Zfp36前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体来说设及的是一种用于前列腺癌预后诊断的检测 试剂，同时还设及该用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】 前列腺癌是全球男性生殖系统最常见的恶性肿瘤疾病，对老年男性而言，其发病率在 所有恶性肿瘤中居第二位。不同国家的前列腺癌的发病率存在较大差异。美国的前列腺癌 发病率已经超越肺癌，成为发病率最高的男性恶性肿瘤。而我国的前列腺癌发病率虽然远 低于欧美国家，但近年来呈明显的上升趋势。
[0003] 当前的临床诊断中主要W前列腺特异抗原（PSA)对前列腺癌和前列腺增生进行鉴 另IJ，依据格利森（Gleason)评分来进行前列腺癌病理分级。然而，作为前列腺癌的诊断指 标，尽管PSA的敏感性较强，但其特异性不足，研究显示前列腺增生、前列腺炎、急性尿滞留 等多种疾病均可引起血浆中PSA增多。因此，开发敏感性高、特异性强、结果稳定的肿瘤标 记物是前列腺癌的诊断工作的重点研究方向。
[0004] 核转录因子（NF-KB)是免疫和炎症过程重要的调节因子，同时也是重要的肿瘤启 动子。早期肿瘤组织中存在炎症微环境，同时与肿瘤相互作用的巨瞻细胞可使NF-KB失 活。NF-KB可通过诱导IL-6JL-1和TNF-a的表达而作用于免疫系统，进而提高肿瘤细胞 生存能力并促进其增殖。
[0005]ZFP36是真核生物基因组中最丰富的一类转录因子，具有广泛的生物学功能；如 DNA识别、RNA包装、转录及转录后调控、蛋白折叠和装配及脂质结合，并参与肿瘤的形成和 机体免疫干预等。最早在1989年被发现时将其描述为由瞬时早期反应基因一ZFP36基因编 码的转录调控因子。ZFP36通过NF-KB/P65介导的两个途径参与炎症应答的调节；1)降 解细胞因子mRNA;虽然其本身无酶活性，但可通过N末端和C末端来降解多种细胞因子 的mRNA，此过程通过控制NF-KB/P65相关基因亚型的选择及转录起始来进行，并可作为 负反馈调节器参与NF-KB/p65相关的病理生理学过程，2)阻滞NF-KB/p65细胞核移位， 参与转录后调节. 研究显示ZFP36的含量在多种肿瘤组织中出现明显下降，其原因可能是在肿瘤形成过 程中，炎症细胞促进肿瘤生长，产生有利于肿瘤生长的微环境，诱发基因突变，促进血管生 成。在肿瘤微环境中，炎症细胞、炎症趋化因子、细胞因子调节肿瘤生长、转移和分化，该种 调节作用决定着肿瘤的发展方向。因此，研究肿瘤细胞差异的炎症反应调节机制，有望对前 列腺癌预后诊断提供新的辅助诊断标记物。
[0006]
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种能检测肿瘤炎症状态，用于前列腺癌预后诊断的检测 试剂。
[0008] 另一目的在于提供包含该用于前列腺癌预后诊断的检测试剂的试剂盒。
[0009] 本发明的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂，其试剂组成如下（20人份）： &〇2 1-1. 5ml 非免疫羊血清工作液 1-1. 5ml 一抗；兔源抗ZFP36多克隆抗体 2. 5-20ul 二抗；生物素标记的羊抗兔的IgG工作液 1ml链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液 1ml DAB显色剂 2-3ml 本发明的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态的检测试剂。
[0010] 本试剂盒使用方法如下： (1) 将经拷片脱蜡、水化和抗原修复后的切片置于解育盒中，用阻水笔把组织圈住，W 免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，加&化50ul覆盖组织后 室温解育30min，W阻断内源性过氧化物酶的活性； (2) 磯酸盐缓冲液（PBS)冲洗3min，重复3次； (3) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul非免疫羊血清工作液，室温下解育15 分钟； (4) 轻轻甩去血清，不漂洗，滴加50ul-抗（2mg/ml兔源抗ZFP36多克隆抗体XZFP36 抗体：PBS=1:100)，室温下解育60分钟或4°C过夜； (5) PBS冲洗5min，重复3次； (6) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul二抗；生物素标记的羊抗兔的IgG工 作液，室温下解育20分钟； (7) PBS冲洗5min，重复3次； (8) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物 酶溶液，室温下解育15分钟； (9) PBS冲洗3min，重复3次； (10) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加lOOul新鲜配制的DAB显色剂（20XDAB缓 冲液、20XDAB底物、20XDAB色原各50ml滴加至850ml双蒸水中配制成1ml新鲜显色液， 有效使用时间为30min)显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片； (11) 免疫组织化学检测结果判断结果判定标准；Leica巧光显微镜下，每张切片随机 选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞质和(或）细胞核出现栋黄或栋褐色颗粒为阳性细胞， 根据阳性细胞染色强度W及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度 评分；无色为0分，淡黄色为1分，栋黄色为2分，栋褐色为3分；然后按阳性细胞率评分；月中 瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率《10%为1分，11 %~50%为2分，51 %~75% 为3分，> 75%为4分.两者积分的乘积作为染色结果的评判标准；0定为-，阴性；1~4 分为+，弱阳性；5~8分为++，阳性；9~12分为+++，强阳性。
[0011] 本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从W上技术方案可知；本发明采用 ZFP36作为检测前列腺癌肿瘤炎症状态的生物标记物，弥补了PSA诊断特异性不足的缺点， 为前列腺癌的诊断及前列腺癌患者术后复发转移率，术后复发转移时间和生存时间的预测 提供了一种切实可行的方法。
[0012]
【附图说明】
[0013] 图1 ;ZFP36表达与生化复发生存率的关系。
[0014] 图2 ;ZFP36表达与总体生存率的关系。
[00巧]图3 ;PS刺激Dul45、LNCap细胞后ZFP36的表达情况。
[001引图4 ;大鼠炎症模型中前列腺癌细胞ZFP36的表达情况。
[0017] 图5 ;前列腺癌组织与癌旁组织中ZFP36的表达情况。
[0018]
【具体实施方式】
[0019] W下通过实验例来进一步证实本发明的有益效果。
[0020] 实验例：指示前列腺癌的肿瘤炎症状态的标记物的选择实验 一；生物信息学数据挖掘 1.利用基因巧片微列阵数据集（Taylordataset),采用SPSS13.0对150例前列腺癌 组织进行ZFP36表达水平巧片数据分析，结果发现ZFP36的表达量同血清PSA(P< 0.001)， Gleason评分（P< 0. 001)，病理分期（P= 0. 016)，转移（P< 0.001)及生化复发（P< 0. 001)显著相关，即血清PSA低，Gleason评分低，病理分期低，无转移，无生化复发的患者 体内ZFP36表达量更高(见表1)。因此，研究表明，ZFP36参与了前列腺癌复杂的演进过程， 可作为前列腺癌炎症状态判断的分子标记物。
【主权项】
1. 一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂，其试剂组成如下（20人份）： H2O2 1-1. 5ml 非免疫羊血清工作液 1-1. 5ml 一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体 2. 5-20ul 二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液 Iml 链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液 Iml 二氨基联苯胺显色剂 2-3ml。
2. 如权利要求1所述的用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态 的检测试剂。
3. -种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒使用方法如下： (1) 将经拷片脱蜡、水化和抗原修复后的切片置于孵育盒中，用阻水笔把组织圈住，以 免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，加H 2O2 50ul覆盖组织后 室温孵育30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性； (2) 磷酸盐缓冲液冲洗3min，重复3次； (3) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul非免疫羊血清工作液，室温下孵育15 分钟； (4) 轻轻甩去血清，不漂洗，滴加50ul -抗（2mg/ml兔源抗ZFP36多克隆抗体)(ZFP36 抗体：PBS =1:100)，室温下孵育60分钟或4°C过夜； (5) PBS冲洗5min，重复3次； (6) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加50ul二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工 作液，室温下孵育20分钟； (7) PBS冲洗5min，重复3次； (8) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，每张切片滴加50ul链霉菌抗生物素-过氧化物 酶溶液，室温下孵育15分钟； (9) PBS冲洗3min，重复3次； (10) 吸水纸将切片上的PBS液稍吸去，滴加IOOul新鲜配制的二氨基联苯胺显色剂 (20 X DAB缓冲液、20 X DAB底物、20 X DAB色原各50ml滴加至850ml双蒸水中配制成Iml新 鲜显色液，有效使用时间为30min)显色，自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片； (11) 免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机 选取五个高倍镜视野观察细胞，细胞质和(或）细胞核出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞， 根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果。按染色强度 评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：月中 瘤细胞内无阳性染色者为〇分，阳性细胞率< 10%为1分，11 %~50%为2分，51 %~75% 为3分，> 75%为4分.两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1~4 分为+，弱阳性；5~8分为++，阳性；9~12分为+++，强阳性。
【专利摘要】本发明公开了一种用于前列腺癌预后诊断的检测试剂及其试剂盒，其试剂组成如下(20人份)：H2O21-1.5ml、非免疫羊血清工作液1-1.5ml、一抗：兔源抗ZFP36多克隆抗体2.5-20ul、二抗：生物素标记的羊抗兔的IgG工作液1ml、链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液1ml、DAB显色剂2-3ml。本用于前列腺癌预后诊断的检测试剂盒，包含检测肿瘤炎症状态的检测试剂。本发明能检测肿瘤炎症状态，为前列腺癌的诊断及前列腺癌患者术后复发转移率，术后复发转移时间和生存时间的预测提供了一种切实可行的方法。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104880565
【申请号】CN201510220797
【发明人】朱建国, 袁东波, 张伟
【申请人】贵州省人民医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月4日