专利名称：鉴定天然植物品种的方法、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种天然植物品种的鉴定方法及该方法在鉴定藏茵陈药材原植物种类的应用；同时还涉及一种鉴定天然植物品种的试剂盒及该试剂盒在鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的应用。
背景技术：
根据国家对药材的法规，只有进入药典的植物种类，才经过了药效、药理和安全性能的检查，才能在药品中使用。即使含有相同药效成分的种类，如果没有收入药典，也不能在药品中使用，因为它还可能含有其它未知的不安全成分。目前市场上出售的各种药材品种繁多，好多药材名称、形帽都很相似而价格相差悬殊，且药材干燥或者加工处理后，各种药材之间的特征难以鉴别。就市场上作为‘藏茵陈’药材出售的种类主要有川西獐牙菜Swertiamussotii、抱茎獐牙菜S.franchetiana、尼泊尔獐牙菜S.chirayita、椭圆叶花锚Halenia elliptica、四数獐牙菜S.tetraptera、华北獐牙菜S.wolfongiana、祁连獐牙菜S.przewalskii和大花肋柱花Lomatogoniummacranthum。其中仅有川西獐牙菜经过药效、药理的全过程研究，收入中国药典，抱茎獐牙菜进入青海省地方药典。但市场上出售的“藏茵陈”约有2/3标明是川西獐牙菜的药材经鉴定不是该种类，而分别是抱茎獐牙菜、椭圆叶花锚、大花肋柱花等种类，药效成分检查也发现这些伪品种类的有效成分类别、含量相差很远，新鲜药材收购的价格差距也很远，如椭圆叶花锚收购价仅有0.5元/斤，而川西獐牙菜则高达4元/斤。利用化学中的有效成分检验无法完成对“藏茵陈”药材正伪品的鉴定；此外，解剖学、形态学对于已经加工处理(如磨碎等)的药材不能鉴定到某一种类，因为这些种类的微形态学特征十分相似，只能鉴定到所检查的药材是否是属于“藏茵陈”这一大类。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然植物品种的鉴定方法以及该方法在鉴定藏茵陈药材原植物种类中的应用。
本发明的另一个目的是提供了一种鉴定天然植物品种的分子试剂盒及该分子试剂盒在鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的应用。
本发明的目的通过以下措施实现一种鉴定天然植物品种的方法，包括以下步骤(1)、对植物进行总DNA提取；(2)、利用引物对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与植物的标准DNA序列进行比较，从而确定该植物的品种。
所述植物总DNA的提取方法为CTAB法。
所述引物为DNA片段。
所述鉴定天然植物的方法用于鉴定藏茵陈原植物种类，其中引物为P15’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
鉴定藏茵陈原植物品种的方法包括以下步骤(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、利用引物P15’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物进行纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与各种藏茵陈原植物的标准DNA序列进行比较，从而确定藏茵陈的种类。
所述DNA进行PCR扩增的反应液包括双蒸水、缓冲液、dNTP、引物P1、引物P2、Taq酶、提取的DNA模板。
上述PCR扩增液的体积配比为双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul；dNTP(8mmol/L)5ul；引物P1(2μmol/L)2.5ul，引物P1(2μmol/L)2.5ul；Taq酶(Unit/μL)0.3ul；药材DNA模板(12.5mmol/L)10ul；扩增的工艺步骤为70°-1分钟，94°-1分钟，53°-45秒，72°-50秒，循环2次，再接以94°-20秒，55°-40秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟。
一种根据上述鉴定天然植物品种的方法制备的鉴定天然植物的分子试剂盒，其内的溶液主要由引物和DMSO试剂组成，其中所述引物为DNA片段。
将上述鉴定天然植物的分子试剂盒应用于鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜，该分子试剂盒内的引物为ID1GGCTTGCCTCTCGACGCTC和ID2GCAAGCGTCACGAAGACGCG。所述试剂盒内反应液还包括双蒸水、缓冲液、dNTP、Taq酶。
上述反应液的体积配比为双蒸水25ul，10×tris-CL缓冲液5u1，dNTP(8mmol/L)5ul，引物IDl(2μmol/L)2.5ul，引物ID2(2μmol/L)2.5ul，试剂DMSO(1.5mmol/L)0.2ul，Taq酶(Unit/μL)0.3ul。
上述的鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的试剂盒的应用，包括以下步骤(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、将上述提取的DNA取10ul滴入上述试剂盒内，使DNA进行PCR扩增；以70°-1分钟，94°-1分钟，62°-40秒，72°-50秒，循环2次，再以94°-20秒，55°-20秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟；若得到约500bp片段的扩增产物，则为川西獐牙菜；无此扩增片段，则是伪品种类。
上述dNTP、Taq酶、DMSO试剂、tris-CL缓冲液(PCR Buffer)为生物化学试剂，均可直接从生物化学产品公司购买。
本发明第一次提供了鉴定药材原植物品种的方法及及鉴定“藏茵陈”药材原植物种类的准确方法；同时也第一次提供了鉴定正品“藏茵陈”川西獐牙菜的分子试剂盒。
具体实施例方式
一种鉴定藏茵陈原植物品种的方法，包括以下步骤(1)、利用CTAB法对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、利用引物P15’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对上述提取的DNA进行PCR扩增；其中PCR扩增工艺如下扩增反应液体积配比双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/LKCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul；dNTP(8mmol/L)5ul；引物P1(2μmol/L)2.5ul，引物P1(2μmol/L)2.5ul；Taq酶(Unit/μL)0.3ul；药材DNA模板(12.5mmol/L)10ul。
扩增工艺步骤70°-1分钟，94°-1分钟，53°-45秒，72°-50秒，循环2次，再接以94°-20秒，55°-40秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟。
(3)将扩增得到的PCR产物利用Wizard PCR Preps DNA PurificationSystem(按其要求进行实验过程)纯化；
(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与各种藏茵陈原植物的标准DNA序列(见附页)进行比较，从而确定藏茵陈的原植物种类。
一种鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的分子试剂盒，该试剂盒内的反应液中各成分的体积配比为双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH 9.2，25mmol/L KCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul，；dNTP(8mmol/L)5ul；引物ID1GGCTTGCCTCTCGACGCTC2.5ul(2μmol/L)，引物ID2GCAAGCGTCACGAAGACGCG2.5ul(2μmol/L)，DMSO(1.5mmol/L)0.2ul，Taq酶(Unit/μL)0.3ul。
上述鉴定川西獐牙菜分子试剂盒的应用，包括以下步骤(1)、对药材进行总DNA提取；(2)、将上述提取的DNA取10ul(10-30ng)滴入上述试剂盒内，使DNA进行PCR扩增；以70°-1分钟，94°-1分钟，62°-40秒，72°-50秒，循环2次，再以94°-20秒，55°-20秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟；若得到约500bp片段的扩增产物，则为川西獐牙菜；无此扩增片段，则是伪品种类附各类“藏茵陈”原植物标准DNA序列表Swertia_mussotii TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGTGSwertia_franchetiana TCGAATCCTGCGAAGCGGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGTGSwertia_chirayiata TCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTACCGG-CACGGGGLomatogonium_macranthumTCGAATCCTGCGAAC-AGACGACCCGAGAACATGTTTAACGC-ACGGGCGHalenia_elliptica TCGAATCCTGCGAAGCAGATGACCCGAGAACATGTTTAACGA-ACGGGCGSwertia_tetraptera TCGAATCCTGCAAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAACAA-ACGGGCGSwertia_przewalskiiTCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAAAGC-ACGGACGSwertia_wolfangianaTCGAATCCTGCGAAGCAGACGACCCGAGAACATGTTTAAAGC-ACGGACGSwertia_mussotii --TCCGGGA-CGAGGGAAACCACGGACTGGCGCCCCGAGCASwertia_franchetiana --TCCGGGA-CGAGGGAAACCACGGACCGGTGCCCCGAGCASwertia_chirayiata CGTCCGGGA-CGGGGAAAACCACGGACCGGCGCCTCGAGCGLomatogonium_macranthum--TCCGGGA-CGAGGGAAACCTTGGACCGGCACCCCGAGCGHalenia_elliptica --TCCGGAA-AGAGGGAAACCATGGACCGGCGCCC-GTGCGSwertia_tetraptera --TCCGGAA-AGAGGGAAACCACGGACCGGCACCCCATGCASwertia_przewalskii--TCCGGGA-TGTGGGAAACCACGGACCGGCGCCCCGAGCASwertia_wolfangiana--TCCGGGA-TGTGGGAAACCACGGACCGGCGCCCCGAGCASwertia_mussotii CGGTGTCGACCT-TAGGTTGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAASwertia_franchetiana CGTTGTCGACCT-TAGGTTGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAASwertia_chirayiata CGGCGTCGACCA-TAGGTCGCTCGTCGTGCACATAAACAACCCCGGGCGCTTAAAALomatogonium_macranthumCGGCGTCGACT--TAGGTCGCTCGTCGTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAAHalenia_elliptica CGGCGTCGACCAGCCGGTCGTGCGTCATGCACACAAACAACCCCGGGCGTAGAAAASwertia_tetraptera TGACGTCGACCAGCCGGTCGTGCGTTCTGCACACAAACAACCCCGGGCGCATAAAASwertia_przewalskiiCGGCGTCGACCA-ACGGTCGCTCTTCGTGCAGACAAACAACCCCGGGCGCATAAAASwertia_wolfangianaCGGCGTCGACCA-ACGGTCGCTCTTCGTGCAGACAAACAACCCCGGGCGCATAAAASwertia_mussotii GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCTTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGGAGTGSwertia_franchetiana GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCTTGCCTCTCGATGCTCCGTTCGCGGAGTGSwertia_chirayiata GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCCTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGGAGTGLomatogonium_macranthumGCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAAGGATGGCCTGCCTCTCGACGCTCCGTTCGCGTAGTGHalenia_elliptica GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGATGGCCTGCCTCTTGATGCCCCGTACGCGGAGTGSwertia_tetraptera GCGCCAAGGAAAAC-AAGAAAGGGA-AGCCTGCCTCTTGACGCGCCGTACGCGGAGTGSwertia_przewalskiiGCGCCAAGGAAGAC-AAGGAAGGGATGGCCTTCCTCTCGATGCGCCGTACGCGGAGTGSwertia_wolfangianaGCGCCAAGGAAGAC-AAGGAAGGGATGGCCTTCCTCTCGATGCGCCGTACGCGGAGTGSwertia_mussotii CACGGGAGGGCAACAGGCACCTGAAGAAACAA-AAACGACTCTCGGCAACGGATATCTC
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权利要求
1.一种鉴定天然植物品种的方法，包括以下步骤(1)、对植物进行总DNA提取；(2)、利用引物对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与植物的标准DNA序列进行比较，从而确定该植物的品种。
2.如权利要求1所述的一种鉴定天然植物品种的方法，其特征在于所述植物总DNA的提取方法为CTAB法。
3.如权利要求1所述的一种鉴定天然植物品种的方法，其特征在于所述引物为DNA片段。
4.一种权利要求1所述鉴定天然植物品种的方法的应用，其特征在于将该方法用于鉴定藏茵陈原植物种类。
5.如权利要求4所述鉴定天然植物品种的方法的应用，其特征在于所述引物为P15’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
6.如权利要求5所述鉴定天然植物品种的方法的应用，其特征在于其包括以下步骤(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、利用引物P15’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3’和引物P25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物进行纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与各种藏茵陈原植物的标准DNA序列进行比较，从而确定藏茵陈的种类。
7.如权利要求6所述鉴定天然植物品种的方法的应用，其特征在于所述DNA进行PCR扩增的反应液包括双蒸水、缓冲液、dNTP、引物P1、引物P2、Taq酶、提取的DNA模板。
8.如权利要求7所述鉴定天然植物品种的方法的应用，其特征在于所述扩增液的体积配比为双蒸水25ul；10×tris-CL缓冲液(PH9.2，25mmol/LKCL，1.5mmol/L MgCl2)5ul；dNTP(8mmol/L)5ul；引物P1(2μmol/L)2.5ul，引物P1(2μmol/L)2.5ul；Taq酶(Unit/μL)0.3ul；药材DNA模板(12.5mmol/L)10ul；扩增的工艺步骤为70°-1分钟，94°-1分钟，53°-45秒，72°-50秒，循环2次，再接以94°-20秒，55°-40秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟。
9.一种根据权利要求1所述鉴定天然植物品种的方法制备的鉴定天然植物的分子试剂盒，其特征在于该分子试剂盒内的反应液主要由引物和DMSO试剂组成，其中所述引物为DNA片段。
10.如权利要求9所述鉴定天然植物的分子试剂盒应用于鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜，其特征在于该分子试剂盒内反应液中的引物为ID1GGCTTGCCTCTCGACGCTC和ID2GCAAGCGTCACGAAGACGCG。
11.将如权利要求10所述鉴定天然植物的分子试剂盒应用于鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜，其特征在于该试剂盒内反应液还包括双蒸水、缓冲液、，dNTP、Taq酶。
12.如权利要求11所述鉴定天然植物的分子试剂盒应用于鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜，其特征在于所述反应液的体积配比为双蒸水25ul，10×tris-CL缓冲液5ul，dNTP(8mmol/L)5ul，引物ID1(2μmol/L)2.5ul，引物ID2(2μmol/L)2.5ul，试剂DMSO(1.5mmol/L)0.2ul，Taq酶(Unit/μL)0.3ul。
13.如权利要求12所述的鉴定正品藏茵陈川西獐牙菜的试剂盒的应用，包括以下步骤(1)、对藏茵陈药材进行总DNA提取；(2)、将上述提取的DNA取10ul滴入上述试剂盒内，使DNA进行PCR扩增；以70°-1分钟，94°-1分钟，62°-40秒，72°-50秒，循环2次，再以94°-20秒，55°-20秒，72°-50秒，循环38次，然后在72°保温4分钟；若得到约500bp片段的扩增产物，则为川西獐牙菜；无此扩增片段，则是伪品种类。
全文摘要
本发明涉及一种天然植物品种的鉴定方法及在鉴定藏茵陈药材原植物种类的应用，其包括以下步骤(1)对药材进行总DNA提取；(2)利用引物对上述提取的DNA进行PCR扩增；(3)将扩增得到的PCR产物纯化；(4)利用测序仪对纯化的PCR产品进行测序获得一段碱基序列，并将该碱基序列与植物的DNA序列进行比较，确定该药材的品种。本发明还涉及一种鉴定药材原植物品种的试剂盒及川西獐牙菜的分子鉴定试剂盒，利用本试剂盒对药材中提取的总DNA进行扩增，如果具有一条约500的扩增产物，则为川西獐牙菜，无此扩增产物，则为非正品种类。
文档编号C12Q1/68GK1584048SQ0313454
公开日2005年2月23日 申请日期2003年8月22日 优先权日2003年8月22日
发明者刘建全, 王玉金, 李小鹃, 党雪艳 申请人:中国科学院西北高原生物研究所