一种百日咳诊断试剂盒及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种百日咳诊断试剂盒及制备方法，该试剂盒包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置。所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的硝酸纤维素膜和吸水层三部分组成，吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水层是由3-5层吸水垫叠放在一起组成的。本发明试剂盒在纳米金放大技术的基础上，通过集中渗滤装置将抗原抗体反应产生的免疫金斑点再次集中放大，提高检测灵敏度，以扩大检测限，从患病的潜伏期、痉挛期直到恢复期均可有进行效检测。
【专利说明】一种百日咳诊断试剂盒及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检验【技术领域】，特别是涉及一种百日咳诊断试剂盒及制备方法。
【背景技术】
[0002]百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，临床表现为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故称百日咳。百日咳的咳嗽已经发现可以导致结膜下出血，肋骨骨折，尿潴留，疝，咳嗽后晕厥，以及椎动脉夹层，剧烈的咳嗽可以导致胸膜破裂，导致气胸，尤其是对小儿来说，危害很严重，痉咳期的长短与治疗的迟早有关，尽早诊断才能尽早治疗，所以对百日咳的快速诊断显得尤为重要。
[0003]目前，医学上对百日咳的检查有多种方法，包括白细胞计数法，细胞培养法，荧光抗体染色法，血清学检查等，细胞培养法通过分离菌落，观察菌落形态，只能作为初步诊断；荧光抗体染色法是用鼻咽拭子涂片，加荧光标记的抗血清，荧光显微镜下检查，早期患者75?80%阳性，优点是可以快速诊断，但缺点是特异性差，有假阳性，临床上只是作为辅助培养；血清学检查是做双份血清凝集试验及补结合试验，若抗体效价递升即可确诊，近期有用酶联免疫吸附试验测IgM、IgG和IgA抗体，对早期诊断有所帮助；另外，百日咳杆菌或其组成成分的检测方法如斑点杂交法、PCR法、组织细胞培养的形态、酶的活力等尚处于实验室或临床观察阶段，还未被普遍应用。
[0004]百日咳杆菌初步诊断以分离培养为主，潜伏期(卡他期)分离阳性率可达91.5%，而恢复期仅有约26%，确诊是用分离菌与I相免疫血清作血清玻片凝集或免疫荧光染色，所以主要局限在I相期检测，检测限较短。所以，急需研究出一种不仅快速而且检测限较长的百日咳杆菌检测方法。
【发明内容】
[0005]针对上述现状，本发明解决的技术问题就是提供一种可以快速检测百日咳杆菌的检测方法，而且检测限比较长，从患病的潜伏期、痉挛期直到恢复期均可进行有效检测。
[0006]本发明的技术方案为:一种百日咳诊断试剂盒，包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成。
[0007]进一步地，所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为0.92-1.86 μ g/mL。
[0008]进一步地，所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为0.85?1.65 μ g/mL。
[0009]其中，所述的百日咳杆菌荚膜抗原采用如下方法制备得到:
[0010](I)细菌分离培养:用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，5-7日后，停止培养，分离菌落；由于百日咳杆菌为专性需氧细菌，初次分离培养时营养要求较高，所以需用马铃薯血液甘油琼脂培养基(即鲍?金氏培养基)才能生长，经37°C 2?3天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长,并有少量粘性沉淀；
[0011](2)溶菌酶处理细菌悬液:在每毫升含2亿个细菌细胞的悬液中加100μ g至Img溶菌酶，27-35°C，保温15min，破碎细菌细胞；
[0012](3)抗原提取:用氢作为溶剂，0.03-0.05mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5°C以下，pH控制在5.0-7.0范围内；
[0013](4)抗原分离与纯化:用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶；离子交换凝胶不仅交换当量高，而且层析条件温和，操作简单；
[0014](5)抗原浓缩:采用冰冻法进行浓缩，先将步骤⑷制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至0.85?1.65 μ g/mL,即得抗原浓缩液，-20?_4°C保存；冰冻法是蛋白质一类生物大分子浓缩得比较有效的方法，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到出去大部分溶剂的目的；
[0015](6)抗原包被硝酸纤维素膜:将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置20-30min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。
[0016]其中，所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备方法包括如下步骤:
[0017](I)制备纳米金体系:王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为I %的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为:(97.5-98.8):(3.85-4.05)，搅拌加热煮沸，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；所述的纳米金粒子粒径为14-18nm ；
[0018](2)制备纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针:将上述纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至7.6-8.5,将鼠抗人IgA抗体稀释至0.3-0.75mg/ml, 12000rpm、4°C条件下离心40min,得上清液,迅速滴加到纳米金溶液中，充分混勻结合，加入与前述混合液等体积的封闭液，室温继续孵育20?28min, 14000rpm, 4°C条件下离心15?25min,去除上清液,稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针。
[0019]其中，所述的塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有边长约0.5?0.8cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜贴紧吸水垫，所述的吸水层是由3-5层吸水垫叠放在一起组成的。由于吸水层的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果。
[0020]本发明的检测原理为:运用斑点金免疫集中渗滤试验，以硝酸纤维素膜为载体，并包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因硝酸纤维素膜贴置于吸水材料上，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水层的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的(一般5min左右完成)，阳性反应在膜上呈现红色斑点。
[0021 ] 本发明的有益效果为:试剂盒简单易制备，检测方便，快速，灵敏度高，相比其他检测方法其检测限更大，从患病的潜伏期、痉挛期直到恢复期均可有进行效检测，非常适合临床应用。
【具体实施方式】
[0022]本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
[0023]实施例1:
[0024]一种百日咳诊断试剂盒，包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为0.92 μ g/mL ;所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为0.85 μ g/mL。
[0025]所述的百日咳杆菌荚膜抗原的制备:
[0026](I)细菌分离培养:用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，5日后，停止培养，分离菌落；由于百日咳杆菌为专性需氧细菌，初次分离培养时营养要求较高，所以需用马铃薯血液甘油琼脂培养基(即鲍?金氏培养基)才能生长，经37°C、2天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长，并有少量粘性沉淀；
[0027](2)溶菌酶处理细菌悬液:在每毫升含2亿个细菌细胞的悬液中加100 μ g至Img溶菌酶，27°C，保温15min，破碎细菌细胞；
[0028](3)抗原提取:用氢作为溶剂，0.03mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5°C以下，pH为5.0 ;
[0029](4)抗原分离与纯化:用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶；离子交换凝胶不仅交换当量高，而且层析条件温和，操作简单；
[0030](5)抗原浓缩:采用冰冻法进行浓缩，先将步骤(4)制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至0.85 μ g/mL,即得抗原浓缩液，-20°c保存；冰冻法是蛋白质一类生物大分子浓缩得比较有效的方法，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到出去大部分溶剂的目的；
[0031](6)抗原包被硝酸纤维素膜:将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置20min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。
[0032]所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备:
[0033](I)制备纳米金体系:王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为1%的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为:97.5:3.85,搅拌加热煮沸，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；所述的纳米金粒子粒径为14nm ；
[0034](2)制备纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针:将上述纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至7.6,将鼠抗人IgA抗体稀释至0.3mg/ml, 12000rpm、4°C条件下离心40min,得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，充分混匀结合，加入与前述混合液等体积的封闭液，室温继续孵育20min, 14000rpm, 4°C条件下离心15min,去除上清液,稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针。
[0035]所述的集中渗滤装置制备:集中渗滤装置是由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有边长约0.5cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜贴紧吸水垫，所述的吸水层是由3层吸水垫叠放在一起组成的。由于吸水层的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果。
[0036]实施例2:
[0037]一种百日咳诊断试剂盒，包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为1.39 μ g/mL ;所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为1.25 μ g/mL。
[0038]所述的百日咳杆菌荚膜抗原的制备:
[0039](I)细菌分离培养:用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，6日后，停止培养，分离菌落；由于百日咳杆菌为专性需氧细菌，初次分离培养时营养要求较高，所以需用马铃薯血液甘油琼脂培养基(即鲍?金氏培养基)才能生长，经37°C、2天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长，并有少量粘性沉淀；
[0040](2)溶菌酶处理细菌悬液:在每毫升含2亿个细菌细胞的悬液中加100 μ g至Img溶菌酶，31°C，保温15min，破碎细菌细胞；
[0041](3)抗原提取:用氢作为溶剂，0.05mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5°C以下，pH控制为6.0 ；
[0042](4)抗原分离与纯化:用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶；离子交换凝胶不仅交换当量高，而且层析条件温和，操作简单；
[0043](5)抗原浓缩:采用冰冻法进行浓缩，先将步骤(4)制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.25 μ g/mL，即得抗原浓缩液，-12°c保存；冰冻法是蛋白质一类生物大分子浓缩得比较有效的方法，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到出去大部分溶剂的目的；
[0044](6)抗原包被硝酸纤维素膜:将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置25min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。
[0045]所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备:
[0046](I)制备纳米金体系:王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为1%的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为:98.15:3.95，搅拌加热煮沸，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；所述的纳米金粒子粒径为16nm ；
[0047](2)制备纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针:将上述纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.05,将鼠抗人IgA抗体稀释至0.52mg/ml, 12000rpm、4°C条件下离心40min,得上清液,迅速滴加到纳米金溶液中，充分混勻结合,加入与前述混合液等体积的封闭液，室温继续孵育24min，14000rpm，4°C条件下离心20min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针。
[0048]所述的集中渗滤装置制备:集中渗滤装置是由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜(K)抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有边长约0.65cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜贴紧吸水垫，所述的吸水层是由4层吸水垫叠放在一起组成的。由于吸水层的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果。
[0049]实施例3:
[0050]一种百日咳诊断试剂盒，包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为1.86 μ g/mL ;所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为1.65 μ g/mL。
[0051]所述的百日咳杆菌荚膜抗原的制备:
[0052](I)细菌分离培养:用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，5-7日后，停止培养，分离菌落；由于百日咳杆菌为专性需氧细菌，初次分离培养时营养要求较高，所以需用马铃薯血液甘油琼脂培养基(即鲍?金氏培养基)才能生长，经37°C、3天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长,并有少量粘性沉淀；
[0053](2)溶菌酶处理细菌悬液:在每毫升含2亿个细菌细胞的悬液中加100 μ g至Img溶菌酶，35°C，保温15min，破碎细菌细胞；
[0054](3)抗原提取:用氢作为溶剂，0.05mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5°C以下，pH控制为7.0 ；
[0055](4)抗原分离与纯化:用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶；离子交换凝胶不仅交换当量高，而且层析条件温和，操作简单；
[0056](5)抗原浓缩:采用冰冻法进行浓缩，先将步骤⑷制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.65 μ g/mL,即得抗原浓缩液，-4°C保存；冰冻法是蛋白质一类生物大分子浓缩得比较有效的方法，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到出去大部分溶剂的目的；
[0057](6)抗原包被硝酸纤维素膜:将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置30min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。
[0058]所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备:
[0059](I)制备纳米金体系:王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为1%的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为:98.8:4.05，搅拌加热煮沸，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；所述的纳米金粒子粒径为18nm ；
[0060](2)制备纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针:将上述纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.5,将鼠抗人IgA抗体稀释至0.75mg/ml, 12000rpm、4°C条件下离心40min,得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，充分混匀结合，加入与前述混合液等体积的封闭液，室温继续孵育28min, 14000rpm, 4°C条件下离心25min,去除上清液,稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针。
[0061]所述的集中渗滤装置制备:集中渗滤装置是由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成；塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有边长约0.8cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，紧密关闭盒盖，使硝酸纤维素膜贴紧吸水垫，所述的吸水层是由5层吸水垫叠放在一起组成的。由于吸水层的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果。
[0062]检测试验:
[0063]1.试验样品:待测标本(标本采用鼻咽试子或咳皿法取样)、阳性样品、阴性样品。
[0064]2.检测方法:将收集到的待测样品用PBS做1:10稀释，用移液器将150 μ I该稀释样品滴加到本发明实施例1制备的试剂盒中，待渗滤30s后，继续滴加150μ IPBS缓冲液冲洗，渗滤30s ;滴注75 μ I金标鼠抗人IgA抗体检测探针，渗滤30s，滴加150 μ IPBS缓冲液冲洗；观测斑点显色。阳性样品和阴性样品对照并行检测作为质量控制。
[0065]3.检测结果:对30阳性样品和30例正常样品的检测结果显示:本发明所述的斑点金免疫集中渗滤法的灵敏度分别为96% ;特异性为100%。
[0066]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成。
2.如权利要求1所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于:所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为0.92-1.86 μ g/mL。
3.如权利要求1所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于:所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为0.85?1.65 μ g/mL。
4.如权利要求1?3任意一项所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于:所述的点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到: (1)细菌分离培养:用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，5-7日后，停止培养，分离菌落； (2)溶菌酶处理细菌悬液:在细菌细胞的悬液中加溶菌酶，27-35°C，保温15min，破碎细菌细胞； (3)抗原提取:用氢作为溶剂，0.03-0.05mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5°C以下，pH控制在5.0-7.0 ； (4)抗原分离与纯化:用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶； (5)抗原浓缩:采用冰冻法进行浓缩，先将步骤(4)制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至0.85?1.65 μ g/mL,即得抗原浓缩液，-20?_4°C保存； (6)抗原包被硝酸纤维素膜:将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置20-30min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。
5.如权利要求1?3任意一项所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于:所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备方法包括如下步骤: (I)制备纳米金体系:王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为1%的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为:(97.5-98.8): (3.85-4.05)，搅拌加热煮沸，加入质量浓度为I %的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；(2)制备纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针:将上述纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至7.6-8.5，将鼠抗人IgA抗体稀释至0.3-0.75mg/ml, 12000rpm、4°C条件下离心40min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，充分混匀结合，加入与前述混合液等体积的封闭液，室温继续孵育20?28min, 14000rpm, 4°C条件下离心15?25min,去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针。
6.如权利要求1所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于所述的塑料小盒可以是多种形状的，盒盖的中央有边长约0.5?0.8cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间。
7.如权利要求6所述的一种百日咳诊断试剂盒，其特征在于所述的吸水层是由3-5层吸水垫叠放在一起组成的。
【文档编号】G01N33/544GK104198704SQ201410443710
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月2日 优先权日:2014年9月2日
【发明者】张明, 邱蕾, 钟召凤 申请人:张明