结肠癌诊断试剂、试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于肿瘤分子生物学【技术领域】，具体涉及一种结肠癌诊断试剂、试剂盒。本发明的目的是为结肠癌的诊断提供一种新选择。本发明的技术方案是结肠癌诊断试剂，包括检测斯钙素蛋白2的试剂。本发明还提供了结肠癌诊断试剂盒，包括检测斯钙素蛋白2的试剂。本发明还提供了治疗结肠癌的药物，主要活性成分为斯钙素蛋白2表达抑制剂。本发明为结肠癌的治疗和诊断提供了一种新选择。
【专利说明】结肠癌诊断试剂、试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学【技术领域】，具体涉及一种结肠癌诊断试剂、试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结肠癌是指结肠粘膜上皮在外界环境或自身遗传因素等多种诱因下发生的恶性 病变，是全世界发病率处于第三位的常见恶性肿瘤。当结肠癌细胞发生转移或扩散以后，患 者五年生存率小于百分之十[1]。抑癌基因和原癌基因的突变是导致上皮细胞发生癌变的重 要因素之一：已经有报道证明RAS和BRAF激酶的突变导致结肠癌细胞获得更强的侵袭能力
[2] ，而抑癌基因APC的突变则导致转录调节因子-catenin大量积累在细胞核，最终诱导 细胞发生EMT[3]。不过，结肠癌细胞具体如何影响正常结肠上皮细胞，它们在肿瘤微环境中 的相互作用方式以及如何整体调控生物个体癌变过程的机制尚不清楚。
[0003] 目前结肠癌的治疗仍以根治性手术为主，但因结肠癌转移后的化疗效果差，术后 约有20-40%的患者出现复发。因此，结肠癌的早期筛查与早期诊断对于结肠癌的防治非常 重要，并且发展有效监控结肠癌的复发转移试剂、试剂盒以及研发新的结肠癌靶向治疗药 物是急需解决的重要课题和国民健康的重大需求。
[0004] 斯钙素蛋白2,即Stanniocalcin-2(STC-2)是一个33kD，由302个氨基酸组成的 蛋白。近年来，STC2发现与许多肿瘤的发展进程密切相关，在很多病理学研宄中被认为是 肿瘤的分子标志物。与正常胃粘膜组织相比，胃癌组织中STC2的表达量明显升高，同时具 有淋巴结转移和侵入血管能力的肿瘤细胞，STC2的表达量最高[4]。在乳腺癌发展过程中， STC2作为维甲酸信号通路的靶标而被激活[5]。在结肠癌中，STC2是潜在的肿瘤预后标志 物，STC2高表达常常与肿瘤淋巴转移、淋巴结侵袭和患者生存率较低相关[6]。而在肾癌组织 中发现，STC2在RNA和蛋白水平均显著增高导致患者生存率很低。正常肾脏组织中，STC2 主要表达于远曲小管和肾小球，在肾癌中则主要表达于肾癌细胞质和肾癌细胞膜[3]。综合 以上研宄结果发现，STC2与多种癌症的发展过程相关，是很好的肿瘤诊断及治疗的分子标 志物。但是对于STC2具体如何调节肿瘤开关，及其所涉及到的信号通路研宄却仍然不多。 虽然Law等人报道了STC2可以通过激活ERK信号通路来诱导细胞发生上皮间质转化过程 (EMT)[1]，但是对于该通路中其他重要节点分子具体如何变化，以及是否存在其他信号通路 与ERK信号通路一起调控细胞发生EMT并未做深入研宄。我们之前利用SILAC蛋白定量技 术发现，在模拟的肿瘤微环境系统中，STC2的分泌量会发生改变。这个结果说明STC2参与 了肿瘤发展进程，在上皮细胞与肿瘤细胞相互影响的过程中扮演了重要角色。到目前为止， 未见STC2和结肠癌关系的报道。未见通过检测STC2表达水平及分泌水平来实现结肠癌的 诊断试剂及试剂盒的相关报道，也未见通过降低其表达水平来达到治疗结肠癌的目的的报 道。
[0005] 本领域目前需要提供新的结肠癌的诊断尤其是转移诊断、药物疗效监测的检测产 品以及防治药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为结肠癌的诊断提供一种新选择。
[0007] 本发明的技术方案是结肠癌诊断试剂，包括检测斯钙素蛋白2的试剂。
[0008] 进一步的，所述的检测斯钙素蛋白2的试剂包括斯钙素蛋白2的多克隆抗体或单 克隆抗体。
[0009] 本发明还提供了结肠癌诊断试剂盒，包括检测斯钙素蛋白2的试剂。
[0010] 进一步的，所述的检测斯钙素蛋白2的试剂包括斯钙素蛋白2的多克隆抗体或单 克隆抗体。
[0011] 本发明还提供了治疗结肠癌的药物，主要活性成分为斯钙素蛋白2表达抑制剂。
[0012] 具体的，所述的抑制剂为斯钙素蛋白2拮抗剂、斯钙素蛋白2多克隆抗体或斯钙素 蛋白2单克隆抗体。
[0013] 具体的，所述的抑制剂为斯钙素蛋白2的shRNA分子或者shRNA质粒。
[0014] 此外，本发明提供了斯钙素蛋白2的多克隆抗体、单克隆抗体、shRNA质粒或shRNA 分子在制备结肠癌诊断试剂中的用途。本发明也提供了斯钙素蛋白2的多克隆抗体、单克 隆抗体、shRNA质粒或shRNA分子在制备预防和治疗结肠癌的药物中的用途。
[0015] 其中，上述多克隆抗体可为SantaCruzBiotechnology,INC.(SantaCruz公司，） 的货号为sc-14352的多克隆抗体。上述的STC2shRNA质粒可为SantaCruz公司的货号为 sc-44127-SH的shRNA质粒。
[0016] 本发明还提供了筛选所述药物的方法，包括以下步骤：
[0017] a、建立结肠癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组；
[0018] b、用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中可检测斯钙素蛋白2蛋 白的蛋白表达水平；
[0019] c、将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中可检测斯钙素蛋白2蛋白的 蛋白表达水平含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
[0020] 本发明的有益效果：本发明结肠癌诊断试剂可以在结肠癌早期及转移时期有效诊 断结肠癌疾病，大大提高了患者的复发的检出率；本发明结肠癌诊断试剂只需要少量结肠 癌组织及患者血清样本即可进行有效诊断，避免了给患者造成的伤害；有利于医生选择适 合的药物及方法对患者进行针对性治疗。本发明防治结肠癌疾病的药物，为临床结肠癌疾 病用药提供了一种新的选择。本发明筛选防治结肠癌疾病的药物的方法，为寻找防治结肠 癌疾病的药物提供了一种新的途径，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1、EMT细胞模型的建立。
[0022] 图2、上皮细胞（NCM460)与EMT模型细胞STC2分泌水平比较。ELISA结果显示， EMT模型细胞相较于普通NCM460会分泌更多的STC-2蛋白。
[0023] 图3、ELISA检测上皮细胞（NCM460)与EMT模型细胞STC2和DAP1分泌。ERK磷 酸化抑制剂U0126孵育EMT模型细胞后，STC-2的表达量有所降低。
[0024] 图4、免疫组化实验对比分析STC2蛋白在结肠癌和癌旁组织间的差异表达情况。
[0025] 图5、ELISA实验分析结肠癌患者外周血中STC2的表达情况。
[0026] 图6、MTT分析STC-2干扰后HT29细胞活性变化情况。
【具体实施方式】
[0027] 本发明的建立是基于对结肠癌发生发展相关蛋白的研宄，通过对45例病人的研 宄，分析鉴定出结肠癌相关蛋白斯钙素蛋白2。
[0028] 本发明还进一步应用免疫组织化学技术研宄斯钙素蛋白2蛋白在结肠癌组织中 的表达，功能研宄提示与结肠癌密切相关的钙素蛋白2结肠癌蛋白能应用于临床诊断、预 后判断及药物开发中。
[0029] 在上述大量的开创性研宄的基础上，可将上述钙素蛋白2结肠癌蛋白作为检测目 标的结肠癌诊断试剂及试剂盒；同时可以上述钙素蛋白2结肠癌蛋白作为靶标的筛选治疗 结肠癌药物的方法；还发明了能防治结肠癌的药物，以及现有的一些物质在制备防治结肠 癌的药物中的用途。比如：能拮抗钙素蛋白2结肠癌蛋白的分子，比如其单克隆抗体或者多 克隆抗体，如STC-2多克隆抗体（sc-14352);以及得到防治效果好的shRNA分子和能表达 钙素蛋白2结肠癌的shRNA分子的质粒（sc-44127-SH)。
[0030] 下述实施例中所使用的实验材料：
[0031] 细胞株和临床病理样本：
[0032] 人源性正常结肠粘膜上皮细胞系NCM460及人源性结肠上皮癌细胞系HT29:源自 ATCC，购于中国科学院细胞库。
[0033] 结肠癌患者外周血液样本：结肠癌早期（甲胎蛋白和胚癌抗原低表达）、中期（甲 胎蛋白和胚癌抗原中等水平表达）、晚期（甲胎蛋白和胚癌抗原高表达）患者外周血液样本 各10例，均由四川大学华西医院肿瘤科提供，病人血液样品收集经过了华西医院医学伦理 委员会审批，样本提供者签署知情同意书。
[0034] 结肠癌及癌旁组织切片：8例结肠癌及自体癌旁组织病理切片由成都市第三人民 医院肿瘤科提供，病理组织收集经过了成都市第三人民医院医学伦理委员会审批，样本提 供者签署知情同意书。
[0035] 细胞培养液：DMEM、RPMI-1640购自GibcoBRL;胎牛血清（FBS)、消化液胰酶 (Trypsin)购自GibcoBRL。
[0036] 相关抗体及生物试剂：
[0037] 羊抗人STC2多克隆抗体购自Santa Cruz公司，货号sc-14352 ;
[0038] 鼠抗人0 -actin抗体：购自博士德生物科技公司；
[0039]STC2shRNA质粒购自Santa Cruz公司，货号sc-44127-SH ;
[0040] 辣根过氧化物酶（HRP)标记羊抗小鼠IgG、兔抗羊IgG:购自北京中衫金桥生物技 术有限公司；
[0041] DAPI染色液（C1005):购自碧云天生物技术有限公司；
[0042]STC2蛋白ELISA检测试剂盒购自Uscn公司；
[0043]FUGENEHD购自罗氏公司；
[0044] 佛波酯（PMA)诱导剂购自Sigma公司。
[0045] 实施例1体外实验检测STC2与结肠癌的关系
[0046] 1细胞培养及EMT模型建立
[0047]NCM460细胞用含有10%FBS的DMEM完全培养液于37°C，5% 0)2培养箱中培养。 待细胞生长至培养皿50%密度时，以100ng/mL的浓度添加PMA诱导细胞，处理时间为24小 时。细胞分瓶后按上述方法连续刺激细胞约八代左右使细胞获得EMT表形。
[0048] 佛波酯（PMA)是一类能促进肿瘤生长的有机化合物。由于其作为二酰甘油的类似 物，可以激活蛋白激酶C，因此在佛波酯的连续刺激下，最终将导致细胞的恶性转变。
[0049] 基于以上原理，前期分别使用不同浓度（50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL) PMA作用正常结肠上皮细胞NCM460,最后确定以100ng/mL作为实验浓度。细胞传代并贴壁 后，以100ng/mL浓度加入PMA作用NCM460细胞24小时，刺激结束后弃去处理液，用PBS洗 涤两次，加入新鲜普通培养基继续培养细胞至长满85 %左右，消化细胞并传代。每隔3天按 上述方法处理细胞，每天观察记录细胞生长及形态变化。
[0050] 2细胞免疫荧光分析
[0051] (1)将细胞以适当数量接种到铺有盖玻片的24孔板中。
[0052] (2)多聚甲醛37°C固定细胞30min，TBST洗涤细胞两次，使用1. 5%的BSA在室温 封闭lh。
[0053] (3)每一组盖玻片滴加50y1山羊抗人STC-2多克隆抗体（体积比1:100)，4°C孵 育过夜。
[0054] (4)次日，TBST洗涤载玻片三次，加入CY3标记的荧光二抗，37°C孵育lh。
[0055] (5)加入DAPI进行细胞核染色，最后将盖玻片置于荧光显微镜下进行观察。
[0056] 3ELISA
[0057] (1)用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH9. 6)溶解抗原，使抗原浓度为10?20yg/ mL，加100yL/孔到96孔酶标板，4°C放置过夜。
[0058] (2)第二天弃去包被液后，用PBST(磷酸盐吐温缓冲液）洗涤3次，每孔加入 150yL1%BSA37〇C
[0059] 封闭1小时。
[0060] (3)PBST洗涤3次后，每孔加入100yL不同倍比稀释度的特异性抗体，并加入对照 样品，37°C孵育2小时。
[0061] (4)PBST洗涤5次后，加入lOOyL稀释后的HRP标记的二抗，37°C孵育1小时。
[0062] (5)PBST洗涤5次后，显色剂（TMB)显色15?20min，使用浓盐酸终止反应，酶标 仪上读取A405吸收值。
[0063] 4结果及分析
[0064]EMT细胞诱导结果如图1。PMA连续作用NCM460细胞后，细胞形态出现显著变化。 NCM460细胞形态由原来的椭圆形变成纺锤状，并且细胞间的连接也不再紧密，成疏松状态， 形态学上具有了间质细胞的特征（图1)。比较STC2蛋白在普通NCM460与EMT模型培养 基上清中的含量。ELISA结果显示，EMT模型细胞相较于普通NCM460会分泌更多的STC-2 蛋白（图2)。免疫荧光结果显示普通NCM460中STC-2的表达量较低，而在EMT模型细胞 中STC-2表达量有所增加，这与之前ELISA检测培养基上清中STC-2表达趋势相一致，加入 ERK磷酸化抑制剂U0126孵育EMT模型细胞后，STC-2的表达量有所降低（图3)。
[0065] 实施例2临床病理实验检测STC2与结肠癌的关系
[0066] 为了检测体外细胞实验结果是否与临床病理研宄相一致，收集了结肠癌组织切片 和结肠癌患者外周血。分别通过免疫组化和ELISA实验，研宄STC2与结肠癌之间病理学的 关系。
[0067] 1免疫组化分析
[0068] 1.1载玻片的处理
[0069] (1)洗衣粉液浸泡2h，自来水冲洗干净，蒸馏水洗净2次，晾干；
[0070] (2)硫酸洗液浸泡24h，自来水冲洗干净，蒸馏水洗净2次，晾干；
[0071] (3) 2 %APES(3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）（APES:丙酮体积比=1:50)硅化10? 20秒（不能用塑料容器及塑料切片架）；
[0072] (4)过纯丙酮I约10秒，过纯丙酮II约5秒（不能用塑料容器及塑料切片架）；
[0073] ⑶晾干备用。
[0074] 1. 2组织处理及切片
[0075] (1)取人癌旁结肠组织及癌症组织切成小块，厚度不超过5mm，做好标记，用4%中 性福尔马林固定24h以上；再用自来水冲洗过夜；
[0076] (2)过梯度酒精：75%酒精，1次，lh;85%酒精，1次，lh;95%酒精，1次，lh;100% 酒精，2次，每次30min;
[0077] (3)二甲苯，2次，每次30min ;
[0078](4)石蜡浸泡，3次，每次30min ;
[0079](5)包埋组织；
[0080] (6)将石蜡包埋的组织在切片机切片，厚度为3?5ym。
[0081]2. 3免疫组化染色
[0082] (1)石蜡切片脱蜡：将石蜡切片置于65°C孵箱中加热2h，迅速置于二甲苯I脱蜡 151^11;再置于二甲苯11脱蜡151^11;分别用100%、95%、80%、70%酒精处理各21^11 ;蒸馏 水洗绦2次，每次5min。
[0083] (2)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H202，室温避光处理lOmin，再用蒸馏水 洗2次，每次5min。
[0084] ⑶抗原修复：将切片置于抗原修复液（10mM柠檬酸钠缓冲液，pH6. 0)中，煮沸后 高压加热5min进行抗原修复；自然冷却至室温，PBS洗片2次，每次5min。
[0085] (4)正常血清封闭：取出切片，用滤纸吸去切片背面水分及切片正面组织周围水 分（保持组织呈湿润状态），滴加正常山羊血清（与第二抗体同源动物血清），37°C孵育 15min;PBS洗片 2 次，每次 5min。
[0086](5) -抗孵育：用滤纸吸多余血清，直接滴加山羊抗人STC-2多克隆抗体（1:100)， 4°C过夜孵育；PBS洗片2次，每次5min。
[0087] (6)二抗孵育：滴加生物素标记的兔抗山羊第二抗体（1:100)，37°〇孵育4〇1^11 ; PBS洗片2次，每次5min。
[0088] (7)三抗孵育：滴加酶标链亲和素复合物（SAB复合物1:100) 37°C孵育40min;PBS 洗片2次，每次5min。
[0089] (8)DAB显色：滤纸吸去切片周围液体，滴加新鲜配制DAB工作液（DAB贮存液 (25mg/mL)20yL+PBSlmL+3%H2025yL)显色，镜下观察，适时用自来水终止显色。
[0090] (9)苏木素复染：室温lOsec，自来水冲洗返蓝15min。
[0091] (10)梯度酒精脱水：80%酒精，2min;95%酒精，2min;100%酒精，2次，每次 5min〇
[0092] (11)用中性树胶封片，光镜下观察。
[0093] 2ELISA(与实施例1中相同）
[0094] 3结果与分析
[0095] 通过免疫组化实验对比分析STC2蛋白在结肠癌和癌旁组织间的差异表达情况 (图4)。结果发现，在结肠癌组织中，STC2的表达量明显高于癌旁组织，由于STC2蛋白是分 泌蛋白，从图4中可以看到除了大部分胞浆和胞膜呈阳性以外，细胞间质部分也有STC2的 存在。而在癌旁组织中，胞浆几乎没有被着色，只有少部分细胞间质呈现出阳性反应。因此 可以推测，在结肠癌发病过程中，细胞会加速STC2的生成，并大量通过分泌途径使蛋白进 入到组织间隙中行使功能。
[0096] 由于STC2可以分泌入血，因此分别收集了早期、中期和晚期结肠癌患者外周血各 10例，分别比较STC2蛋白在它们之间含量的不同（图5)。
[0097] 实验结果显示，STC2在晚期结肠癌患者外周血中含量最高，在36例血样中的平均 浓度为902±68 (pg/mL)，而在23例中期患者血样中的平均浓度为1174±64 (pg/mL)，在早 期患者血样中浓度最低，在25例晚期病人血样中的平均浓度为1292. 7753±673(pg/mL)。 这个结果说明STC2的表达水平及分泌情况与肿瘤的分级相关。肿瘤恶性程度越高，且处于 癌症晚期时，STC2大量表达。结合前期体外实验可以推测，此时肿瘤细胞具有最大的转移 潜能。
[0098] 实施例3STC2干扰抑制结肠癌细胞活性
[0099] 为了检测抑制STC2表达能起到抗癌作用，通过在HT29细胞模型中转染STC2shRNA 质粒，观察其抗细胞活性作用。
[0100] 1、MTT检测：
[0101] (1)使用FUGENEHD转染shRNA。转染前一天，1X104细胞接种在96孔板上，100y1 含FBS的基础培养基。
[0102] (2)选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到40%。
[0103] (3)按照如下的方法准备shRNA-FUGENEHD复合物：
[0104] a.分别以50y1Opti-MEM?I稀释3y1FUGENEHD，共4管轻轻混勾，室温下孵 育5分钟。
[0105] b.分别以 50y1Opti-MEM?I稀释 2ygshRNA，管号分别标记为NC,STC2-shRNA 轻轻混匀。
[0106] c.孵育5分钟后，混合稀释的shRNA和稀释的FUGENEHD，轻轻混合，在室温下孵 育15分钟，以便允许复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。
[0107] (4)将shRNA-FUGENEHD复合物分别加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通 过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0108] (5)37°C，C02培养箱孵育24小时进行MTT检测。
[0109] (6)将 5XMTT用DilutionBuffer稀释成 1XMTT。
[0110] (7)每孔加50yL1XMTT，在37°C孵育4小时，使MTT还原为甲月赞。
[0111] (8)吸出上清液，每孔加150yLDMS0使甲月赞溶解，用平板摇床摇匀。
[0112] (9)酶标仪在570nm波长处检测每孔的光密度。
[0113] 2、结果与描述
[0114] 通过MTT结果显示，干扰结肠癌细胞系HT29中STC2的表达能有效的抑制肿瘤细 胞活性（图6)。该结果说明如果能够抑制STC2的表达则能有效的起到抗肿瘤治疗的效果。 而多克隆抗体、单克隆抗体、shRNA质粒或shRNA分子均具有制备治疗结肠癌的药物前景。 参考文献
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【权利要求】
1. 结肠癌诊断试剂，其特征在于：包括检测斯钙素蛋白2的试剂。
2. 如权利要求1所述的结肠癌诊断试剂，其特征在于：所述的检测斯钙素蛋白2的试 剂包括斯钙素蛋白2的多克隆抗体或单克隆抗体。
3. 结肠癌诊断试剂盒，其特征在于：包括检测斯钙素蛋白2的试剂。
4. 如权利要求4所述的结肠癌诊断试剂盒，其特征在于：所述的检测斯钙素蛋白2的 试剂包括斯钙素蛋白2的多克隆抗体或单克隆抗体。
5. 治疗结肠癌的药物，其特征在于：主要活性成分为斯钙素蛋白2表达抑制剂。
6. 如权利要求7所述的治疗结肠癌的药物，其特征在于：所述的斯钙素蛋白2表达抑 制剂为斯钙素蛋白2拮抗剂、斯钙素蛋白2的多克隆抗体或者斯钙素蛋白2的单克隆抗体。
7. 如权利要求7所述的治疗结肠癌的药物，其特征在于：所述的斯钙素蛋白2表达抑 制剂为斯钙素蛋白2的shRNA干扰质粒或shRNA干扰分子。
8. 斯1?素蛋白2的多克隆抗体、单克隆抗体、shRNA质粒或shRNA分子在制备结肠癌诊 断试剂中的用途。
9. 斯钙素蛋白2的多克隆抗体、单克隆抗体、shRNA质粒或shRNA分子在制备防治结肠 癌的药物中的用途。
10. 筛选权利要求5?7任一项所述药物的方法，其特征在于：包括以下步骤： a、 建立结肠癌的细胞模型或动物模型的模型组，并设立正常对照组； b、 用待筛选药物按剂量梯度作用于模型组，然后检测其中可检测斯钙素蛋白2蛋白的 蛋白表达水平； c、 将检测结果与正常对照组进行比较，能使模型组中可检测斯钙素蛋白2蛋白的蛋白 表达水平含量显著趋近正常对照组的待筛选药物即被筛中。
【文档编号】G01N33/68GK104459151SQ201410696244
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】梁淑芳, 袁琼, 赵霞 申请人:四川大学