一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒及其诊断方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒，所述试剂盒包含的适配子能够高效的特异性的结合ESP。该适体的获得是应用新的组合化学技术SELEX，以ESP为靶目标，从随机文库中筛选出了能与ESP特异性结合的RNA适配子。通过适配子特异性的结合ESP，从而定量测定血液中的肺吸虫病，从而能够快速高效的初步筛选肺吸虫病。该试剂盒制备简单，成本低廉，适宜于大面积的推广使用，具有极高的社会价值。
【专利说明】
-种用于儿科的肺吸虫病诊断的试剂盒及其诊断方法
技术领域
[0001] 本发明设及医学检测领域，特别设及一种用于儿科的肺吸虫病诊断用的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 儿童由于体内免疫能力较低，经常罹患各种疾病，特别是寄生虫类的疾病。肺吸虫 病(Paragonimiasis)是一种常见和重要的人兽共患寄生虫病，主要流行于亚洲、非洲和拉 下美洲，尤W亚洲地区多见，在我国流行于22个省、市、自治区，估计每年感染者约200万之 多，严重危害人类健康，尤其是青少年、儿童的健康。肺吸虫病主要是肺吸虫虫体(幼虫或成 虫)在人体组织与器官内移行、寄居造成的机械性损伤，及其代谢物等引起的免疫病理反 应。
[0003] 小儿肺吸虫病临床表现:依肺吸虫寄生的部位而分为W下几型。1.肺型起病大多 缓慢，全身症状有发热、乏力、消瘦、盗汗等。同时咳嗽、胸闷、胸痛、咯铁诱色疲或疲带血丝。 有时可伴有胸腔积液。2.脑型多见于儿童。表现为头痛、呕吐、意识障碍、癒发作和擁痕等。 因病变在脑中主要损害的部位而分为癒型、脑瘤型、脑膜炎型、脑血栓型和療病型。脑脊液 常有异常改变。3.腹型主要为腹痛、腹壁紧张、局部有压痛。如虫囊侵及肠壁时可有腹泻及 粘液脈血便。4.皮下结节大小不等（约0.5~4cm直径大小），位于深部皮下，W腹壁皮肤多 见，能向各处迁移游走。
[0004] 在我国，致病虫种主要为卫氏肺吸虫和斯氏肺吸虫或斯氏狸殖吸虫，其成虫寄生 于人、犬、果子狸等肉食动物的肌肉和器官如肝、肺中；尤其斯氏肺吸虫作为仅在我国流行 的一种吸虫，其在人体内不能发育成熟，而W幼虫在人体内移行、窜扰，常常引起游走性皮 下包块或结节，脑占位性病变和内脏损伤等肺外型寄生虫表现，造成多器官、组织的损害。 肺吸虫病根据肺吸虫寄生部位不同，出现复杂的病理变化和多种多样的临床表现，临床症 状不典型，易与其他疾病混淆，误诊率极高。对于感染早期、低度感染及肺外型肺吸虫病患 者，W发现虫卵或虫体的病原学检测方法往往难W获得检测结果。
[0005] 半脫氨酸蛋白酶(切Steine protease)是多种寄生虫分泌、排泄的一种蛋白水解 酶，也是免疫优势抗原，并具有明显的种、属特异性。发明人研究发现，斯氏狸殖吸虫的半脫 氨酸蛋白酶对宿主具有免疫原性和反应性，能诱导免疫反应，可作为肺吸虫病的免疫诊断 抗原；因该蛋白酶的免疫组化反应呈现虫体的肠道、排泄囊内，其编码基因杂交定位在成虫 的肠壁、体壁，故将该蛋白酶又称为肺吸虫排泄分泌蛋白化xcretcxry-secreto巧protein, ESP)。已有研究证实，通过检测ESP蛋白的存在与否，即可检验肺吸虫病的存在。
[0006] 目前，用于肺吸虫病的免疫学检测方法种类较多，包括抗体检测方法如皮内试验 (口）、补体结合试验(CFT)、间接血凝试验（IHA)、对照免疫电泳试验(CIEP)、免疫巧光试验 (IFAT)、酶联免疫吸附试验化LISA)等；W及抗原检测方法如多克隆或单克隆抗体化ISA法 等。抗体检测方法敏感性高，但因治愈后抗体在体内仍可维持较长时间，致使疗效考核效果 不理想，尤其在疫区反复感染人群中无法区别是现行感染还是既往感染;抗体检测中使用 的抗原，如虫体抗原、排泄分泌抗原等，均为粗抗原，易出现同源吸虫间交叉反应，并严重依 赖于虫体来源的成分;各实验室的检测抗原不一致，导致无法对检测结果进行比较等问题。 此外，循环抗原(CAg)检测，即对虫体的代谢产物及腺体分泌液、子宫液、脱落的虫体皮层表 膜等抗原性物质的检测，方法特异性高，能反映感染虫荷；因 CAg出现较抗体产生为早，有早 期检测价值;而且经有效治疗使虫体死亡后抗原消失快，可用于确诊和(或)疗效考核，但其 不足之处在于敏感性较低，并受多种因素干扰。运一现状严重影响了临床上肺吸虫感染的 早检测、早预防、早治疗，限制了人肺吸虫感染的流行病学调查研究。
[0007]虽然可W采用抗体通过酶联免疫反应来定量分析ESP的含量，但是该方法对抗体 的要求比较高，并且检测成本也比较高，因此，对于贫穷落后地区，并不适宜大面积推广。 [000引S化EX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术。利用该技术可 W从随机单链寡核巧酸库中筛选到特异性与祀物质高度亲和的核酸适配体。其基本思路是 体外化学合成一个单链寡核巧酸库，与祀物质混合，形成祀物质-核酸复合物，洗脱未结合 的核酸，分离与祀物质结合的核酸分子，并W此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进入下轮 的筛选。通过重复的筛选与扩增，一些与祀物质不结合或与祀物质有低亲和力、中亲和力的 核酸分子被洗去，而与革G物质有强亲和力的核酸分子从非常大的随机库中分尚出来，且纯 度随SELEX过程的进行而增高，最后占据库的大多数(>90%左右）。自化erk和Ellington等 首先运用此技术筛选到特异性吸附隧菌体T4DNA聚合酶和有机染料分子的特异核酸适配体 后，经过十几年的发展，SELEX技术已经成为一种重要的研巧手段和工具。因此，采用selex 技术，筛选特定的结合ESP的适配体，进而将适配体制备成为特异性检测ESP的试剂盒，准 确、快速、简便地进行肺吸虫病的诊断与鉴别诊断、W及疗效考核具有重要意义及广阔的应 用前景。
【发明内容】
[0009] 本发明的技术方案通过W下步骤实现：
[0010] 本发明的目的是提供一种ESP的核酸适配体序列。
[0011] 本发明中，所述的ESP的核酸适配体(序列1-16)能够特异结合ESP。
[0012] 本发明的进一步的目的是提供所述核酸适配体序列的用途。本发明中根据对该序 列应用，可进一步用于制备特异性结合ESP的试剂盒。
[OOU]从体外合成的随机寡聚DNA文库，（5'-AACATGAGCAACATTAGCCA----N36---- GGACAGTGAACGAAGTACCT-3/ )，其中N36为36个随机寡核巧酸;从中筛选出与ESP特异结合的 核酸适配体；将筛选出的序列用引物Pl : AACATGAGCAACATTAGCCA ;引物P2 : AGGTACTTCGTTCACTGTCC，进行扩增并进行TA克隆入PMD19-T载体(购自上海博光生物公司）， 转化D册a细菌(购自北京天根生物公司）；挑去白色菌落进行PC閒角定阳性克隆后，抽提质粒 并测序反应，上测序仪测序。
[0014] 本发明采用核酸适配体的体外筛选视LEX)技术，WESP为正筛祀标，筛选与ESP特 异结合的核酸适配体，制得具有特异结合ESP的序列，本发明中命名为适配体ESP ap-1~ 16。序列如下：
[0015] ESP ap-1:
[0016] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAAUACAAAUCUCUAAAUAGAACCACCCCAACUUUGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0017] ESP ap-2:
[001 引 AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUACCUUACCCUAUCCAAGACAAUCUAUCUCCCAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0019] ESP ap-3:
[0020] AACAUGAGCAACAUUAGCCACUAUACUUAAUUUCACAACAGAAUCUAACCUCCUAAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0021] ESP ap-4:
[00。] AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUACCCCCUCUUCAGAACACAAUCUAUAAAAUCAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0023] ESP ap-5:
[0024] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUUUAUUUAUUCAUCCGCUCUUACUCCAAUCACUAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0025] ESP ap-6:
[0026] AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACAAUACCUCCCAUCCCGUCUCCUUUCUACAUCCCGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0027] ESP ap-7:
[00 巧]AACAUGAGCAACAUUAGCCAAUAUCCAUCCUACCCAUCCCGCUUUACUACUCUCUCGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0029] ESP ap-8:
[0030] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUUAUUUCUUCUCACAAUUCAGCAACUAACUCCACAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0031] ESP ap-9:
[00；32 ] AACAUGAGCAACAUUAGCCACACCACAUAAAAUCUAUUCAAGAAUUAAUACUUUCAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0033] ESP ap-10:
[0034] AACAUGAGCAACAUUAGCCACUCUUCUUCAACUCAAUAUCGUUCCCUUAACUUAUCGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0035] ESP ap-11:
[OO%] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCUAUCUACCAAUCUUACGAUUCAAUCCCUAUACAUGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0037] ESP ap-12:
[0038] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUUAUCAUCUUACAUUCGCCCCUCAAUUCCCUAACAAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0039] ESP ap-13:
[0040] AACAUGAGCAACAUUAGCCAAACUCCUUUUCCUUCUGUCACACCACUUCACAUAUAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0041] ESP ap-14:
[004。 AACAUGAGCAACAUUAGCCAAAUUCUUACACAUCUCGCCUACUUCCUAUUACUUUUGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0043] ESP ap-15:
[0044] AACAUGAGCAACAUUAGCCACCAUUUUAUAACCAAAUCAUCUACUCGUUCUCUCCAGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0045] ESP ap-16:
[0046] AACAUGAGCAACAUUAGCCAUCCAUUCUAUAAUUAACCGCCACUAAUUCCUCAUCCGGACAGUGAACGA AGUACCU
[0047] W上述核酸适配子筛选文库为基础，可对文库两端的固定序列的个别核巧酸进行 替换、颠倒、移位，或对其长度进行小幅延长或缩短，或对文库中间的随机序列进行延长或 缩短，或对扩增文库的引物作相应的简单改造，然后制备简单改造后的文库和引物进行核 酸适配子的筛选、PCR扩增和分析与应用。
[0048] W上述核酸适配子筛选文库为基础，可随机改变文库中间的随机序列区的核巧酸 组成，通过计算机软件模拟寡核巧酸序列的二级结构或=级结构，设计出核酸适配子或改 造从本文库筛选出的核酸适配子。
[0049] 可利用上述任何一个原始或简单改造后的文库进行核酸适配子的筛选、分析、改 造和应用。
[0050] 本发明的有益效果:本发明设计出了一个性能优秀的随机单链寡核巧酸文库。文 库具有接近长度下限的短固定序列和较长的随机序列，充分保证了文库中单链寡核巧酸的 多样性。文库固定序列（引物序列）的独特设计能使用高退火溫度进行PCR扩增，既能有效获 得目的产物，又能有效抑制非特异性产物。本文库及引物应用于ESP的核酸适配子筛选获得 成功，所述的适配子可W用于制备检测试剂盒，从而用于儿童的肺吸虫病的检测。
【具体实施方式】
[0051] 实施例1肺吸虫病ESP蛋白的获得
[0052] 按照CN 101319224B中权利要求1公开的制备肺吸虫排泄分泌蛋白的方法，制备得 到肺吸虫排泄分泌蛋白，蛋白浓度为lOOmg/mL，置4°C保存。
[0053] 实施例2适配子的获得
[0054] 从体外合成的随机寡聚DNA文库，5' -AACATGAGCAACATTAGCCA----N36---- GGACAGTGAACGAAGTACCT-3'。
[00对所用引物：
[0056] F:5，-AACATGAGCAACATTAGCCA-3
[0057] R:5，-GGACAGTGAACGAAGTACCT-3
[0058] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；W回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。8化g RNA文库经 硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与20ug ESP蛋白37°C解育40min，反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.7mol/L 醋酸锭，1.6mmol/L EDTA, 0.15% SDS)中煮沸5min，离屯、，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新 溶解于20iilDEPC水中；WRNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛 选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，W该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子 库，筛选共进行14轮。将最后一轮筛选得到的适配子上测序仪测序。测定得到序列如SEQ ID NO: I-16所示。
[0059] 实施例3特异性高亲和力的ESP结合适配子的获得
[0060] 将RNA适配子分别取1.扣g，用牛小肠碱性憐酸酶(CIP) 37 °C消化Ih，纯化回收去憐 酸化的RNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫-32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。Wnmol放射 性标记的RNA适配子分别与不同浓度（l-200nM)的ESP蛋白37 °C解育30min，各组反应液经硝 酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平 行做两次测定。计算各个适配子与SIgA蛋白的解离常数。结果如下： 「AAiM 1
[0062] 从W上结果可W看出，本发明的16个适配子具有非常强的结合特性，现有技术中 也没有所述结合特性的适配子能够结合ESP蛋白。
[0063] 实施例4降解活性分析
[0064] 分别采用华支睾吸虫、猪囊尾蝴、裂头蝴、人血白蛋白、IgA、血红蛋白与16条适配 子进行特异性检测，经过结合试验发现，运些适配子都不与运些寄生虫或者蛋白相结合，而 只与ESP蛋白结合保持较高的特异性。
[0065] 将所述的适配子，取0.4ug，分别置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通过RT- PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0066] 实施例5临床试验分析
[0067] 将16个适配子分别用于检测同样的儿童血液的临床样本，其中从感染有华支睾吸 虫、斯氏狸殖吸虫、猪囊尾蝴和裂头蝴的人上收集IOml血液各10组，加入常规的细胞裂解液 裂解细胞，而后裂解液被分装为15iU每小瓶并冷藏直至使用。W没有感染寄生虫疾病的儿 童10组作为阴性对照。
[006引将50组血清加入到无菌离屯、管中，加入PBS溶液震荡溶解。分别将偶联有磁珠的16 组适配子0.化g与50组的细胞裂解液溶液15山混合解育20分钟，而后磁分离，即可获得相应 的分离的ESP蛋白，通过检测发现，在10例斯氏狸殖吸虫感染组中，16组适配子均检测到高 浓度的ESP蛋白，平均检测浓度为40.5mg/L，并且分布均匀，而在感染有华支睾吸虫、猪囊尾 蝴和裂头蝴的组W及健康组中均没有检测到与适配子结合的ESP蛋白，由此可见，可W采用 本发明的16种适配子可W快速的实现斯氏狸殖吸虫感染100%的初步筛选的检测效果。具 有极高的准确性和特异性。
[0069]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于特异性诊断肺吸虫病的试剂盒，其含有核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述适体为SEQ ID No. 1-16任一条序列所 示，或者在该序列的基础上进行的一个或几个核苷酸的替换，并保留其活性。3. 权利要求2中所示的适体在检测ESP蛋白的应用。4. 权利要求2中所示的适体用于制备检测肺吸虫病的试剂盒中的应用。5. -种诊断肺吸虫病的方法，其特征在于:使用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK105925687SQ201610319093
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月15日
【发明人】陈博
【申请人】陈博