；4.29(m，1H，HB3a)；4.13(s，2H，H3’)；3.76-3.37(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.11(m，1H，HB4)；2.89和2.75(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.59(s，3H，CH3)；2.16(t，2H，J＝8 Hz，HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。
腙化合物22将酮化合物21溶于20ml无水乙醇中。混合物在75-80℃回流加热。然后加入肼(816μl；16.81mmol)，混合物持续搅拌3h。过滤后将混合物蒸发至干，残留物重新溶于乙醇中直到出现厚的白色泡沫。在第二个例子中，将此泡沫溶于50ml氯仿中，然后加入20ml饱和的NaHCO3溶液。混合物充分洗涤后回收有机相。用无水Na2CO2干燥，过滤蒸发至干后得到新的黏性泡沫。后者就是产物22(842mg；1.38mmol)，产率为66％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.81(宽s，1H，NH)；8.82(s，1H，Ar-H2)；7.64(d，2H.J＝8Hz，Ar-H4)；7.32(m，4H，Ar-H5，6)；6.43(t，1H，NH15’)；5.89(宽s，1H，NHB1)；5.46(宽s，2H，NH2)；4.99(宽s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；4.11(s，2H，H3’)；3.70-3.37(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.32(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.87和2.67(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(m，5H，CH3和HB10)；1.64-1.40(m，6H，HB9，B8，B7)。
叠氮化合物23将腙化合物22(100mg；0.164mmol)在氩气下溶于1ml DMF中。加入80mg活化的MnO2，混合物持续剧烈搅拌30min。混合物通过含硅藻土(3cm)-粉状分子筛(1cm)复合层过滤。然后将溶液蒸发至干。在蒸发结束时得到的油性物磨碎直到得到粉红色粉末，该粉末就是化合物23(78mg；0.128mmol；78％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝9.60(宽s，1H，NH)；7.89(S，1H，Ar-H2)；7.76(t，1H，NH15’)；7.35-7.25(m，4H，Ar-H5，6)；6.64(d，2H，J＝8Hz，Ar-H4)；6.36(宽s，1H，NHB1)；6.32(宽s，1H，NHB3)；4.28(m，1H，HB6a)；4.08(m，1H，HB3a)；4.06(s，2H，H3’)；3.55-3.31(m，16H，O-CH2-CH2-O)；3.17(m，2H，H14’)；3.08(m，1H，HB4)；2.80和2.59(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(m，5H，CH3)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.99-1.30(m，6H，HB9，B8，B7)。
检测化合物23在尿嘧啶3’-单磷酸上的反应性，并用毛细管电泳监测。分析条件与实施例6.1一致。结果显示其半衰期是30min。
该试剂在-20℃的稳定性大于1个月。
实施例30.3对-Bio-EG3-PMDAM的合成合成流程
·4-乙酰苯甲酸的保护将4-乙酰苯甲酸(1g；6.1mmol)溶于含5ml MeOH的三甲基甲硅烷基氯化物溶液(TMSCl，10g；92mmol)中。
混合物90℃加热过夜。蒸发后得到白色固体化合物31(1.21g；5.75mmol)。通过NMR鉴定其特征并用于下一步的反应。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.08(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.59(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3,18(s，6H，-O-CH3)；1.53(s，3H，CH3)。
化合物32在有Dowex 50WX8-100(0.3g)的情况下，将化合物31(1.21g；5.75mmol)溶于5ml三甲基原甲酸酯中。混合物60℃加热过夜，然后过滤蒸发得到化合物32(1.19g；5.3mmol)，产率为87％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.00(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.54(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.89(s，1H，CO-O-CH3)；3.16(8，6H，-O-CH3)；1.51(s，3H，CH3)。
化合物33
将化合物32(1.17g；5.22mmol)溶于5ml(22.7mmol)4，7，10-三噁-1，13-十三烷二胺中。得到的溶液140℃加热4h。然后将混合物溶于30ml DCM中，用10ml水洗涤三次。有机相用MgSO4干燥，然后蒸发直到得到油性产物33(1.44g；3.49mmol)，产率为67％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.51(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；3.62-3.47(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.15(s，6H，-O-CH3)；2.73(m，2H，H15’)1.88(m，2H，H4’)；1.65(m，2H，H14’)；1.38(宽s，2H，NH2)。
生物素化的化合物34将生物素(780mg；3.19mmol)悬浮于13ml DMF中。然后加入590mg(3.60mmol)CDI。溶液在室温持续搅拌30min。化合物33溶于1ml DMF中，然后将前面的溶液一点一点的加入。得到的混合物在室温持续搅拌1h。蒸发DMF后，通过急骤层析纯化，色谱柱直径为35mm，洗脱液为500ml MeOH-DCM 6％，然后是250mlMeOH-DCM 8％，最后是250ml MeOH-DCM 8％。产物34相应的组分混和后蒸发至干，得到1.05g油性物，产率约为30％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.49(宽s，1H，NH咪唑)；7.79(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.66(s，1H，H咪唑)；7.50(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.38(t，1H，NH2’)；7.11(S，2H，H咪唑)；6.67(t，1H，NH16’)；5.99(宽s，1H，NHB1)；5.15(宽s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6A)；4.27(m，1H，HB3a)；3.61-3.45(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.28(m，2H，H15’)；3.15(s，6H，-OCH3)；2.85(m，1H，HB4)；2.85和2.69(ABX系统，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.69(m，2H，H14’)；1.49(s，3H，CH3)；1.42-1.39(m，6H，HB7，B8，B9)。
化合物35乙缩醛34溶于45ml氯仿中，然后加入10ml 2NHCl。两相混合物剧烈搅拌5min。回收有机相，用无水NaHCO2干燥。过滤、蒸发后得到淡黄色固体状态的化合物35(504mg；0.87mmol)，按照生物素计算总产率为27％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.97(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.91(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.51(t，1H，NH2‘)；6.50(t，1H，NH16’)，6.05(宽s，1H，NHB1)；5.23(宽s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’， 8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.46(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.10(m，1H，HB4)；2.85和2.71(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.60(s，3H，CH3)；2.14(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.61(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.40(m，2H，HB8)。
腙化合物36将酮化合物35(500mg；0.864mmol)溶于11ml无水乙醇中。加入肼(335μl；6.911mmol)，然后将反应混合物回流加热1h。蒸发后得到的油性物溶于无水乙醇中以便再次蒸发。得到黏性泡沫状产36物(488mg；0.823mmol)，产率为95％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.76(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2，6)；7.67(d，2H，J＝8Hz，Ar-H3，5)；7.29(t，1H，NH2’)；6.46(t，1H，NH16’)，5.98(宽s，1H，NHB1)；5.55(宽s，2H，NH2)；5.14(宽s，1H，NHB3)；4.45(m，1H，HB6a)；4.24(m，1H，HB3a)；3.62-3.51(m，10H，H7’，，8’，10’，11’和H5’)；3.47-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.69(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10和s，3H，CH3)，1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
叠氮化合物37将腙化合物36(200mg；0.337mmol)溶于5ml DMF中。加入MnO2(450mg；5.17mmol)。室温下搅拌15min后，将混合物通过含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末状分子筛的微孔过滤。反应混合物蒸发至干。得到的残留油性物用乙醚连续洗三次，直到得到粉末状物质。得到的化合物37(290mg，0.491mmol)呈粉红色固体状态，产率为93％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.33(t，1H，NH2’)；7.83(d，2H，J＝8Hz，Ar-H2.6)；7.73(t，1H，NH16’)；6.98(d，2H，J＝8 Hz，Ar-H3，5)；6.39(宽s，1H，NHB1)；6.33(宽s，1H，NHB3)；4.30(m，1H，HB6a)；4.12(m，1H，HB3a)；3.51-3.45(m，16H，H7’，8’，10’，11’和H5’和H15’和H3’，13’)；3.07(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系统，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.14(s，3H，CH3)；2.04(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.77(m，2H，H4’)；1.62-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.31(m，2H，HB8)。
检测化合物37在尿嘧啶3’-单磷酸上的反应性，并用毛细管电泳监测。分析条件与实施例6.1一致。结果显示其半衰期是60min。
该试剂在-20℃的稳定性至少为1个月。
实施例30.4间-Bio-EG3-PDAM的合成合成流程
甲基-3-甲酰苯甲酸盐38的保护将Dowex 50WX8-100树脂(2g)溶于25ml MeOH和25ml三甲基原甲酸酯中，持续搅拌15min。滗析后用20ml MeOH连续洗涤树脂两次。然后将树脂置于100mlMeOH内，然后加入50ml CH(OMe)3和7.12g(43.4mmol)甲基-3-甲酰苯甲酸盐。溶液持续搅拌15min，然后在蒸发前用折叠的滤纸过滤。分离出淡黄色液体状产物39(9g；43.1mmol)，产率为99％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.10(s，H，Ar-H2)；7.9(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.63(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.42(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.40(s，1H，CH)；3.90(s，3H，-CO-O-CH3)；3.31(s，6H，-O-CH3)。
化合物40将化合物39(2g；9.5mmol)溶于10.4ml(47.6mmol)4，7，10-三噁-1，13-三烷二胺中。得到的溶液在165℃加热2h。然后将混合物溶于80 ml DCM中，用20ml水洗涤4次。用MgSO4干燥和蒸发后分离出产物40(2.27g；5.69mmol)，产率为60％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.84(s，H，Ar-H2)；7.75(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；5.38(s，1H，CH)；3.64-3.43(m.14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3‘)；3.29(s，6H，-O-CH3)；2.72(m，2H，H15’)；1.87(m，2H，H4’)；1.64(m，2H，H14’)；1.30(宽s，2H，NH2)。
生物素化的化合物41将D-生物素数(344mg；1.40mmol)悬浮于4ml DMF中。然后加入250mg(1.54mmol)CDI。溶液在室温持续搅拌30min。化合物40(616mg；1.54mmol)溶于2ml DMF中，然后将前面的溶液一点一点的加入。得到的混合物在室温下持续搅拌50min。蒸发后，通过急骤层析纯化，色谱柱直径为30mm，所用洗脱液为750ml MeOH-DCM10％，然后是250ml MeOH-DCM 15％。产物41相应的组分混和后蒸发至干，得到740mg油性物，产率约为50％。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝7.87(s，H，Ar-H2)；7.78(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.65(s，1H，H咪唑)；7.53(d，H，J＝8Hz，Ar-H6)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；7.07(s，2H，H咪唑)；6.65(t，1H，NH16’)；5.95(宽s，1H，NHB1)；5.38(s，1H，CH)；5.15(宽s，1H，NHB3)；4.43(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.59-3.44(m，14H，H7’，8’，10’，11’和H5’，13’和H3’)；3.29(m，8H，H15’和2-O-CH3)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.66(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.13(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.85(m，2H，H4’)；1.66(m，2H，H14.)；1.40-1.37(m，6H，HB7，B8， B9)。
醛化合物42将乙缩醛化合物41溶于20ml氯仿中，然后加入5ml 2N HCl。两相混合物持续剧烈搅拌15min。有机相回收然后用无水NaHCO3干燥。过滤后将溶液蒸发，得到淡黄色油性状的化合物42(593mg；1.02mmol)，按照生物素计算在产率为87％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝10.04(s，1H，CHO)；8.34(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8 Hz，Ar-H4)；7.96(d，H，J＝8 Hz，Ar-H6)；7.72(t，1H，NH2’)；7.39(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.51(t，1H，NH16’)；6.00(宽s，1H，NHB1)；5.30(宽s，1H，NHB3)；4.46(m，1H，HB6a)；4.27(m，1H，HB3a)；3.66-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.50-3.29(m，4H，H3’，13’)；3.28(m，2H，H15’)；2.95(m，1H，HB4)；2.84和2.71(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.15(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.89(m，2H，H4’)；1.72-1.63(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.23(m，2H，HB8)。
腙化合物43将醛化合物42(593mg；1.02mmol)溶于10ml无水乙醇中。加入肼(400μl；8.19mmol)，然后将反应混合物回流加热50min。蒸发后得到的黄色油性物用乙醚磨碎直到得到米色粉末状产物43(404mg；0.68mmol)，产率为66％。通过急骤层析纯化，色谱柱直径为15mm，上样量为150mg(0.253mmol)，洗脱液为200mlMeOH-DCM 20％。各组分混和后蒸发至干，得到144mg产物43，产率为76％。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝7.95(s，H，Ar-H2)；8.16(d，H，J＝8Hz，Ar-H4)；7.76(s，1H，CH)；7.96(d，H，J＝8HZ，Ar-H6)；7.38(t，H，J＝8Hz，Ar-H5)；6.45(t，1H，NH16’)；5.98(宽s，1H，NHB1)；5.72(宽s，2H，NH2)；5.18(宽s，1H，NHB3)；4.44(m，1H，HB6a)；4.26(m，1H，HB3a)；3.62-3.56(m，10H，H7’，8’，10’，11’和H5’)；3.48-3.45(m，4H，H3’，13’)；3.27(m，2H，H15’)；3.07(m，1H，HB4)；2.84和2.68(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.11(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.86(m，2H，H4’)；1.72-1.59(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.21(m，2H，HB8)。
叠氮化合物44将腙化合物43(100mg；0.187mmol)溶于4ml DMF中。加入MnO2(200mg；2.3mmol)。室温搅拌13min后将混合物通过含有硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末状分子筛的微孔过滤。反应混合物蒸发至干。得到的残留油性物用乙醚连续洗三次，得到橙色固体化合物44(290mg，0.491mmol)呈粉红色固体状，产率为83％。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝8.39(t，1H，NH2’)；7.78(t，1H，NH16’)；7.39-7.34(m，Ar-H)；7.09(d，Ar-H)；6.38(宽s，1H，NHB1)；6.32(宽s，1H，NHB3)；5.78(s，1H，CH-N2)；4.27(m，1H，HB6a)；4.11(m，1H，HB3A)；3.51-3.44(m，10H，H7’，8’， 10’，11’和H5’)；3.37(m，2H，H15)；3.32(m，4H，H3’，13’)；3.05(m，1H，HB4)；2.79和2.58(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，HB6)；2.02(t，2H，J＝8Hz，HB10)；1.69(m，2H，H4’)；1.59-1.48(m，6H，H14’，HB7，B9)；1.25(m，2H，HB8)。
产物在-20℃下稳定性大于1个月。
实施例31对-Cy5-EG3-PDAM的合成如实施例2己提及的，生物素可以被其他标记物如Cy5替代。本实施例说明PDAM携带的叠氮功能基团也可以通过一个聚乙二醇连接臂连接到这种Cy5标记物上。
合成流程反荷离子I-不在结构式46，47，50’和51中表示。
2-[4-(N-乙酰基-N-苯基氨基)丁-1，3-二烯]-1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物47将溶于乙酸酐(50ml)的丙醛二(苯基亚氨基)一-氢氯化物45(13g；50.2mmol)、NaOAc(6.0g；69.7mmol)和1，2，3，3-四甲基[3H]碘咯碘化物46(3.01g；10mmol)的混合物在100℃精确加热20min。冷却后加入乙醚(350ml)，然后将沉淀的棕色固体过滤，用乙醚(3×100ml)洗涤。固体重新溶于150ml CH2Cl2中，过滤(去除有机盐)，然后用350ml乙醚沉淀得到棕色固体(3.54g，54％)。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.64(d；1H；J＝12Hz；1-H)；8.14(t；1H；J＝16；12Hz；3-H)；7.63-7.19(m；9H)；6.90(d；1H；J＝15Hz；4-H)；5.82(t；1H；J＝12；13Hz；2-H)；4.06(s；3H；NCH3)；(2.16(s；3H；-COCH3)；1.74(s；6H；CH3)。
1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基[3H]碘咯碘化物502，3，3-三甲基吲哚48(10.0g；62.8mmol)和6-溴己酸49(12.3g；62.8mmol)不加溶剂混和，在氩气下110℃加热12h。紫红色的浆糊状混合物用乙酸乙酯(2×60ml，浆糊状物质用刮刀研磨，倾析出上清液)洗涤，然后用丙酮(50ml，浆糊状物固化)洗涤。将粉红色固体过滤并在真空下干燥(16.0g；73％)。
Cy5COOH化合物51溶于乙酸酐(11ml)中的碘化物47(2.5g；5.3mmol)、溴50(1.87g；5.3mmol)和NaOAc(1.08g；12.1mmol)的混合物在120℃加热25min。冷却后加入乙醚(200ml)，沉淀物过滤并用乙醚(3×50ml)洗涤。与产物50’对应的固体溶于100ml CH2Cl2中，然后蒸发。然后将其溶于15ml醋酸中，120℃搅拌30min。加入200ml乙醚并在烧结玻璃上过滤后得到与产物51相应的沉淀物(2.71g；4.44mmol)，产率为84％。
1H NMR(CDCl3)δ＝8.03(t；2H；J＝10；11Hz，2-H，4-H)；7.38-6.91(m；9H；Ar-H，3-H)；6.41(d；1H；J＝14Hz；1-H)；6.31(d；1H；J＝13Hz；5-H)；4.07(t；2H，J＝7；7Hz；α-CH2)；3.68(s；3H；NCH3)；2.47(t；2H，J＝7；7 Hz；ε-CH2)；1.71(m；18H；CH3，β，γ和δ-CH2)。
化合物26与Cy5COOH 51的偶合(产物52)N-甲基吗啉(NMM，405μl，3.68mmol)加入到溶于15ml CH2Cl2的Cy5COOH 51(1.5g；2.46mmol)溶液中。溶液在冰浴中冷却，放置于氩气下，然后加入异丁基氯甲酸盐(494μl，3.81mmol)。搅拌10min后，加入稀释于8ml CH2Cl2中的胺26(1.86mg；4.67mmol)。混合物在室温持续搅拌1h 30min。加入20ml CH2Cl2，混合物用25ml的NaHCO3(1N)连续洗涤3次。用Na2CO3干燥后，过滤溶液以回收蒸发的二氯甲烷相。
通过急骤层析纯化，色谱柱直径为45mm，20ml组分。洗脱液为MeOH-DCM 10％。产物52相应的组分混和后蒸发至干得到蓝色固体，将其溶于CH2Cl2。然后沉淀产物52，用乙醚洗涤后得到蓝色产物(1.45g；1.77mmol)，产率为72％。
将产物52(磺化物)溶于54ml甲醇中，然后通过安珀莱特IRA900柱(Cl-；15g)。回收的甲醇溶液蒸发至干后得到黏性油状物，将其重新溶于CH2Cl2中。蒸发后可以得到产物52’，产率为87％。
醛53乙缩醛化合物52’溶于10ml DCM中，然后加入10ml 2N HCl。溶液剧烈搅拌3h 30min。加入20ml DCM后，回收二氯甲烷相，然后用NaHCO2干燥。蒸发后得到的产物用乙醚洗涤，得到醛53(1.18g；1.46mmol)，产率为90％。
腙54将醛化合物53(200mg；0.247mmol)溶于1ml无水乙醇中，加入一水合肼(15.6μl；0.321mmol)，溶液在室温搅拌30min。加入8ml乙醚；混合物通过滗析用乙醚连续洗涤三次，然后在真空下干燥。得到172mg肼54(0.209mmol；85％产率)，储存在冰箱中。
叠氮55将100mg MnO2加入到溶于2ml DMF中的20mg(0.243mmol)腙化合物54溶液中，混合物在室温氩气下剧烈搅拌5min。悬液通过一层硅藻土(厚度2cm)和3(0.5cm)粉末状分子筛过滤，然后用DMF洗涤。溶液蒸发后残留物用乙醚磨碎，干燥得到的固体，得到18mg(0.185mmol；76％)叠氮55。
试剂在-20℃下稳定性大于1个月。
实施例32间-氟-EG3-PMDAM的合成如实施例23和25已提及的，生物素可以被其他标记物替代。本实施例说明PDAM携带的叠氮功能基团也可以通过一个聚乙二醇连接臂连接到这种荧光标记物上。
合成流程
化合物72在通氩气条件下将异硫氰酸荧光素(250mg，0.64mmol)溶于1.6ml含2％吡啶的无水DMF中。然后加入溶于1.6ml无水DMF中的产物69(0.356g，0.81mmol)。混合物在室温反应3.5h，然后蒸发DMF，残留物溶于25ml水中。然后用50ml CH2Cl2抽提三次，蒸发水相。得到255mg(48％)产物72。
间-氟-EG3-腙-甲苯磺酰化合物75在回流下将化合物72(255mg，0.31mmol)溶于1.5ml乙醇中。加入溶于1.5ml乙醇中的对-甲苯磺酰-肼(69.2mg，0.37mmol)，混合物反应6h。将混合物蒸发至干，固体用CH2Cl2，水和乙醚洗涤。得到18.5mg(74％)橙色粉末状产物75。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.6-1.8(m，4H)；2.13(s，1H)；2.28(s，1H)；2.36(s，1H)；2.80(m，1H)；3.07(m，2H)；3.46(m，12H)；6.5-6.7(m，6H)；7.1-8.3(m，9H)。
间-氟-EG3-PMDAM化合物74将腙75(176mg，0.18mmol)溶于720μl 10％ KOH(含无水甲醇)溶液中。溶液在回流下保持3h。溶液冷却后出现沉淀，过滤溶液并蒸发至干。残留物用乙醚洗涤并干燥。
NMR分析结果表明，在2.36和2.13ppm(对应于甲苯磺酰和腙的甲基)处信号消失，而在1.96ppm(对应于叠氮的甲基)处出现一个峰。
实施例33制备叠氮甲基中间体以进行随后的标记不用携带标记物R2的叠氮甲基标记试剂直接标记而是分两个阶段间接标记可能更有利。在这种情况下，含有叠氮甲基官能团的标记试剂是被预先功能化了的，就是说其也含有能随后与直接或间接标记物反应的化学官能团。预先功能化可以通过将一个活性的共价官能团引入到标记试剂中，该标记试剂可以与直接或间接标记物的抗活性共价官能团反应。这些官能团包括亲电子的有机化学官能团和亲核的有机化学官能团，或者相反。
这种标记策略的一个实施例在下面流程图中说明。
其中除了叠氮官能团外，标记试剂还含有一个亲电子或亲核的官能团W1，该基团能与含有官能团W2的标记物R2反应，W2与W1互补。
例如，如果W1是甲基酮或醛官能团，W2就是烷氧胺官能团。
在一种标记生物分子如核酸的方法中，先将核酸与含有叠氮甲基官能团的标记试剂接触，然后标记物W2-R2通过官能团W1与核酸反应。
例如，这些用途之一是扩增一段核酸序列的方法或信号放大的方法。这种类型的标记的其他信息见专利申请WO-A-98/05766，其优先申请日为1996年8月2日，以及专利申请WO-A-00/40590，其优先申请日为1999年1月5日。
实施例33.1MeCO-PMDAM的合成合成流程
产物85，其合成方法已在本实施例中描述，可以使其通过叠氮甲基官能团与磷酸基团的反应性来标记天然核酸，因此可以引入甲基酮官能团，该基团随后用于引入一种具有烷氧胺基团的可检测分子(荧光素，生物素)。
该合成是基于化学中常用的已知方法。起始材料与标记物71和74合成所用的材料相同。第一步包括用芴甲基甲酸酯(Fmoc，99)保护末端胺。选择这个保护基团是基于其稳定性和裂解条件。

用前面使用的方法(间-氟-EG3-PMDAM实施例)形成保护的腙82后，末端胺在温和碱性条件下去保护以确保腙的稳定性。甲基乙酰乙酸用于产生甲基酮官能团，通过末端胺的乙酰化反应(见化合物26和36的形成)。叠氮甲基的形成是按照述方法进行的。
实施例33.2H2NO-PMDAM的合成合成流程 产物88，其合成方法已在本实施例中描述，可以使其通过叠氮甲基功能基团与磷酸基团的反应性来标记天然核酸，因此可以引入烷氧氨基官能团，该基团随后可用于引入一种具有甲基酮基团的可检测分子(荧光素，生物素)。
本合成方法是基于前面所述的合成模式，就是说使用前体69；使用Fmoc保护胺以及使用甲苯磺酰保护腙。烷氧胺基官能团(化合物86)的引入是用Fmoc功能基团(E.Trévisiol Thesis，LEDSS Grenoble，1999)来保护羧基甲氧基胺(市售的)发生的。最后去保护(化合物88)的条件是温和的，并且在叠氮甲基形成后立即进行。
实施例34PDAM衍生物的制备以放大信号实施例34.1双-生物素化标记物如[Bio-EG3]2-PDAM的合成合成流程 三里基1，3，5-苯三羧酸盐56还原成乙醇57
将三酯56(12.6g；50.0mmol)溶于100ml THF中，然后在室温加入1.1g(50.5mmol)LiBH4。红色溶液在氩气下40-45℃加热1h。冷却后(冰上)，通过加入水(200ml)和2N HCl(30ml)小心地破坏多余的氢化物(释放出氢气)。观察到颜色变成淡黄色。溶液用CH2Cl2提取(100ml，然后50ml三次)，有机相用无水NaHCO3洗涤，用MgSO4干燥，然后蒸发溶剂直到获得油性物(11.1g)。通过急骤层析在硅色谱柱(直径＝40mm，洗脱液乙酸乙酯/环己烷＝1/1)上纯化得到乙醇57(6.38g，57％)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.53(t，1H，J＝2Hz)；8.18(d，2H，J＝2Hz)；4.76(s，2H)；3.91(s，6H)，2.30(s，1H)。
乙醇57氧化成醛58将乙醇57(5.86g；26.1mmol)溶于100ml THF中，然后在室温用超过5min的时间缓慢加入40.0g MnO2。溶液在氩气下持续搅拌过夜。溶液通过具有一层硅藻土545的布氏漏斗过滤，用CH2Cl2洗涤，然后蒸发溶剂。粗固体(4.4g)通过急骤层析在硅色谱柱(直径＝50mm，洗脱液乙酸乙酯/环己烷＝3/7)纯化。得到3.44g(59％)醛化合物58。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝10.11(s，1H)；8.89(t，1H，J＝1Hz)；8.69(d，2H，J＝1Hz)；3.98(s，6H)。
乙缩醛59的形成将醛58(3.21g；14.4mmol)溶于30ml甲醇中，然后加入6.0ml TMSC1。溶液在室温氩气下持续搅拌1h。溶液用200ml CH2Cl2稀释，加入1M NaHCO3(100ml)搅拌(小心CO2散发)。两相分离，用CH2Cl2(25ml)提取水相三次，有机相混和，用MgSO4干燥，然后蒸发溶剂。得到3.55g(92％)乙缩醛59。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.63(t，1H，J＝2Hz)；8.29(d，2H，J＝2Hz)；5.45(s，2H)；3.93(s，6H)；3.32(s，6H)。
二酯59水解成二酸60二酯59(3.18g；11.9mmol)溶于10ml THF中，然后加入溶于10ml甲醇中的KOH(2.0g，丸状占85％)溶液中。置于室温15min后蒸发溶剂。残留物溶于水(50ml)中。加入磷酸(大约2.5ml，85％)将pH调整到3，白色沉淀物在烧结玻璃(#3)上过滤，用水洗涤并在真空下干燥。得到2.59g(91％)二酸60。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝8.43(t，1H，J＝1Hz)；8.15(d，2H，J＝1Hz)；5.53(s，1H)；3.27(s，6H)。
三氟乙酰胺62二胺61(66g；0.30mol)溶于250ml CH2Cl2中，然后滴加乙酰三氟乙酸盐(11.8ml，0.10mol)，在10℃氩气下边搅拌边加入，滴加时间超过5min。在室温静置15min后将溶液转移到分离漏斗中，用水(3×100ml)洗涤，用MgSO4干燥，然后蒸发溶剂。得到的单酰胺62的纯度大约为85％(19F NMR确定)。将化合物储存在-20℃，不经纯化就可以使用。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化态(quantiplet)，2H，J＝6Hz)；1.67(量化态，2H，J＝6Hz)；1.30(宽s，2H)。
19F NMR(190MHz，CDCl3)δ＝-76.3。
化合物63将羰基二咪唑(CDI，6.32g，80％，31.2mmol)加入到溶于50ml DMF中的D-生物素(6.39 g；26.2mmol)悬液中。混合物在55-60℃氩气下边搅拌边加热30min。加入的物质一开始完全溶解，然后聚集成一团白色固体沉淀物(CO2散发出)。在5mlCH2Cl2的帮助下加入胺(油性)以便漂洗。混合物在55-60℃加热3h。在真空(＜1mmHg)下蒸发DMF，残留物用CH2Cl2(700ml)和2N HCl(100 ml)搅拌。两相通过一层硅藻土545过滤后分离，水相用CH2Cl2(15×100ml)抽提，有机相混和，用无水NaHCO3和MgSO4干燥，然后蒸发溶剂。油性残留物用150ml乙醚研磨获得悬液。粘性固体难以过滤。将上清液倾析掉，然后用乙醚重复洗涤。真空干燥后得到9.13g(64％)化合物63。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝3.5-3.6(m，12H)；3.42(t，2H，J＝6Hz)；2.75(t，2H，J＝6Hz)；1.81(量化态，2H，J＝6Hz)；1.67(量化态，2H，J＝6Hz)；1.30(宽s，2H)。
化合物64将溶于氨水(100ml，22％含水)中的化合物63加入到一个250ml带有隔膜的圆底烧瓶中于55-60℃加热2h。冷却后蒸发溶剂。残留物溶于甲醇(20ml)中，通过Dowex 21K阴离子树脂的柱[高度12cm×直径35mm，通过预先用1N NaOH(1.51)，然后是水(1.51)，最后是甲醇(1.51)洗涤得到OH-型]。不含三氟乙酸盐离子的化合物64和200ml甲醇一起通过柱为第一组分。将其蒸发后残留物用50ml乙醚研磨并将上清倾析掉，然后用乙醚重复洗涤5次。干燥后得到化合物64(6.43g，86％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝6.77(t，1H，J＝4Hz)；6.32(s，1H)；5.52(s，1H)4.45(m，1H)；4.28(m，1H)，3.50-3.68(m，12H)；3.30(m，2H)，3.11(m，1H)；2.86(dd，1H，J＝13和5Hz)，2.75(t，2H，J＝13Hz)，2.68(d，1H，J＝13Hz)；2.16(t，2H，J＝7Hz)；1.60-1.85(m，8H)；1.41(m，2H)。2-乙缩醛65将羰基二咪唑(225mg，90％，1.25mmol)加入到溶于二氯乙烷(5ml)的二酸60(120mg；0.500mmol)悬液中，混合物在55-60℃加热30min，在氩气下搅拌。加入胺64(550mg；1.23mmol)，溶液在55-60℃加热6h。蒸发后残留物通过硅柱(直径25mm，洗脱液甲醇15-30％溶于CH2Cl2中)。得到413mg(75％)化合物65。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝8.34(s，1H)；8.06(s，2H)；7.87(m，2H)；6.85(m，2H)；6.60(s，2H)；5.93(s，2H)5.40(s，1H)；4.45(m，2H)；4.27(m，2H)，3.43-3.68(m，24H)；3.31(s，6H)；3.25(m，4H)，3.08(m，2H)；2.83(dd，2H，J＝13和5Hz)，2.70(t，2H，J＝13Hz)；2.13(t，4H，J＝7Hz)；1.89(五重态，4H，J＝7Hz)；1.55-1.70(m，12H)；1.37(m，4H)。2-醛66将溶于35ml甲醇中的乙缩醛65(413mg；0.376mmol)用2N HCl(0.5ml)处理。蒸发后用乙醚洗涤，得到醛66(0.37g，90％)。
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ＝10.11(s，1H)；8.82(t，2H，J＝6Hz)；8.62(s，1H)，8.47(s，2H)；7.73(t，2H，J＝5Hz)；4.30(m，2H)；4.11(m，2H)，3.30-3.60(m，24H)；3.06(m，6H)；2.80(dd，2H，J＝12和5Hz)，2.56(t，2H，J＝12Hz)；2.03(t，4H，J＝7Hz)；1.78(五重态，4H，J＝7Hz)；1.35-1.60(m，12H)；1.28(m，4H)。2-PDAM 67按照制备叠氮甲烷(实施例1)的方法将醛66转化成叠氮甲烷67。
该试剂在-20℃的稳定性大于1个月。
实施例34.2间-Bio7-EG3-PMDAM的合成合成流程
EG3-苯乙酮化合物76将3，6，9-三噁-1，11-十一烷二酸(EG3，12.64ml，74mmol)在氩气下溶于80ml无水DMF中，在冰浴中冷却。将二环己基碳二亚胺(DCC，11.45g，55.5mmol)溶于无水20ml DMF中，然后缓慢加到上述溶液中。30min后加入3-氨基苯乙酮(5.0g，37mmol)，反应在室温氩气下进行1h。然后在真空下蒸发DMF，加入70ml CH2Cl2。过滤溶液并用3×25ml 1％乙酸抽提。将水相混和，并用25ml CH2Cl2洗涤。有机相混和，用无水硫酸钠干燥并蒸发至干。产物从MeOHHaO对重结晶。因此得到8.74g(70％)产物76。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.55(s，3H)；3.5-3.7(m，8H)；4.0(s，2H)；4.1(s，2H)；7.45(t，1H)；7.65(d，1H)；7.90(d，2H)；8.2(s，1H)；9.8(s，1H)。
(NH2)7-EG3-苯乙酮化合物77将产物76(120mg，0.35mmol)在氩气下溶于15ml无水DMF中，在冰上冷却，然后加入DCC(110mg，0.53mmol)。30min后，将此溶液缓慢加到一种市售的树状聚体“星暴PAMAM树状聚体，第一代”(Aldrich，St Quentin Fallavier)(1g，0.71mmol，溶于5ml甲醇中)溶液表面，剧烈搅拌。反应在室温进行1h，蒸发混合液。残留物收集到10ml CH2Cl2中，用30ml 1％的乙酸抽提两次。
Biot7-EG3-苯乙酮化合物78将D-生物素(1.73g，7.08mmol)在氩气下溶于80ml无水DMF中，溶液在冰上冷却。连续加入N-甲基吗啉(NMM，856μl，7.7mmol)和异丁基氯甲酸酯(1022μl，7.7mmol)。30min后加入产物77(1.13g，0.7mmol，溶于5ml甲醇中)，反应在冰上置于氩气下进行3h。混合物在真空下浓缩到50ml，然后加入100ml CH2Cl2。过滤后得到的沉淀物用乙醚洗涤，在真空下干燥，得到1.3g白色粉末状的产物78。
Biot7-EG3-腙化合物79在回流下将化合物78(300mg，0.09mmol)溶于10ml无水乙醇中。加入一水合肼(20ml，0.40mmol)，反应在回流下进行3小时。冷却后沉淀形成，将沉淀过滤，用乙醚洗涤并在真空下干燥。由此得到109mg(36％)白色粉末状的产物79。
Biot7-EG3-PMDAM化合物80将腙79(100mg，0.03mmol)在70℃溶于5ml的无水DMF中。混合液降到室温后加入MnO2(31mg，0.36mmol)。反应进行10min，用含有硅藻土(0.5cm)和粉末状分子筛(0.5cm)的烧结玻璃过滤去除氧化镁。滤液蒸发干燥，用乙醚洗涤并在真空下干燥。由此得到78mg(78％)产物80。
树状聚体是一种树枝状分子，在末端具有几种活性基团如胺，羧基，羟基等(综述参见Newcome等，(1996)《树状分子原理、合成、展望》(Dendritic Molecules；Concept，Syntheses，Perspectives).VCH Ed.，Weinheim，Germany)。这些分子的合成现在很容易控制，许多树状聚体已由化学制造企业推上了市场。选择PAMAM(sigma-Aldrich)是基于其稳定性、溶解性和柔韧性，因为在市场上有好几种具有不同末端数目和类型的这类分子。通过“PAMAM第一代”可以在每个叠氮甲基基团上添加7种标记物的分子(以一个合成步骤)。
实施例35用间-BioPMDAM以两步标记和片段化DNA扩增子DNA扩增子是按照实施例5.1描述的方法制备的。两种标记反应方法如下。
a.标记和片段化以两步进行将10μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在95℃温育10min，然后加入3μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育10min。
b.标记和片段化以一步进行将10μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1 M的HCl和75μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在60℃温育30min。其余方法与实施例17相同。
结果
表25以两个不同的步骤和以一个步骤进行标记和片段化的比较研究如表25所示，用一个步骤的方案所得到的结果是令人满意的，而分两步进行标记和片段化效果更好。这个实施例说明，标记和裂解步骤可以分开以便根据所用的靶位提高标记效率。
实施例36在不同的反应体系中进行DNA扩增子的标记和片段化DNA扩增子是按照实施例5.1描述的方法制备的。三种标记反应方法如下。
a.在250μl反应体系中标记和片段化将75μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和102.5μl无DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR产物中。溶液在95℃温育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育5min。
b.在200μl反应体系中标记和片段化将75μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和52.5μl无DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR产物中。溶液在95℃温育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育5min。
c.在150μl反应体系中标记和片段化将75μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和2.5μl无DNA酶/RNA酶的水加入到50μl PCR产物中。溶液在95℃温育25min，然后加入22.5μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育5min。
其余试验方法与实施例17相同。
结果
表26按照不同的反应体系标记和片段化从信号和同源性百分数来看，所有方案得到的结果都是很满意的。而且尽管反应体系从150μl变化到250μl，所得到的结果是相似的。本实施例说明标记方案的反应体系具灵活性，可以接受不同体积的体系，尤其是不同体积的扩增产物。
实施例37采用片段化前进行纯化的方案和采用片段化后进行纯化的方案的比较DNA扩增子是按照实施例5.1描述的方法制备的。两种标记反应方法如下。
a.标记、纯化，然后片段化DNA扩增子将10μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和80μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在95℃温育10min。纯化按照实施例17描述的方法进行。在纯化后标记的扩增子溶液中加入6μl 0.1M HCl，溶液于95℃温育10min。加入400μl在95℃预热10min的杂交缓冲液。杂交缓冲液的组成和其余的方案与实施例17相同。
b.标记、片段化，然后纯化DNA扩增子将10μl间-BioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)和77μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在95℃温育10min。然后加入3μl 0.1M HCl，溶液再于95℃温育10min。其余的方案与实施例17相同。
结果
表27采用片段化前进行纯化的方案和采用片段化后进行纯化的方案的比较表27中所显示的结果说明，纯化步骤可以在标记和片段化步骤之间进行。而且在标记和片段化步骤之间进行纯化可以使在裂解期间进行变性以及将所有标记的扩增子片段杂交到芯片上成为可能。
实施例382-硝基-对-BioPDAM的合成合成流程 醛基的保护将5g(25.5mmol)2，4-二硝基苯乙醛溶于250ml甲苯中，加入20ml乙二醇和150mg对-甲苯磺酸。混合液在回流下加热，水在Dean-Stark系统中回收6h。混合物用150ml EtOAc和100ml水处理。溶液用乙酸乙酯抽提两次，有机相用MgSO4干燥，然后蒸发。得到产物100相应的油性物，用于下一步的反应。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ＝8.70(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；8.44(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；8.02(d，1Haro，J＝8Hz，H6)；6.49(s，1H，CH)；4.12-4.06(m，4H，CH2-CH2)。
二硝基衍生物100的还原保护的2，4-二氮硝基苯乙醛(6.4g；25.5mmol)溶于乙醇-水混合液(6/1)中，然后加入二倍当量的无水Na2S(12.3g；51.1mmol)。反应混合物加热30min。蒸发，然后用二氯甲烷抽提。干燥并过滤后将反应介质蒸发以获得油性物，产物在硅柱上直接纯化(环己烷/乙酸乙酯60/40)。得到化合物101，产率为45％化合物101熔点58-60℃.1H NMR(200MHz，CDCl3)7.49(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.09(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.80(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；6.27(s，1H，CH)；3.99-3.97(m，4H，CH2-CH2)。
与生物素偶合将D-生物素(1.0g；4.1mmol)溶于20ml无水DMF和600μl N-甲基吗啉中。在氩气下加入异丁基氯甲酸酯(700μl；5.5mmol)，同时在冰浴上冷却。混合物持续搅拌5min，然后加入1g(4.75mmol)化合物101和500μl N-甲基吗啉。溶液在室温持续搅拌4h，然后蒸发至干。得到的油性物直接通过硅柱，洗脱溶剂为MeOH-DCM7％，然后是MeOH-DCM10％。得到产物102(1.1g；2.52mmol)，产率为62％。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.40(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.68(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；6.43(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.36(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.23(s，1H，CH)；4.28(m，1H，CH2-CH-NH)；4.14(m，1H，CH-CH-NH)；3.92(s，4H，CH2-CH2)；3.12(m，1H，CH-S)；2.85和2.76(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
乙缩醛的去保护将产物102(768mg；1.76nnnol)悬浮于25ml THF中。加入4ml的2N H2SO4后全部溶解。混合物持续搅拌2h。蒸发后在烧结玻璃用水漂洗和洗涤。得到黄色粉末状的化合物103(694mg)，产率为90％。
熔点165℃.1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.69(s，1H，NH-CO)；10.09(s，H，CHO)；8.43(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.91(s，2Haro，H5和H6)；6.42(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.35(宽s，1H，NH-CO-NH)；δ＝6.23(s，1H，CH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系统.2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
腙104的形成将醛103悬浮于乙醇中，悬液加热到80℃。加入肼时全部溶解，溶液立刻变成橙色。5min后沉淀形成。混合物边搅拌边加热1h。在烧结玻璃上过滤后将沉淀物干燥。得到产物104(700mg；690mmol)，产率为98％。
熔点169℃.1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝10.31(s，1H，NH-CO)；8.31(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.96(s，H，CHO)；7.87(d，1Haro，J＝2Hz，H6)；7.68(dd，1Haro，J＝2Hz，J＝6Hz，H5)；7.31(s，2H，NH2)；6.42(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.34(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系统，2H，2JAB＝5Hz，3JAX＝12Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
叠氮105的形成将化合物104(200mg；0.492mmol)溶于8ml DMF中。加入400mg MnO2。混合物剧烈搅拌10min。在含有硅藻土(厚度2cm)和粉末状分子筛3(0.5cm)的微孔上过滤。蒸发至干后用乙醚洗涤。混和物再于微孔上过滤。得到橙色粉末状化合物105(180mg；0.445mmol)，产率为98％。
熔点155℃.1H NMR(200 MHz，DMSO-d6)δ＝10.21(s，1H，NH-CO)；8.60(d，1Haro，J＝2Hz，H3)；7.77(d，1Harro，J＝6Hz，H5)；7.22(d，1Haro，J＝6Hz，H6)；6.60(s，H，CH-N)；6.41(宽s，1H，NH-CO-NH)；6.33(宽s，1H，NH-CO-NH)；4.29(m，1H，CH2-CH-NH)；4.13(m，1H，CH-CH-NH)；3.12(m，1H，CH-S)；2.84和2.78(ABX系统，2H，2JAB＝5 Hz，3JAX＝12 Hz，3JBX＝0Hz，CH2-S)；2.29(t，2H，J＝8Hz，CH2-CO)；1.61-1.39(m，6H，(CH2)3)。
化合物105的反应性用尿嘧啶3’-单磷酸测试，用毛细管电泳监测。分析条件与实施例6.1相同。结果显示化合物的半衰期是45分钟。试剂在-20℃的稳定性大于1个月。
实施例39用2-硝基-对-BioPDAM衍生物标记RNA按照实施例38所描述的方法制备2-硝基-对-BioPDAM衍生物。按照实施例5.2描述的方法得到RNA转录物。标记和片段化方法是在表28所述的条件下用2-硝基-对-BioPDAM试剂以一个步骤进行。两种标记反应如下a.用2-硝基-对-BioPDAM试剂标记将2μl 2-硝基-对-BioPDAM(100mM，溶于DMSO中)、3μl咪唑(1M，溶于水)、5μl MnCl2和85μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl转录物中。溶液在60℃温育30min。
其余方案与实施例8相同。
b.用间-bioPMDAM试剂标记将2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、3μl咪唑(1M，溶于水中)、5μl MnCl2和85μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl转录物中。溶液在60℃温育30min。
其余方案与实施例8相同。
结果
表28用2-硝基-对-BioPDAM衍生物和间-bioPMDAM衍生物标记RNA的比较研究从表28可见，2-硝基-对-BioPDAM衍生物对RNA有良好的标记效果。可用例如硝基的取代基来调节带有重氮甲基官能团的标记的反应性和稳定性。
实施例40用标记试剂2-硝基-对-BioPDAM标记和片段化DNA扩增子按照实施例38所描述的反应流程得到2-硝基-对-BioPDAM衍生物。按照实施例5.1描述的方法用PCR扩增制备DNA扩增子。两种标记反应如下a.用2-硝基-对-BioPDAM试剂标记将2μl 2-硝基-对-BioPDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1M HCl和83μl无DNA酶/RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在60℃温育30min。
b.用间-bioPMDAM试剂标记将2μl间-bioPMDAM(100mM，溶于DMSO中)、5μl 0.1M HCl和83μl无DNA酶和RNA酶的水加入到10μl PCR产物中。溶液在60℃温育30min。
其余方案与实施例17相同。
结果
表29用2-硝基-对-BioPDAM衍生物和间-bioPMDAM衍生物标记DNA的比较研究从标记强度和同源性百分数来看，用2-硝基-对-BioPDAM试剂标记DNA是有利的。
实施例41在叠氮甲基功能基团和苯核之间插入双键，使DAM远离，以及特别适用合于这种远离的分子的合成本实施例的目的在于使芳香族结构的叠氮甲基(DAM)功能基团远离以便在磷酸的烷基化时以及标记核酸与其互补序列杂交时最大限度地减少位阻效应。
合成流程 为了3-羟基丁醛反应以形成(对-甲氧羰基)苯乙烯基甲基酮89，用乙酰乙酸乙酯提高亚甲基质子的酸性，从而促进甲酰基的攻击，随后消除H2O(通过双键与芳香环的结合而促进)，以及由于碱性介质而水解去羧基化。本合成的其他步骤与其他实施例相似。
终产物对-Bio-EG3-SMDAM 90在叠氮甲基核芳香环之间多了两个碳原子，这就限制了可能的位阻问题，通过与芳香系统连接从而保持叠氮甲基的稳定性。
实施例42携带叠氮基团的固相支持体上核酸的捕获与检测研究了携带叠氮甲基基团的树脂的反应性来确定其与核酸结合的能力。
4-(重氮甲基)苯氧基甲基聚苯乙烯(参考上当17338，Fluka)是一种树脂，已有文献描述了它和羧基，尤其是蛋白质上的羧基结合的能力(G.Bhalay，A.R.Dunstan.Tetrahedron Lett.39，7803，1998)，但是没有描述其与DNA分子结合的能力。我们检测了用这种试剂捕获核酸的能力，通过比色试验来观察。
本实验是用HLA-DR寡-检测试剂盒(oligo-detection kit)(参考目录33202，bioMerieux，France，基本原理见专利EP 549 776-B1描述)中的一部分试剂进行的，该试剂盒可以检测在微孔板上通过PCR扩增的核酸，用比色方法读取数据。根据所描述的实验，通过PCR产生的核酸同时与检测的树脂和对-Bio-EG3-PDAM分子反应，对-Bio-EG3-PDAM的合成在实施例20中已提及。如果DNA与两个化合物上的叠氮甲基功能基团反应，经过洗涤和去除未共价结合的分子以后，用包括与链霉抗生物素蛋白结合的酶的比色反应就可以观察到结果。链霉抗生物素蛋白与辣根过氧化物酶结合，可以将邻苯二胺分子(试剂盒的Color 1试剂)分解成可在492nm波长处被检测到的化合物。
实施例42.1DNA的捕获与检测将50μl按照实施例5.1描述的方法扩增的PCR产物加到400μl纯水(Sigma)和5μl对-Bio-EG3-PDAM混合物中，然后加入10mg树脂，在60℃温育30min。然后用500μl PBS Tween缓冲液(试剂盒的Color 0 HLA试剂，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗涤。然后将树脂重悬于100μl PBS Tween和250μl添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(S-911，MOLECULAR PROBES，EUGENE，OR，USA)的链霉抗生物素蛋白杂交缓冲液(PBS pH7.0 0.5％ TWEEN)中。反应混合物在室温温育30min。然后用500μl PBS Tween缓冲液洗涤树脂三次，在显色试剂(1 Color 1片，邻-苯二胺盐酸，稀释在5ml Color 2缓冲液中，100mM磷酸钠，50mM柠檬酸，0.03％ H2O2)存在的情况下于室温温育。在暗处温育20min后，用50μl H2SO4(1.8N Color 3试剂)终止反应。上清液用移液管吸出放到微孔板中，读取反应介质在492nm处的吸光度。
实施例42.2无核酸对照将10mg树脂加入到添加5μl对-Bio-EG3-PDAM的425μl纯水(Sigma)中，60℃温育30min。然后用500μl PBS缓冲液洗涤树脂。样品的处理方式与实施例42.1描述的方法相同。
实施例42.3与无靶进行的PCR对照10mg树脂在添加5μl对-Bio-EG3-PDAM和50μl PCR产物的400μl纯水中，60℃温育30min，PCR用25μl体积的纯水代替基因组DNA的体积进行。然后用500μl PBS缓冲液洗涤树脂。样品的处理方式与实施例42.1描述的方法相同。
实施例42.4与无显色分子的PCR对照
10mg树脂加入到含有50μl PCR产物的400μl纯水中，60℃温育30min。然后用500μl PBS Tween缓冲液洗涤树脂。样品的处理方式与实施例42.1描述的方法相同。
实施例42.5与非捕获的核酸对照将10mg树脂加入到添加5μl对-Bio-EG3-PDAM的400μl纯水中，60℃温育30min。然后用500μl PBS Tween缓冲液(试剂盒的Color 0 HLA试剂，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗涤树脂。然后将树脂悬浮于100μl PBSTween和250μl添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP的链霉抗生物素蛋白杂交缓冲液中。加入50μl按如下方法制备的DNA制剂。
将5μl对-Bio-EG3-PDAM和70μl纯水加入到25μl按照实施例5.1描述的方法通过PCR制备的DNA中。混合液在60℃温育30min，然后用QIAquick柱(NucleotideRemoval Kit，Qiagen，Hilden，Germany)按照厂商提供的方案去除多余的标记物，最后洗脱体积为50μl。
反应混合物在室温温育30min，然后按照实施例42.1描述的方法处理。
结果
表30携带叠氮甲基基团的树脂的反应性研究在表30中，高比色值说明了在反应介质中有高浓度的酶，相应的就会大量存在携带生物素衍生物的核酸。对照组说明信号不是由于DNA非特异吸附到小珠上，不是与树脂上的-Bio-EG3-PDAM反应，也不是与树脂上的链霉抗生物素蛋白HRP吸附，而是由于存在被共价捕获并用对-Bio-EG3-PDAM标记的DNA。
实施例43标记PCR产物以使其被捕获和在微孔板上检测本实施例所要证实的是仅用一种类型的携带叠氮甲基功能基团的分子就可能标记DNA分子，从而以一步在微孔板上捕获和检测这种核酸分子。
本试验用HLA-DR寡-检测试剂盒(参考目录33202，bioMérieux)中的一部分试剂进行，用比色读数检测微孔板上通过PCR扩增的核酸。根据所描述的试验，对-Bio-EG3-PDAM与通过PCR产生的核酸反应，对-Bio-EG3-PDAM的合成在实施例28中已经有描述。DNA与分子的叠氮甲基反应，因此在其磷酸基团上被嫁接上生物素。有可能通过在微孔板上温育来捕获核酸，微孔板上吸附有链霉抗生物素蛋白分子，然后通过比色反应观察。所用的检测试剂也是链霉抗生物素蛋白分子，它可以与辣根过氧化物酶(HRP)结合。在使用的条件下，过氧化物酶可以将邻苯二胺分子(试剂盒的Color 1试剂)分解成可在492nm波长处被检测到的化合物。
实施例43.1在微孔板上捕获和检测来源于PCR反应的DNA将10μl用PCR扩增得到的DNA加入到添加10μl对-Bio-EG3-PDAM的80μl纯水(Sigma)中，60℃温育30min。标记后，DNA用QIAquick柱(Nucleotide RemovalKit，Qiagen，Hilden，Germany)按照厂商推荐的方法纯化，将最终洗脱物溶于0μlEB缓冲液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。将20μl这种洗脱液稀释到180μl添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(S-911，Molecular Probes，Eugene，OR，USA)的PEG缓冲液(0.1M NaPO3；0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14mg/ml鲑精DNA(Gibco)；2％ PEG 4000)中。在链霉抗生物素蛋白包被的Combiplate 8(参考目录95029263，Labsystem，Helsinki，Finland)的孔中或Maxisorb条带(Maxisorbstrip)(Nunc，Denmark)的对照孔中加入100μl上述制备，37℃温育1小时。
实施例43.2对照组的制备对照样品同时按照下列方式制备A.无DNA的标记对照将添加10μl对-Bio-EG3-PDAM的90μl纯水(Sigma)在60℃温育30min。然后反应混合物按照实施例43.1所述的相似方法处理。
B.无标记物的标记对照将10μl按照实施例5.1描述的方法通过PCR扩增得到的DNA加入到90μl纯水中，60℃温育30min。然后将反应混合物按照实施例34.1描述的相似方法处理。然后将所有的条带用100μl PBS Tween缓冲液(试剂盒的Color 0 HLA试剂，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)洗涤三次，加入100μl显色试剂(1 Color 1片，邻苯二胺盐酸，稀释到5ml Color 2缓冲液中，100mM磷酸钠，50mM柠檬酸，0.03％ H2O2)，在暗处温育20min就显示链霉抗生物素蛋白HRP的存在，然后用50μl H2SO2(1.8N Color 3试剂)终止反应。然后测量反应介质在492nm处的吸光度。
结果
表31用对-Bio-EGB-PDAM捕获的标记DNA的检测表31中的结果表明，用对-Bio-EG3-PDAM标记的DNA在微孔板上通过一步就可以捕获和检测。如对照组所提示的，对照组的信号只是由于DNA而产生的，不是由核酸对微孔板壁的非特异吸附产生的，也不是来自于核酸与链霉抗生物素蛋白的非特异结合，或者链霉抗生物素蛋白HRP与非标记DNA或微孔板塑料的非特异反应。
实施例44双标记PCR产物以使其在微孔板类的固相支持物上捕获和检测本实施例所描述的是用两种携带叠氮甲基官能团的分子在一个步骤中标记DNA分子，以便于其在微孔板上捕获和检测。
试验所用的一部分试剂来自于HLA-DR寡-检测试剂盒，通过简单的比色读数来检测微孔板上由PCR扩增的核酸。在上下文所描述的试验中1-芘基重氮甲烷(PDAM)和对-Bio-EG3-PDAM同时与PCR产生的核酸反应。
如果DNA与两个化合物的叠氮甲基官能团反应，DNA就能结合到携带抗-芘抗体的支持物上，就有可用一种与辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白分子来显示它。该酶作为一种显色剂可以将邻-苯二胺分子分解成可在492nm波长处被检测的化合物。
实施例44.1DNA的双标记和在微孔板上检测将抗芘抗体吸附到8-孔Maxisorp条带上，室温下温育过夜。每孔加入100μl溶液，该溶液是将1.1μl抗芘抗体稀释到100μl碳酸氢盐缓冲液(0.05M pH9.6)中。这种所谓的兔抗芘抗体(参考目录YSRT-AHP236)可以从Accurate Chemical &Scientific(Westbury，New York，USA)购买到。当然也可以用市场上可买到的抗体来进行本试验，与本实施例所得到的结果相比没有分歧的结果。
将按照实施例5.1描述的方法通过PCR扩增得到的10μl DNA加入到40μl纯水(Sigma)、10μl对-Bio-EG3-PDAM、2μl PDAM(P-1405，1-芘基重氮甲烷，MolecularProbes，Eugene，OR，USA)和38μl DMSO中，60℃温育30min进行标记。
标记后，DNA用QIAquick试剂盒(QIAGEN)纯化，最后的洗脱物溶于50μl EB缓冲液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。将20μl此洗脱物稀释到添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP(S-911，MOLECULAR PROBES，EUGENE，OR，USA)的180μl PEG缓冲液(0.1M NaPO3；0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14mg/ml鲑精DNA(Gibco)；2％ PEG 4000)中。然后将100μl此制备液加入到吸附的Maxisorp条带孔或非吸附对照孔中，37℃温育1h。
实施例44.2对照组的制备对照样品同时按照下列方式制备A.单独用对-Bio-EG3-PDAM标记的对照将按照实施例5.1描述的方法通过PCR扩增得到的10μl DNA加入到添加10μl对-Bio-EG3-PDAM的90μl纯水中，60℃温育30min进行标记。标记完成后，DNA用QIAquick试剂盒纯化，最后的洗脱物溶于50μl EB缓冲液中。将20μl此洗脱物稀释到添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG缓冲液中。然后将100μl此制备液加入到吸附的Maxisorp条带孔或非吸附对照孔中，37℃温育1h。
B.单独用PDAM标记的对照将按照实施例5.1描述的方法通过PCR扩增得到的10μl DNA加入到添加2μl PDAM和38μl DMSO的90μl纯水中，60℃温育30min进行标记。标记后，DNA用QIAquick试剂盒纯化，最后的洗脱物溶于50μl EB缓冲液中。将20μl此洗脱物稀释到添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG缓冲液中。然后将100μl此制备液加入到吸附的Maxisorp条带孔或非吸附对照孔中，37℃温育1h。
C.无标记对照将按照实施例5.1描述的方法通过PCR拉增得到的10μl DNA加入到100μl纯水中，60℃温育30min进行标记。标记后，DNA用QIAquick试剂盒纯化，最后的洗脱物溶于50μl EB缓冲液中。将20μl此洗脱物稀释到添加以1/10000稀释的链霉抗生物素蛋白HRP的180μl PEG缓冲液中。然后将100μl此制备液加入到吸附的Maxisorp条带孔或非吸附对照孔中，37℃温育1h。
所述条带用100μl PBS Tween缓冲液(Color 0)洗涤三次，然后通过加入100μl显色试剂(Color 2)在暗处温育20min就显示链霉抗生物素蛋白HRP的存在，用50μlH2SO2(Color 3)终止反应。然后测量反应介质在492nm处的吸光度。
结果
表32用PDAM和对-Bio-EG3-PDAM双标记DNA
表32的结果清楚地表明大信号来自于被孔壁中抗芘抗体捕获的及同时被连接的链霉抗生物素蛋白HRP标记的DNA。如对照组中没有信号所示，这种对标记的DNA特异的检测不是由于DNA的非特异性吸附或链霉抗生物素蛋白HRP与塑料的非特异吸附，或酶与捕获的DNA的非特异结合。因此本实施例说明在一个步骤中进行双标记DNA是可能的，这种双标记用于同时捕获和检测DNA也是可能的。
实施例45标记PCR产物的同时用互补核酸探针捕获和标记本实施例在于证明采用与DNA上的磷酸基团反应的叠氮甲基官能团特异性地检测DNA是可能的，所述DNA被捕获在固相表面上。
本试验用HLA-DR寡-检测试剂盒(参考目录33202，bioMérieux，France)的一部分试剂进行，用比色读数检测微孔板上通过PCR扩增的核酸。在上下文描述的试验中，对-Bio-EG3-PDAM与通过PCR产生的核酸反应。DNA与分子的叠氮甲基官能团反应，因此在其磷酸基团上被嫁接上生物素。因而有可能通过在微孔板上温育来捕获核酸，微孔板上吸附有链霉抗生物素蛋白分子，然后用一个含有与捕获序列互补的寡核苷酸的探针来显示DNA，该探针与辣根过氧化物酶结合，该酶可以将邻苯二胺分子(试剂盒的Color 1试剂)分解成可在492nm波长处被检测到的化合物。
实施例45.1在微孔板上捕获和特异性检测DNA将用PCR扩增得到的10μl DNA与20μl对-Bio-EG3-PDAM在60℃温育30min以双份进行标记。标记后，DNA用QIAquick柱(Nucleotide Removal试剂盒，Qiagen，Hilden，Germany)按照厂商推荐的方法纯化，将最终洗脱物溶于50μl EB缓冲液(10mM Tris EDTA，pH8.5)中。将85μl这种洗脱液用8.5μl试剂R4(2N NaOH)在室温下变性培养5min，然后溶液用8.5μl试剂R5(2N乙酸)中和。混合物中加入850μl杂交缓冲液(R6-10mM Tris-HCl，pH7.0，0.2g/l BND，0.01g/l Ciproflaxacin)和85μl检测寡核苷酸(R7-4mM磷酸钠，1mM磷酸钾，pH7.0，0.1％牛血清白蛋白，0.5％酚)。将100μl上述制备液置于试剂盒提供的Strip R1的阳性对照孔(被扩增基因的共有序列捕获)上，或链霉抗生物素蛋白包被的Combiplate 8平板(参考目录95029263，Labsystem，Helsinki，Finland)的孔上，或者对照Maxisorb平板(Nunc，Denmark)的孔上。
平行试验中，同样的杂交反应是用EB缓冲液10倍和100稀释DNA制备液以测试该技术的灵敏度。
实施例45.2对照组的制备对照样品同时按照下列方式制备
A.比较HLA-DR试剂盒将按照实施例5.1描述的方法用PCR扩增得到的10μl DNA与20μl对-Bio-EG3-PDAM在60℃温育30min。标记后，DNA用QIAquick柱纯化，将最终洗脱物溶于50μl EB缓冲液中。将45μl洗脱液用4.5μl试剂R4在室温下变性5min，然后溶液用4.5μl试剂R5中和。混合物中加入450μl杂交缓冲液R6和45μl检测寡核苷酸。将100μl上述制备液置于试剂盒提供的Strip R1的阳性对照孔(与扩增基因的共有序列杂交)上，或链霉抗生物素蛋白Combiplate 8平板上，或者对照Maxisorb平板上。
B.存不与特异性探针杂交的DN上讲行杂交将按照实施例5.1描述的方法用PCR扩增得到的10μl DNA与20μl对-Bio-EG3-PDAM在60℃温育30min。样品的其他处理方法与上面实施例A描述的步骤相同。
C.无DNA对照将10μl试剂R6(杂交缓冲液)和100μl试剂R7(检测寡核苷酸)置于试剂盒提供的Strip R1的阳性对照孔上，或链霉抗生物素蛋白平板上，或者Maxisorb对照平板上。
将上述试验中所有条带在37℃温育1h 30min，然后用100μl PBS Tween缓冲液(试剂盒的Color 0 HLA试剂)洗涤三次，加入100μl显色试剂(Color 2试剂，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)在暗处温育20min显示特异性检测探针的存在，然后用50μl H2SO2(1.8N Color 3试剂)终止反应。然后测量反应介质在492nm处的吸光度。
结果
NA＝没有表33在微孔板上特异性检测PCR得到的DNA
表33的结果显示靶的极好的扩增有可能使其用于诊断。本实施例说明在磷酸基团上的标记可以使DNA被捕获且不会阻碍其特异性杂交。
实施例46细菌裂解物来源的DNA的捕获和扩增以及用对-Bio-EG3-PDAM标记本实施例说明用基于叠氮甲基官能团对核酸上磷酸基的反应性的捕获有可能捕获的扩增细菌DNA。
在本实施例中，细菌裂解物中含有的核酸用对-Bio-EG3-PDAM标记，然后被捕获到链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。利用磁珠可以通过磁性使核酸固定，以便在连续洗涤过程中除去反应介质中存在的细胞残留物，去除这些残留物是必需的，因为它们可抑制随后进行的PCR扩增。
扩增产物可以通过DNA芯片分析。
细菌DNA是通过裂解结核分枝杆菌培养物中的细胞获得的。裂解是用机械裂解进行的。准确的说是用超声法进行的，所处理的液体样品中含有玻璃珠。这种方法中关于磁珠的部分已由专利申请WO-A-99/15621的申请人描述，超声法在专利申请WO-A-00/60049中也有描述。超声法也可用液体浴进行。
但是本领域的普通技术人员所熟知的其他方法也可使用，如专利US-A-5,902,746以及专利申请WO-A-98/54306和WO-A-00/05338所描述的方法。所有这些方法的工业产权都属于专利申请人。
细菌DNA的定量用Picogreen(P-7589；Molecular Probes.Eugene，OR，USA)按照厂商提供的说明书进行，浓度为107拷贝/μl。
将10μl裂解物与20μl对-Bio-EG3-PDAM混和，在60℃温育30min。作为平行对照，将10μl裂解物加入到20μl纯水(Sigma)中在相同条件下温育。
然后用QIAquick柱(Nucleotide Removal Kit，Qiagen，Hilden，Germany)纯化反应介质。纯化方法是厂商推荐的。最终的洗脱物体积为50μl。
然后将标记的DNA片段捕获到Dynal磁珠(Dynabeads M-280链霉抗生物素蛋白；参考目录112.05；Dynal Biotech ASA，Oslo，Norway)上，其制备方法如下90μl Dynal珠用200μl纯水(Sigma)洗涤两次，然后收集到200μl PEG缓冲液(0.1M NaPO4，pH7，0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14ml鲱精DNA(参考目录15634-017，GibcoBRL)；2％ PEG 4000)，在37℃温育30min。然后用200μl含0.5％Tween的1×PBS缓冲液洗涤两次，最后收集到90μl相同缓冲液中。
10μl标记或未标记的DNA洗脱物与40μl PEG缓冲液和2.5μl如上所述制备的磁珠在室温温育5min。
然后用200μl含0.5％ Tween的1×PBS缓冲液洗涤磁珠三次，收集到200μl水中，60℃温育20min，然后再用200μl PBS Tween洗涤四次。最后将磁珠收集到25μl水中，按照实施例5.1描述的方法进行PCR。进行两个反应对照，一个是25μl纯水，另一个是2.5μl制备的磁珠，在与生物样品相同的条件下洗涤，收集到25μl水中。
结果PCR产物用Picogreen(P-7589；Molecular Probes，Eugene，OR，USA)按照厂商所提供的说明书定量。该方法基于所用的分子(Picogreen)只有在定位到DNA分子内部(嵌入到两个碱基之间)时才能变成荧光的特征。由于这种嵌入具有很高的特异性，并且因为所产生的荧光信号与介质中存在的DNA量成正比，因此可以用这种方式很精确地分析样品中存在的DNA浓度。检测到的信号用rfu(相对荧光单位)表示。
凝胶分析PCR的结果显示，在用对-Bio-EG3-PDAM标记的基因组DNA制备的样品中，在凝胶的预期位置上出现一条单一的特异性条带。当用非标记基因组DNA进行PCR时就检测不到该条带。用Picogreen进行DNA定量有可能确定从捕获在磁珠上的基团组DNA中生产的DNA。
表34从细菌裂解物中通过PCR产生的DNA的定量以及通过对-Bio-EG3-PDAM的捕获和纯化按照实施例8描述的方法在DNA芯片上分析有可能确定下面表35中所示的扩增的特异性。
表35用对-Bio-EG3-PDAM捕获和纯化的靶的特异性检测本实施例说明制备生物样品以扩增其所含有的核酸是可能的，所用的捕获技术是基于叠氮甲基官能团对磷酸基团的反应性。
实施例47连续扩增两个来源于捕获在固相支持物上的细菌DNA的基因本实施例说明利用叠氮甲基官能团对磷酸基团的反应性对捕获的不同的靶DNA扩增几次是可能的。
在本实施例中，细菌裂解物中含有的核酸用对-Bio-EG3-PDAM标记，然后被捕获到链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。利用磁珠可以通过磁性使核酸固定，以便在连续洗涤过程中除去反应介质中存在的细胞残留物，去除这些残留物是必需的，因为它们可抑制随后进行的PCR扩增。这些扩增发生在基因组DNA中存在的两个不同的基因上，分别命名为16S和rpoB。采用与DNA芯片分析这两个基因。
按照实施例46所描述的方法通过裂解结核分枝杆菌培养物中的细胞获得细菌DNA。细菌DNA的定量用Picogreen按照厂商提供的说明书进行，浓度为107拷贝/1μl。
将10μl裂解物与20μl对-Bio-EG3-PDAM混和，在60℃温育30min。作为平行对照，将10μl裂解物加入到20μl纯水(Sigma)中在相同条件下温育。
然后用QIAquick柱(Nucleotide Removal Kit，Qiagen，Hilden，Germany)纯化反应介质。纯化方法是厂商推荐的。最终的洗脱物体积为50μl。
然后将标记的DNA片段捕获到Dynal磁珠上，其制备方法如下90μl Dynal珠用200μl纯水(Sigma)洗涤两次，然后收集到200μl PEG缓冲液(0.1M NaPO4，pH7，0.5M NaCl；0.65％ Tween 20；0.14ml鲑精DNA(GibcoBRL)；2％ PEG 4000)，在37℃温育30min。然后用200μl含0.5％ Tween 20的1×PBS缓冲液洗涤两次，最后收集到90μl相同缓冲液中。
10μl标记或未标记的DNA洗脱物与40μl PEG缓冲液和2.5μl如上所述制备的磁珠在室温下温育5min。
然后用200μl含0.5％ Tween的1×PBS缓冲液洗涤磁珠三次，然后收集到200μl水中，60℃温育20min，然后再用200μl PBS Tween洗涤四次。最后将磁珠收集到25μl水中，按照实施例5.1描述的方法进行PCR。进行两个反应对照，一个是25μl纯水(Sigma)，另一个是2.5μl制备的磁珠，在与生物样品相同的条件下洗涤，收集到25μl水中。
扩增以后，收集反应介质，将磁珠分离，用150μl含0.5 Tween的1×PBS洗涤，然后重悬于25μl纯水(Sigma)中。另外一个扩增是在磁珠上进行的，但在有引物的情况下用于扩增rpoB基因。
对照组的扩增是用非捕获的基因组DNA，与两个扩增系统(rpo和16S)平行进行。结果所得到的PCR产物用DNA芯片按照实施例8描述的方法分析。
表36DNA芯片分析经过连续PCR扩增或不连续扩增得到的DNA扩增子凝胶分析PCR的结果显示，在用-Bio-EG3-PDAM标记的基因组DNA制备的样品中，在凝胶的预期位置上出现一条单一的特异性条带。在用非标记基因组DNA进行PCR时就检测不到该条带。
如上面表36所显示的用DNA芯片进行分析可能确定两次连续扩增的特异性，因而能够从固定在固相支持物上的DNA中连续扩增几个基因，从而有可能避免开发多重系统(multiplex systems)，这种系统常常会降低核酸扩增的敏感性和效率。
实施例48在携带叠氮甲基基团的尼龙膜上捕获和扩增DNA将尼龙膜活化以使其携带叠氮甲基基团，用于捕获细菌DNA，目的是通过PCR扩增DNA。
实施例48.1Biodyne C滤膜的修饰合成流程
化合物68将3’-氨基苯乙酮(14.5g，107mmol)溶于50ml无水DMF中。加入琥珀酐(10.7g，107mmol)，混合物在室温氩气下续搅拌。6h后溶液在真空下缩，然后加入50ml甲醇。过滤后得到的沉淀物用甲醇和乙醚洗涤。由此19.4g(81％)在色粉末状产物68。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝2.5-2.6(m，7H)；7.45(t，1H)；7.64(d，1H)；7.83(d，1H)；8.19(s，1H)；10.16(s，1H)；12.12(s，1H)。
化合物69将5.07g(22 mmol)化合物68在氩气下溶于10ml无水DMF中。溶液置于冰上，然后加入5.00g(32mmol)羰基二咪唑。20分钟后缓慢加入20ml(94.6mmol)4，7，10-三噁十三烷二胺(EG3)。在室温下反应3h后蒸发DMF，残留物收集到100ml CH2Cl2中。用饱和NaHCO3和H2O提取，然后用无水Na2SO4干燥有机相，蒸发溶剂。由此得到4.34g(46％)产物69。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ＝1.59(m，2H)；1.87(m，2H)；2.16(s，3H)；2.40(m，2H)；2.55(m，2H)；3.08(m，2H)；3.45(m，16H)；7.30(t，1H)；7.42(d，1H)；7.70(d，1H)；7.83(t，1H)；7.97(s，1H)；10.00(s，1H)。
化合物91在一张Biodyne C滤膜(参考目录60314；Pall Gelman Laboratory；Ann Arbor；Michigan；USA)上剪出一个4cm2的矩形，放入一个瓶子中，使之与3ml含有0.97g(6mmol)羰基二咪唑(CDI)的无水DMF接触，瓶子置于冰上，氩气下剧烈搅拌。20min后将溶液去掉，滤膜用DMF洗涤。然后加入3ml含0.53g产物68(1mmol)的无水DMF，在室温下反应过夜。然后去掉溶液，滤膜用乙醇漂洗，在真空下干燥并在氩气下保存。
化合物92将修饰的滤膜91置于97ml一水合肼(2mmol)和4ml无水乙醇的溶液中。溶液回流5h。溶液冷却后用水、乙醇和乙醚洗涤滤膜，真空下干燥然后置于氩气下。然后加入4ml无水DMF和86mg MnO2(1mmol)，混合物剧烈搅拌使之反应。20min后将溶液弃掉，滤膜用DMF和乙醚漂洗。叠氮甲基修饰的滤膜92于氩气下贮存于-19到-31℃。
实施例48.2生物学试验将活化的膜剪成2mm2的小片，与25μl结核分枝杆菌裂解物和375μl纯水(Sigma)一起在室温下培养30min，所用的细菌裂解物是通过机械裂解制备的，其方法和最终浓度与实施例46相同。
然后将膜置于100ml洗涤缓冲液(5％甲酰胺(Sigma)，1×SSPE(Perbio)，0.01％Triton X-100)中在65℃温育60min以去除吸附到膜上的非特异性核酸，然后在扩增前将膜储存在1ml纯水中。
按照实施例5.1.1所描述的进行PCR，反应体积用足够量的纯水调整。
平行对照的设置按照与上面一样的过程进行，所用的膜没有核酸共价结合。
·非修饰Biodyne C膜(膜A)，·按照描述的方法化学修饰Biodyne膜，但不用无水DMF和MnO2处理；此对照有可能确定在无叠氮甲基基团的情况下膜的特性(膜B)，以及·Biodyne C膜不进行修饰，但是用无水DMF和MnO2剧烈搅拌20min处理，此对照有可能确定这种处理步骤不会改变DNA对膜的吸附(膜C)。
为了检验对膜的处理不会抑制PCR，同时用另外三个膜A，B和C的小片与25μl细菌裂解物进行扩增(管A’，B’和C’)。
PCR产物用Picogreen按照厂商提供的说明书进行定量。
结果
表37从捕获在固相支持物上的细菌裂解物的DNA经PCR得到的DNA的定量表37的这些结果说明，将从裂解液得到的核酸通过叠氮化学方法共价捕获在固相支持物上是可能的。观察到扩增不是由于DNA与膜的非特异吸附。另一方面，用PCR进行的对照观察到膜不会抑制扩增反应。
为了检测膜上扩增产物的性质，扩增产物按照上述的方法通过DNA芯片分析。
权利要求
1.对温度稳定的式(0)的标记试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是0-2之间的整数，优选等于0或1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
2.如权利要求1所述的式(1)的标记试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
3.如权利要求1和2所述的式(2)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
4.如权利要求1和2所述的式(3)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
5.如权利要求1和2所述的式(4)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基。
6.如权利要求1所述的式(21)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
7.如权利要求1所述的式(22)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
8.如权利要求1所述的式(23)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，
9.如权利要求1-8中任一项所述的试剂，其中，R3和R4分别表示H，NO2，OCH3，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)3-CH2-NH-R2，-CO-NH-(CH2)3-(O-CH2-CH2)4-CH2-NH-R2。
10.如权利要求1-3中任一项所述的式(2’)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，
11.如权利要求1或6所述的式(24)的试剂 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是0-2之间的整数，优选等于0或1。
12.如权利要求1-11中任一项所述的试剂，其中，结构R2-(L)n-如式(5) 其中●R2表示可检测标记，●m是1-100之间的整数，和●p是1-10之间的整数。
13.如权利要求1-5中任一项所述的式(6)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
14.如权利要求1-5中任一项所述的式(25)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●R3表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
15.如权利要求1-3中任一项所述的式(14)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
16.如权利要求1-6中任一项所述的式(26)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
17.如权利要求1-3中任一项所述的式(15)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
18.如权利要求1-6所述的式(27)的试剂 其中●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于1，和●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数。
19.如权利要求1-18中任一项所述的试剂，其特征在于，L包含单元-(O-CH2-H2)-，该单元重复1-10次，优选重复1-10次，更优选重复2-5次。
20.合成如权利要求1-19中任一项所述标记试剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于0或1的整数，b)得到具有与R6互补的反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的互补官能团与式(16a)的衍生物的官能团R6反应以形成共价键，d)使肼或它的一个衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
21.合成如权利要求1-19中任一项所述标记试剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)得到式(16a)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，●R6表示COOH，COOM，NH2，OH或SH，其中M＝烷基，尤其是甲基或乙基，和●A是包含至少一个共价双键的连接臂，它能使重氮官能团和芳环共轭，u是等于0或1的整数，b)得到具有至少两个相同或不同的反应官能团R8的连接臂L，第一个官能团R8与R6互补，第二个官能团R8与R7互补，此外，得到具有反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使连接臂L的第一个反应官能团R8与式(16a)的衍生物反应以形成共价键，然后在至少一种偶联剂存在时，使连接臂L的第二个反应官能团R8与标记或标记前体反应以形成共价键，d)使肼或它的一个衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
22.如权利要求20或21所述的合成方法，它包含●包括保护化合物(16a)的酮或醛官能团的额外步骤，和●将所述酮或醛官能团去保护的额外的后续步骤。
23.如权利要求20所述的合成方法，它包括进行以下步骤a)得到式(16)的衍生物 其中●R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，●R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R6，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和●R6表示COOH，NH2，OH或SH。b)得到具有与R6互补的反应官能团R7的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的互补官能团与式(16)的衍生物的官能团R6反应以形成共价键，d)使肼或它的一个衍生物与酮或醛官能团反应以形成腙，和e)用合适的方法将腙转化成重氮甲基官能团。
24.合成如权利要求10所述的标记试剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)得到式(17)的衍生物 其中R1表示H或烷基或芳基或取代的芳基，b)得到具有羧酸官能团的标记或标记前体，c)在至少一种偶联剂存在时，使所述标记或标记前体的羧基官能团与式(17)的衍生物的伯胺官能团反应以形成酰胺键，d)使肼与式(17)的衍生物的酮或醛官能团反应以形成腙，和e)在MnO2存在时氧化所述腙以形成重氮甲基官能团。
25.标记生物分子，尤其是核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使生物分子与权利要求1-19任一所述的试剂在基本上是含水缓冲液的均匀溶液中接触。
26.用权利要求25所述的方法可获得的标记的生物分子。
27.标记并片段化单链或双链核酸的方法，其特征在于，所述方法包括任何顺序的以下步骤-将所述核酸片段化，-通过选自式(19)的化合物将一个标记附到至少一个片段上 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，和●Z包括可检测标记，所述试剂主要和所述片段的至少一个磷酸共价偶合。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述标记试剂选自式(20)的化合物 其中●R1表示H或烷基，芳基或取代的芳基，●R2表示一个可检测标记或至少两个通过至少一个多聚体结构连在一起的可检测标记，●L是包含至少两个共价键的线性连续的连接臂，n是等于0或1的整数，和●Z选自 或 或 或 其中■R3和R4分别表示H，NO2，Cl，Br，F，I，R2-(L)n-Y-X-，OR，SR，NR2，R，NHCOR，CONHR，COOR，其中R＝烷基或芳基，和■-Y-X-表示-CONH-，-NHCO-，-CH2O-，-CH2S-。
29.如权利要求27所述的方法，其中，Z是
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中，所述片段化和标记在两个步骤中进行。
31.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中，所述片段化和标记在一个步骤中进行。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中，所述标记是在基本上是含水的均匀溶液中进行的。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中，所述片段化是通过酶，物理或化学途径进行的。
34.能够用权利要求27-33中任一所述方法获得的标记的核酸。
35.用来检测靶核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求34所述的标记的核酸。
36.其上附有权利要求1-19中任一项所述试剂的固相支持物。
37.捕获核酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤●得到其上直接或间接附有至少一个含有重氮甲基官能团的分子的固相支持物，●使可能含有游离核酸的生物样品与其接触，和●将固相支持物上共价结合了至少一个核酸的一个或多个分子洗去。
全文摘要
本发明涉及对温度稳定的标记试剂，它具有以下结构如图其中·R
文档编号C07H21/04GK1518536SQ02812490
公开日2004年8月4日 申请日期2002年5月3日 优先权日2001年5月4日
发明者C·鲍格特, J·洛姆, A·拉扬, M·柯特拉, E·特里维希奥, L·梅诺, E·博纳门德兹, C 鲍格特, 乩, 擅诺伦, 镂 ０ 申请人:比奥·麦利尤股份有限公司, 约瑟夫福理埃大学(格勒诺布尔1), 国家科学研究中心, 比奥 麦利尤股份有限公司